一種與玉米光周期敏感性主效qtl連鎖的分子標記及其應用的製作方法
2023-06-13 14:57:56 2
一種與玉米光周期敏感性主效qtl連鎖的分子標記及其應用的製作方法
【專利摘要】一種與玉米光周期敏感性主效QTL連鎖的分子標記，提供兩個與玉米光周期敏感性主效基因緊密連鎖的SSR分子標記SSR119和分子標記SSR1336，以及擴增分子標記SSR119和SSR1336的引物對；所述的與玉米光周期敏感性的主效QTL連鎖的分子標記判斷玉米光周期敏感性的方法為，以玉米總DNA為模板，用分子標記SSR119的引物和分子標記SSR1336的引物序列進行PCR擴增，擴增產物經凝膠電泳檢測，判斷產物中是否具有與分子標記SSR119和SSR1336相同的目的條帶，從而判斷玉米是否具有玉米光周期敏感性基因，進而判斷其光周期敏感性的大小；本發明的分子標記，可用於對玉米光周期敏感性進行遺傳結構分析、遺傳圖譜構建、基因定位、構建近等基因系、分子標記輔助選擇育種。
【專利說明】—種與玉米光周期敏感性主效QTL連鎖的分子標記及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種分子標記，具體的說是一種與玉米光周期敏感性主效QTL連鎖的分子標記及其應用。
【背景技術】
[0002]熱帶玉米具有廣泛的遺傳基礎，在植株性狀、果穗性狀、抗逆等方面存在豐富的遺傳多樣性，且與溫帶種質的交流很少，是溫帶地區玉米育種不可多得的異源種質。熱帶玉米種質的利用無疑將為溫帶地區的玉米育種注入新的活力。然而，熱帶玉米具有很強的光周期敏感性，嚴重限制了熱帶玉米在溫帶地區利用。
[0003]光周期現象是自然界普遍存在的現象，光周期影響高等植物開花的分子機制是目前發育生物學研究的熱點和難點。迄今為止，玉米光周期敏感性的遺傳特點及分子機制研究方面已取得了一些進展，但與擬南芥和水稻相比仍然存在的很大的差距，特別對光周期敏感性的分子機理研究方面知之甚少。現代生物技術的發展使人們克隆了一些玉米開花時間基因:VGT1、Dwarf8、ZFL1、ZFL2、EMF-L i ke、CK2a、ZmLD、PhyA、PhyB、CO-1 i ke 等，並初步研究它們的功能，這將為解釋玉米光周期敏感性的分子機制提供重要的參考。然而，光周期反應是由參與花啟動的發育控制，生物鐘調控及光受體信號轉導的基因間相互作用完成的，表現數量性狀的遺傳特點，這就使得光周期敏感性的分子遺傳解析十分困難。
[0004]隨著DNA分子 標記技術的發展，藉助高密度的分子連鎖圖譜，使數量性狀基因定位工作發展很快。近年來，國內外學者利用RFLP、AFLP、SSR等分子標記技術，對控制玉米開花時間Q TL定位做了大量研究，定位了一些主效QTL (Salvi et al.2002 ；Koester etal.1993 ； Vladutu et al.1999 ； Chardon et al., 2005)。本課題組在國內較早的開展了熱帶玉米光周期敏感性基因定位的研究，分別以由光周期鈍感的溫帶自交系黃早4和對光周期敏感的熱帶自交系CML288為親本配置的溫熱組合黃早4XCML288衍生的F2及F2:3家系、F6:7代家系、重組自交系和永久F2群體為材料，對光周期敏感性及相關性狀進行了定位，結果表明，控制玉米光周期敏感性的位點與長日照環境下光周期敏感相關性狀的QTL都集中在第1，4，6，8，9和第10染色體上，其中第10染色體的10.04區域效應最大且最穩定；控制短日照環境下光周期敏感相關性狀的QTL集中在第3，7和第9染色體上，其中第3染色體的3.05區域效應最穩定。推斷推測CCAl基因可能是10.04區間光周期敏感性主效QTL的候選基因(Wanget al.，2008)。母貴琴(2007)以自交系鄭58 (光周期不敏感型)和自交系Ya8701 (光周期敏感型)為親本配製的組合衍生的F2和F2:3為材料，開展了玉米光周期敏感相關性狀的QTL定位研究，檢測到的QTL在染色體上分布不均勻，有成簇分布的特點，尤其是10染色體(binl0.04)上分布密集，部分位點同時作用於各個性狀，推測檢測到的QTL可能與osSOCI，osCCAI/LHY, osPHYC, osZTL等生物鐘組成基因相關。
[0005]不同的研究者利用不同的材料、不同的世代群體、在不同的環境中均在10.04區域檢測到了光周期敏感性及相關性狀的主效QTL (Moutiq et al.,2002 ;母貴琴，2007 ；ffanget al.，2008)，這些相同的結果印證了這一區域可能包含重要的光周期反應因子，決定長日照環境下的莖尖分生組織從營養生長向生殖生長的轉化，進而影響開花時間、株高和葉片數等相關性狀。
[0006]因此對熱帶玉米光周期敏感性基因進行精細定位，研究其遺傳機制和分子機理，開發與光周期敏感性QTL緊密連鎖的分子標記，不但有利於我國玉米種質的擴增與創新，有利於提高玉米品種對不同地理緯度和播種季節的適應性，而且可以為分子標記輔助選擇及圖位克隆光周期敏感性基因奠定基礎。
【發明內容】
[0007]本發明目的是為解決上述技術問題的不足，提供一種與玉米光周期敏感性主效QTL連鎖的分子標記，對玉米光周期敏感性主效QTL進行精細定位，把目標基因限定在一個較小的範圍，篩選到與玉米光周期敏感性主效QTL緊密連鎖費分子標記，用於對熱帶玉米光周期敏感性的篩選鑑定和分子標記輔助選擇育種，從而提高熱帶玉米種質的利用效率。
[0008]本發明的目的是提供兩個與玉米光周期敏感性主效基因緊密連鎖的SSR分子標記SSRl 19和分子標記SSR1336，該分子標記的核苷酸序列分別為SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2 ；
本發明提供了擴增與玉米光周期敏感性主效基因緊密連鎖的分子標記SSR119和SSRl336的引物對；
分子標記SSRl 19的引物序列為:
Fl:5 ; - TACCGA AGACGGCGACG -3 ;；
Rl:5 ; - ATGAACCCCAACTTTGCTGA -3 ;；
分子標記SSRl336的引物序列為:
F2:5 ; -ACAAGAAGGGCACGAGATGAATG -3 ;；
R2:5 ; -CTCTACAGCACCACCGACCAAG -3 ;。
[0009]所述的調控玉米光周期敏感性的主效QTL緊密連鎖的分子標記的方法，包括以下步驟:以玉米總DNA為模板，用分子標記SSR119的引物和分子標記SSR1336的引物序列進行PCR擴增，擴增產物經凝膠電泳檢測，判斷產物中是否具有與分子標記SSRl 19和SSR1336相同的目的條帶，從而判斷玉米是否具有玉米光周期敏感性基因，進而判斷其光周期敏感性的大小。
[0010]所述的與玉米光周期敏感性主效QTL緊密連鎖的分子標記，用於對玉米光周期敏感性進行遺傳結構分析、遺傳圖譜構建、基因定位、構建近等基因系、分子標記輔助選擇育種。
[0011]有益效果是:
I本研究小組在初步定位的基礎上，選育玉米光周期敏感性主效QTL qDPSlO的近等基因系，構建大規模定位群體，同時開發標記,對玉米光周期敏感性主效QTL進行精細定位，旨在把目標基因限定在一個較小的範圍，篩選到與玉米光周期敏感性主效QTL緊密連鎖費分子標記，用於對熱帶玉米光周期敏感性的篩選鑑定和分子標記輔助選擇育種，從而提高熱帶玉米種質的利用效率。
[0012]2、本發明公開了一種引物對以及與玉米光周期敏感性基因緊密連鎖的分子標記。利用本發明的引物對，以玉米基因組DNA為模板進行PCR擴增，可以得到與玉米光周期敏感性基因緊密連鎖的分子標記，該標記在本發明中命名為SSR119和SSR1336。分析表明該標記的有無直接關係到玉米光周期敏感性的大小，能夠用於不同玉米種質的光周期敏感性的預測。該分子標記結構簡明，使用方便，且利用PCR技術檢測快速高效，在短時間內能夠精確鑑定不同來源的親本玉米自交系，效果快捷明顯，有良好的推廣前景。本領域技術人員可以理解，除了通過上述PCR擴增方法獲得本發明的分子標記外，還可以通過化學合成獲得本發明的分子標記。在玉米育種和資源鑑定或對不同玉米材料光周期敏感性的早期預測和篩選中，該分子標記能克服環境影響，對種植材料的早代篩選，淘汰對光周期具有敏感性不適應溫帶環境的的植株，提高育種和選擇效率。將其應用於玉米光周期敏感性的鑑定中，能對不同種質材料的光周期反應進行預測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1是本發明與玉米光周期敏感性主效基因緊密連鎖的SSR分子標記SSR119標記的電泳帶型圖；
圖2是本發明與玉米光周期敏感性主效基因緊密連鎖的SSR分子標記SSR1336標記的電泳帶型圖。 【具體實施方式】
[0014]提供一種與玉米光周期敏感性主效QTL連鎖的分子標記，對玉米光周期敏感性主效QTL進行精細定位，把目標基因限定在一個較小的範圍，篩選到與玉米光周期敏感性主效QTL緊密連鎖費分子標記，用於對熱帶玉米光周期敏感性的篩選鑑定和分子標記輔助選擇育種，從而提高熱帶玉米種質的利用效率。
[0015]本發明提供兩個與玉米光周期敏感性主效基因緊密連鎖的SSR分子標記SSR119和分子標記SSR1336，該分子標記的核苷酸序列分別為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2 ；
本發明提供了擴增與玉米光周期敏感性主效基因緊密連鎖的分子標記SSR119和SSRl336的引物對；
分子標記SSRl 19的引物序列為:
Fl:5 ; - TACCGAAGACGGCGACG -3 ;；
Rl:5 ; - ATGAACCCCAACTTTGCTGA -3 ;；
分子標記SSRl336的引物序列為:
F2:5 ; -ACAAGAAGGGCACGAGATGAATG -3 ;；
R2:5 ; -CTCTACAGCACCACCGACCAAG -3 ;。
[0016]所述的調控玉米光周期敏感性的主效QTL緊密連鎖的分子標記的方法，包括以下步驟:以玉米總DNA為模板，用分子標記SSR119的引物和分子標記SSR1336的引物序列進行PCR擴增，擴增產物經凝膠電泳檢測，判斷產物中是否具有與分子標記SSRl 19和SSR1336相同的目的條帶，從而判斷玉米是否具有玉米光周期敏感性基因，進而判斷其光周期敏感性的大小。
[0017]所述的與玉米光周期敏感性主效QTL緊密連鎖的分子標記，用於對玉米光周期敏感性進行遺傳結構分析、遺傳圖譜構建、基因定位、構建近等基因系、分子標記輔助選擇育種。分子標記SSR119和可以兩個同時使用，也可以單獨使用；所述的與玉米光周期敏感性主效QTL緊密連鎖的分子標記，用於對玉米光周期敏感性進行遺傳結構分析、遺傳圖譜構建、基因定位、構建近等基因系、分子標記輔助選擇育種。
[0018]下面結合具體實施事例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。
[0019]實施例1、分子標記SSR119和分子標記SSR1336在含玉米光周期敏感性主效基因位點的玉米近等基因系的創建中的應用
試驗所用的基礎群體來源於一個溫熱雜交組合:黃早4與CML288，黃早4是中國溫帶玉米自交系，對光周期反應不敏感；CML288是來自墨西哥國際玉米小麥改良中心，選自Pop24的熱帶硬粒型玉米自交系，在溫帶表現了很強的光周期敏感性。本發明以對光周期敏感的熱帶自交系CML288為供體親本，以對光周期鈍感的溫帶自交系黃早4為輪迴親本，通過回交育種程序，採用表型選擇與分子標記輔助選擇相結合的方法，通過雜交、回交或自交，選育僅含有玉米光周期敏感性主效基因位點的近等基因系。具體地，首先，在海南短日照環境下進行雜交獲得Fl，並在第二年Fl與黃早4回交；其次，在河南長日照日環境下對回交群體進行表型選擇，選擇散粉期和吐絲期極晚的單株，單獨取花粉，與4-5株黃早4進行授粉雜交，同時自交，並掛牌標示好自交單株、回交單株來源。然後，在海南短日照環境下，用目標位點兩側的標記首先進行前景選擇，用均勻分布於玉米10條染色體上的232個多態性好的SSR標記，對前景選擇篩選出來的單株進行遺傳背景選擇。在接下來的世代中，繼續開發目標區域內新的分子標記，選擇交換單株，最終利用本發明所提供的兩個標記SSRl 19和SSR1336，篩選出僅含玉米光周期敏感性主效基因位點的近等基因系單株。
[0020]實施例2、分子標記SSR119和分子標記SSR1336在玉米分子育種中的應用
用本發明的標記SSR119和分子標記SSR1336對溫熱雜交後代各個玉米單株進行分子標記檢測，如果所測的玉米單株的分子標記的基因型與溫帶親本的帶型一致，則該單株適應溫帶氣候條件，可以用於進一步玉米研究；如果所測的玉米單株的分子標記的基因型與熱帶親本的帶型一致，則該單株對溫帶的氣候條件表型敏感，表明該單株不能在溫帶條件下正常生長發育，因此該單株沒有進一步利用價值，應當淘汰；如果所測的玉米單株的分子標記的基因型與雜交組合Fl的帶型一致，則表明該單株為雜合單株，繼續自交後可以選出對光周期不敏感的後代，這類單株也有進一步利用價值，應當留用。
[0021]實施例3、分子標記SSRl 19在溫熱雜交組合玉米分子育種中的應用
用本發明分子標記SSR119的引物，對玉米單株DNA進行PCR擴增，並對擴增產物進行分子標記檢測，檢測到分子標記則表明光周期敏感性較強，未檢測到則表明光周期敏感性較弱。進一步，可將溫帶親本玉米、熱帶親本玉米及溫熱雜合Fl代單株DNA的PCR擴增產物作為對照；其中熱帶親本玉米基因組DNA確定含有玉米光周期敏感性基因；溫帶親本玉米基因組DNA不含有玉米光周期敏感性基因；如果所測的玉米單株PCR擴增產物的基因型與溫帶親本的帶型一致，則該單株適應溫帶氣候條件，可以用於進一步玉米研究；如果所測的玉米單株PCR擴增產物的基因型與熱帶親本的帶型一致，則該單株對溫帶的氣候條件表型敏感，表明該單株不能在溫帶條件下正常生長發育，因此該單株沒有進一步利用價值，應當淘汰；如 果所測的玉米單株PCR擴增產物的基因型與溫熱雜合Fl代單株的帶型一致，則表明該單株為雜合單株，繼續自交後可以選出對光周期不敏感的後代，這類單株也有進一步利用價值，應當留用。
[0022]具體步驟如下:
(1)提取待測玉米單株的基因組DNA;同時提取溫帶親本玉米基因組DNA、熱帶親本玉米基因組DNA和溫熱雜合玉米基因組DNA ；
(2)分別以待測玉米單株的基因組DNA、溫帶親本玉米基因組DNA、熱帶親本玉米基因組DNA和溫熱雜合玉米基因組DNA為模板用分子標記SSR119的引物進行PCR擴增；
(3)用變性的6%聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測PCR擴增產物；
(4)統計帶型結果；分析待測玉米單株DNA擴增產物基因型與溫帶親本、熱帶親本還是與溫熱雜合玉米相同。其中I表示與溫帶親本玉米基因型相同，2表示與熱帶親本基因型相同，3表示與溫熱雜交玉米基因型相同。
[0023]表1:用分子標記SSR119標記的基因型檢測結果
【權利要求】
1.一種與玉米光周期敏感性的主效QTL連鎖的分子標記，其特徵在於:為分子標記SSRl 19和分子標記SSR1336，所述分子標記的核苷酸序列分別為SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2。
2.如權利要求1所述的與玉米光周期敏感性的主效QTL連鎖的分子標記，其特徵在於: 分子標記SSRl 19的引物序列為:
Fl:5 ; - TACCGAAGACGGCGACG-3 ;；
Rl:5 ; - ATGAACCCCAACTTTGCTGA-3 ;； 分子標記SSRl336的引物序列為:
F2:5 ; -ACAAGAAGGGCACGAGATGAATG -3 ;；
R2:5 ; -CTCTACAGCACCACCGACCAAG -3 ;。
3.利用權利要求1所述的與玉米光周期敏感性的主效QTL連鎖的分子標記判斷玉米光周期敏感性的方法，其特徵在於:以玉米總DNA為模板，用引物對SSR559和SSR1008進行PCR擴增，擴增產物經凝膠電泳檢測，判斷產物中是否具有與分子標記SSRl 19和SSR1336相同的目的條帶，從而判斷玉米是否具有玉米光周期敏感性基因，進而判斷其光周期敏感性的大小。
4.如權利要求1所述的與玉米光周期敏感性的主效QTL連鎖的分子標記在玉米光周期敏感性的早期預測和篩選中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104004758SQ201410254590
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】王翠玲, 楊敏, 李雪林, 韓贊平, 王彬, 胡文花 申請人:河南科技大學