微生物與黑麥草聯合修復垃圾堆肥重金屬滲漏體系的方法
2023-06-21 10:49:11
專利名稱：微生物與黑麥草聯合修復垃圾堆肥重金屬滲漏體系的方法
技術領域：
本發明屬於垃圾堆肥在城市草坪建植技術領域中的應用，涉及採用微生物與黑麥草聯合修復垃圾堆肥重金屬滲漏體系的方法。
背景技術：
近年來，由生活垃圾引發的環境汙染問題已成為社會廣泛關注的焦點之一。隨著我國人民生活水平的日趨提高，城市生活垃圾產生量也隨之增加。將生活垃圾堆肥用作草坪基質，不但可以避開食物鏈，同時又解決了垃圾的出路問題。垃圾堆肥具有良好的理化性質、豐富的養分，是替代土壤作為草坪基質的較理想材料。在我國人口眾多，土地資源相對貧乏，以垃圾堆肥用作草坪基質更具有現實意義。一些草坪植物能夠在重金屬汙染較重的基質中生長，且生長速度快、再生能力強，在化學方法和生物方法協同修復垃圾堆肥重金屬中具有較大的應用價值。因此垃圾堆肥作為草坪基質的同時，其重金屬又能得到草坪植物的修復，這樣既增加了垃圾堆肥的應用潛力又提高了其使用的安全性。目前，我國已初步展開了將生活垃圾堆肥用於園林綠地基質或肥料的科研工作，垃圾堆肥通常以肥料的形式加入土壤，可以改善土壤性質，提高草坪草生物量、葉綠素含量等。但垃圾堆肥中含有高濃度的重金屬，在其改善土壤、土壤植物和微生物的同時，也對它們產生危害。所以，提出若想將垃圾堆肥應用於實際必須去除其中的重金屬的想法。垃圾堆肥施用過程中，如何防止或者減少重金屬進入土壤和地下水產生，已成為要解決的一大問題。研究發現，添加EDTA可以顯著提高重金屬在供試草坪植物中的富集量。利用EDTA協同植物修復的同時，由於EDTA以及EDTA與重金屬螯合形成的複合物具有很強的溶解性和生物毒性，且在土壤中很難被光、化學物質以及生物降解，所以很可能會引起汙染深層土壤及地下水汙染等環境問題。但是NTA (Nitrilotriacetic acid),在過去50年一直被應用於除垢劑，在分析化學中用作配位滴定劑和掩蔽劑，在催化動力學分析中常作為活化劑。然而關於微生物與黑麥草聯合修復垃圾堆肥重金屬滲漏體系的方法，未見文獻報導。微生物修復技術彌補了植物修復法、化學浸提法、化學浸提協同植物修復等方法成本高、施用有局限性等缺點。實驗證明弗蘭克菌屬對一定濃度的Cu、Co、Ni、Cd和Hg敏感性不強。Zhou等(2007)表明菌根能消減由玉米根系吸附的Cu向地上部運輸。在微生物培養基中加入了不同濃度的Cu、Hg、Pb、Cd和Cr 5種重金屬,對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌進行脅迫培養，結果發現Hg、Cd毒性較強，2種細菌的增殖在高濃度時受到抑制，枯草芽孢桿菌更為敏感，當重金屬濃度>50 mg/L後，5種重金屬對兩種細菌的毒性順序為Hg>Cd>Cu>Cr ^ Pb。微生物修復的一個重要特性是能耐受高濃度的重金屬離子，常見的如Cu、Zn、Ni等。針對這一特點，目前有研究者開始嘗試採用複合菌群來聯合進行修復。複合微生物由兩種或兩種以上微生物按合適比例共同培養組成，能夠充分發揮群體的聯合作用優勢，實驗表明接種複合微生物的垃圾堆肥其堆肥化效率顯著提高，並且可以提高種子的萌發率。
發明內容
本發明通過對草坪堆肥基質滲漏體系中重金屬富集、淋溶等的研究，系統地探討在微生物、NTA強化植物修復的同時重金屬淋溶遷移的潛在風險，並提出相應的防治方法。為實現上述目的本發明公開了如下的技術內容
一種微生物與黑麥草聯合修復垃圾堆肥重金屬滲漏體系的方法，其特徵在於按如下的步驟進行
(O實驗材料準備
試驗選用多年生黑麥草perenne L.)為實驗材料；生活垃圾堆肥取自天津市小澱堆肥廠；供試土壤取0-20 cm深的表層土；堆肥和園土經風乾後分別過2 _篩備用；隔層材料為由下至上分別由20g沸石、20g蛭石和20g鋸末組成；枯草芽孢桿菌、放線菌分離自天津小澱垃圾堆肥處理廠的生活垃圾堆肥；淋溶液用(NH4)2SO4, Na2SO4, K2SO4, MgSO4,Ca (NO3) 2、Mg (NO3) 2、H2SO4 配製出 SO42' NO3' Cl' NH+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+ 濃度分別為 14. 96、6. 54、I. 68,3. 71,0. 82、I. 38,0. 64 和 O. 78 mg/L,並用 HCl 調配 pH 為 5. 5-6 的淋溶液備用；
(2)實驗方法
1)草坪基質堆肥利用與隔層設置
選用PVC管直徑為7. 5cm, 25cm的長管，管底部固定有直徑為O. 2 mm的尼龍網以支撐管內的土和堆肥，將管吊起，管的下方配有錐形瓶接滲濾液；
2)在PVC管中裝入500g風乾的園土，鋪平，再裝入水平隔層由下至上分別由20g沸石、20g蛭石和20g鋸末組成，再裝入280g堆肥，鋪平於隔層之上；
3)微生物菌劑與草坪基質隔層體系的建立 將O. 5 g黑麥草播於PVC管中，播種IOd後，
I中加入I. 4 mL蒸餾水；
II中加入O. 7 mL牛肉膏蛋白腖培養基和0.7 mL高氏一號培養基；
III中加入I. 4 mL枯草芽孢桿菌；
IV中加入I. 4 mL放線菌；
V中加入O. 7 mL液體枯草芽孢桿菌和O. 7 mL液體放線菌的複合劑；
接菌後，草坪植物再生長30d，刈割，將刈割下的草坪植物地上部置於80°C的烘箱中烘乾至衡重，記地上生物量；
4)劉割第二天用150mL人工淋溶液,相當於34. O mm的降水量,進行第一次淋洗，之後每7 d淋洗一次，每次150mL，共4次淋入600 mL，4次分別稱重，並收集於同一個錐形瓶中，混合均勻待測；其中黑麥草種植期間均用自來水澆灌，保持其整體田間持水量為60-65%。種植期間室內的溫度和相對溼度分別為14-25°C和30_55%，光照強度為350-800// mol m 2 s 1 ；
5)利用TAS-990原子吸收分光光度計測定消化液中重金屬Cd、Cr、Cu、Pb和Ni的含量變化。本發明所述的沸石為天然沸石，篩取粒徑小於4mm的；蛭石取自日本弘洋園公司，取粒徑小於4mm的；鋸末取自加工廠廢棄下腳料，以上材料均80°C烘乾至恆重，備用。本發明所述的枯草芽孢桿菌、放線菌均有市售。也可以採用天津小澱垃圾堆肥處理廠的生活垃圾堆肥進行分離。其分離的方法為將分離出的菌種純化培養2代，取活化菌種，接入裝有50 mL液體培養基的250 mL三角瓶中，180 r/min適溫培養，用接種針挑取活化的枯草芽孢桿菌菌種，接入裝有50 mL液態的牛肉膏蛋白腖培養基的250 mL三角瓶中，180 r/min適溫培養12 h，獲得本實驗用枯草芽孢桿菌；用接種針挑取活化的放線菌菌種，接入裝有50 mL液態的高氏一號培養基的250 mL三角瓶中，180 r/min適溫培養96h，獲得本實驗用放線菌。 本發明的實驗結果表明水平隔層鋪與土壤至上、堆肥之下，可以減少垃圾堆肥中的有害物質和重金屬向土壤中遷移，使草坪植物在化學螯合劑誘導下或者微生物協同下，增加其吸收堆肥中的重金屬的時間和重金屬在其體內的富集，並減少重金屬向深層土壤的遷移。本發明採用的枯草芽孢桿菌(拉丁學名Bacillus subtil is )(保藏號CGMCC NO2548)，中北生物科技有限公司，對外可以提供。中國專利號為ZL200710062503. I。生理生化特性枯草芽孢桿菌菌體細胞為短杆狀，有芽孢，在顯微鏡下觀察菌體的大小為O. 4 0.8 μ mX 2. 3 3.7 μ m。菌體細胞呈較粗壯的杆狀，排列不整齊。革蘭氏染色呈陽性。在固體培養基表面，菌體形成半透明的淺黃色菌落，菌落粘稠，邊緣不整齊。本發明公開的土壤放線菌發酵液與申請號200610122277. 7公開的相同。本發明採用天津小澱垃圾堆肥處理廠的生活垃圾堆肥進行分離得出的枯草芽孢桿菌、放線菌與現有文獻報導的特性相同，(保藏號CGMCC NO 2548 ；CCTCC NO M206067菌株)固未保藏。枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌中具有應用潛力的菌種之一。近年來國內外對於芽孢桿菌應用方面的研究日益增多。放線菌可以促進植物新陳代謝，提高植物抗性。本發明將配製成不同濃度的枯草芽孢桿菌發酵液、放線菌發酵濾接種到草坪建植體系中。通過研究不同濃度的枯草芽孢桿菌發酵濾液、放線菌發酵濾液對黑麥草種子萌發的影響，為草坪植物的生態建植提供依據。本發明進一步公開了所述方法在增加重金屬在植物體內富集阻礙Cd，Cr, Cu和Ni的垂直遷移方面的應用；其方法是採用O. 7 mL液體枯草芽孢桿菌和O. 7 mL液體放線菌的複合劑以及水平隔層由下至上分別由20g沸石、20g蛭石和20g鋸末組成隔層。本實驗研究結果表明，綜合來看複合微生物對增加重金屬在植物體內的富集作用，和對阻礙Cd，Cr, Cu和Ni的垂直遷移都最為顯著。其中枯草芽孢桿菌對阻礙Pb的垂直遷移最為顯著。本發明更加詳細的孩子被方法如下
I實驗材料與方法
I.I 土壤、堆肥與草坪植物
(I)實驗用植物
本試驗選用我國北方比較常見的多年生黑麥草(Zo7iw perenne L.)為實驗材料。(2)實驗用堆肥和土壤及其理化
生活垃圾堆肥取自天津市小澱堆肥廠。供試土壤取自天津師範大學實驗地0-20 cm深的表層土。堆肥和園土經風乾後分別過2 _篩備用。堆肥理化性質為pH 7. 62，有機質含量12. 12%，全氮5. 18%，有效磷77. 92 mg/Kg,飽和含水量O. 76 mL/g。其重金屬Cd，Cr，Cu，Pb，Ni背景值分別為I. 97，67. 00,238. 73，172. 11,33. 42 P g/go 土壤性質為pH 8. 30，有機質含量 4. 68%，全氮 O. 21%，有效磷 22. 03mg/kg，飽和含水量O. 58 mL/g。其重金屬Cd，Cr，Cu，Pb，Ni的背景值分別為O. 18，2. 13，9. 33, 5. 75, 2. 64 P g/g0I. 2隔層材料選擇
本實驗隔層材料為沸石、蛭石、鋸末。沸石為天然沸石，篩取粒徑小於4_的；蛭石取自日本弘洋園公司，取粒徑小於4mm的。鋸末取自加工廠廢棄下腳料，以上材料均80°C烘乾至恆重，備用。本實驗隔層由下至上分別由20g沸石、20g蛭石和20g鋸末組成，裝入PVC管中共高 4cm。I. 3菌劑的製備 實驗用枯草芽孢桿菌、放線菌分離自天津小澱垃圾堆肥處理廠的生活垃圾堆肥。取10g新鮮堆肥加到90 mL的滅菌水中，配置適宜濃度的堆肥懸濁液，取混合均勻的懸濁液100
#L加入到相應的固體平板培養基上，適溫培養，根據菌落形態，挑取和已知枯草芽孢桿菌和放線菌比較相似的菌落進行革蘭氏染色法(鑑定細菌)、芽孢染色法(鑑定枯草芽孢桿菌)和印片法(鑑定放線菌)鑑定。根據鑑定結果，將分離出的菌種純化培養2代，取活化菌種，接入裝有50 mL液體培養基的250 mL三角瓶中，180 r/min適溫培養，選用600 nm波長進行比濁測定，以菌懸液的OD值為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪製微生物的生長曲線。根據生長曲線獲得微生物生長至穩定期的時間，得出枯草芽孢桿菌的穩定期為8_18h，放線菌的穩定期為84-108h。用接種針挑取活化的枯草芽孢桿菌菌種，接入裝有50mL液態的牛肉膏蛋白腖培養基的250 mL三角瓶中，180 r/min適溫培養12 h，獲得本實驗用枯草芽孢桿菌；用接種針挑取活化的放線菌菌種，接入裝有50 mL液態的高氏一號培養基的250 mL三角瓶中，180 r/min適溫培養96h，獲得本實驗用放線菌。I. 4淋溶液製備
根據韓毓(2008)調查全天津市降水pH值範圍為4. 00-8. 24，年均值為5. 59，屬酸性降/K。本實驗用(NH4)2SO4, Na2SO4, K2SO4, MgSO4, Ca(NO3)2、Mg(NO3)2、H2SO4 配製出 SO42' NO3'Cr、NH+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+濃度分別為 14. 96,6. 54、I. 68,3. 71,0. 82、I. 38,0. 64 和 O. 78 mg/L，並用HCl調配pH為5. 59的淋溶液。I. 5實驗方法
(I)草坪基質堆肥利用與隔層設置
PVC管直徑為7. 5cm,將其分別截成21cm的短管6根，25cm的長管24根。所有管底部都固定有直徑為O. 2 mm的尼龍網以支撐管內的土和堆肥，將管吊起，管的下方配有錐形瓶接滲濾液。土壤耕層為0_20cm的表層土。本實驗模擬表層土,設置園土高12cm,堆肥高8cm。製備高為20cm的短管6根，高為24cm的長管24根。短管的製備先裝入500g風乾的園土，鋪平，再裝入280g堆肥，鋪平於園土之上；長管的製備裝入500g風乾的園土，鋪平，再裝入水平隔層，再裝入280g堆肥，鋪平於隔層之上。(2)微生物菌劑與草坪基質隔層體系的建立
草坪植物選用多年生黑麥草。將0.5 g黑麥草播於PVC管中，每組3次重複，處理見表
I。播種10 d後，I中加入I.4 mL蒸餾水；II中加入0.7 mL牛肉膏蛋白腖培養基和O. 7 mL高氏一號培養基；III中加入I. 4 mL枯草芽孢桿菌；IV中加入I. 4 mL放線菌；V中加入O. 7mL液體枯草芽孢桿菌和O. 7 mL液體放線菌的複合。接菌後，草坪植物再生長30 d，刈割(黑麥草共生長40 d)，將刈割下的草坪植物地上部置於80 V的烘箱中烘乾至衡重，記地上生物量。刈割第二天用150 mL人工淋溶液(相當於34. O mm的降水量)進行第一次淋洗，之後每
7d淋洗一次,每次150 mL,共4次淋入600 mL。4次分別稱重,並收集於同一個錐形瓶中，混合均勻待測。草坪植物種植期間均用自來水澆灌，保持其整體田間持水量為60%。種植期間室內的溫度和相對溼度分別為14-25°C和30-55%，光照強度為350-800// mol πΓ2 s'表I微生物菌劑接種和隔層處理方案
權利要求
1.一種微生物與黑麥草聯合修復垃圾堆肥重金屬滲漏體系的方法，其特徵在於按如下的步驟進行 (O實驗材料準備 試驗選用多年生黑麥草perenne L.)為實驗材料；生活垃圾堆肥取自天津市小澱堆肥廠；供試土壤取0-20 cm深的表層土；堆肥和園土經風乾後分別過2 _篩備用；隔層材料為由下至上分別由20g沸石、20g蛭石和20g鋸末組成；枯草芽孢桿菌、放線菌分離自天津小澱垃圾堆肥處理廠的生活垃圾堆肥；淋溶液用(NH4)2SO4, Na2SO4, K2SO4, MgSO4,Ca (NO3) 2、Mg (NO3) 2、H2SO4 配製出 SO42' NO3' Cl' NH+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+ 濃度分別為 14. 96、6.54、I. 68,3. 71,0. 82、I. 38,0. 64 和 O. 78 mg/L,並用 HCl 調配 pH 為 5. 5-6 的淋溶液備用； (2)實驗方法 1)草坪基質堆肥利用與隔層設置 選用PVC管直徑為7. 5cm, 25cm的長管，管底部固定有直徑為O. 2 mm的尼龍網以支撐管內的土和堆肥，將管吊起，管的下方配有錐形瓶接滲濾液； 2)在PVC管中裝入500g風乾的園土，鋪平，再裝入水平隔層由下至上分別由20g沸石、20g蛭石和20g鋸末組成，再裝入280g堆肥，鋪平於隔層之上； 3)微生物菌劑與草坪基質隔層體系的建立 將O. 5 g黑麥草播於PVC管中，播種IOd後， I中加入I. 4 mL蒸餾水； II中加入O. 7 mL牛肉膏蛋白腖培養基和0.7 mL高氏一號培養基； III中加入I. 4 mL枯草芽孢桿菌； IV中加入I. 4 mL放線菌； V中加入O. 7 mL液體枯草芽孢桿菌和O. 7 mL液體放線菌的複合劑； 接菌後，草坪植物再生長30d，刈割，將刈割下的草坪植物地上部置於80°C的烘箱中烘乾至衡重，記地上生物量； 4)劉割第二天用150mL人工淋溶液,相當於34. O mm的降水量,進行第一次淋洗，之後每7 d淋洗一次，每次150mL，共4次淋入600 mL，4次分別稱重，並收集於同一個錐形瓶中，混合均勻待測；其中黑麥草種植期間均用自來水澆灌，保持其整體田間持水量為60-65%;種植期間室內的溫度和相對溼度分別為14-25 °C和30_55%，光照強度為350-800// mol m 2 s 1 ； 5)利用TAS-990原子吸收分光光度計測定消化液中重金屬Cd、Cr、Cu、Pb和Ni的含量變化。
2.權利要求I所述的方法，其中沸石為天然沸石，篩取粒徑小於4_的；蛭石取自日本弘洋園公司，取粒徑小於4mm的；鋸末取自加工廠廢棄下腳料，以上材料均80°C烘乾至恆重，備用。
3.權利要求I所述的方法，其中枯草芽孢桿菌、放線菌分離的方法為將分離出的菌種純化培養2代，取活化菌種，接入裝有50 mL液體培養基的250 mL三角瓶中，180 r/min適溫培養，用接種針挑取活化的枯草芽孢桿菌菌種，接入裝有50 mL液態的牛肉膏蛋白腖培養基的250 mL三角瓶中，180 r/min適溫培養12 h，獲得本實驗用枯草芽孢桿菌；用接種針挑取活化的放線菌菌種，接入裝有50 mL液態的高氏一號培養基的250 mL三角瓶中，180 r/min適溫培養96h,獲得本實驗用放線菌。
4.權利要求I所述方法在增加重金屬在植物體內富集阻礙Cd，Cr, Cu和Ni的垂直遷移方面的應用；其方法是採用O. 7 mL液體枯草芽孢桿菌和O. 7 mL液體放線菌的複合劑以及水平隔層由下至上分別由20g沸石、20g蛭石和20g鋸末組成隔層。
全文摘要
本發明公開了一種微生物與黑麥草聯合修復垃圾堆肥重金屬滲漏體系的方法，它是在直徑為7.5cm，長25cm的PVC管中裝入500g風乾的園土，裝入水平隔層60g，再裝入280g堆肥；在管中播種0.6g黑麥草種子，播種30d後，將不同濃度的微生物菌劑施於堆肥表面，10d後刈割草，測定重金屬Cd，Cr，Cu，Pb和Zn的含量變化。本發明的實驗結果表明水平隔層鋪與土壤至上、堆肥之下，可以減少垃圾堆肥中的有害物質和重金屬向土壤中遷移，使草坪植物在化學螯合劑誘導下或者微生物協同下，增加其吸收堆肥中的重金屬的時間和重金屬在其體內的富集，並減少重金屬向深層土壤的遷移。
文檔編號A01G1/00GK102626034SQ201210134879
公開日2012年8月8日 申請日期2012年5月4日 優先權日2012年5月4日
發明者多立安, 賈麗娜, 趙樹蘭 申請人:天津師範大學