矽烷化活性炭的製備方法、固載化酶的製備方法

2023-06-29 04:49:06 6

矽烷化活性炭的製備方法、固載化酶的製備方法
【專利摘要】本發明涉及生物化工領域，特別涉及矽烷化活性炭的製備方法、固載化酶的製備方法。在本發明中，矽烷化活性炭的製備方法包括：取活性炭，經氧化，得到氧化後的活性炭；在有機溶劑和水存在的條件下，氧化後的活性炭與矽烷偶聯劑發生矽烷化反應，即得；以g/mL計，氧化後的活性炭與水的用量比為1:（0.05～0.2）。本發明提供的固載化酶的製備方法可大大提高生物酶的固載量，酶活力也有所提高。
【專利說明】矽烷化活性炭的製備方法、固載化酶的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物化工領域，特別涉及矽烷化活性炭的製備方法、固載化酶的製備方法。
【背景技術】
[0002]酶是具有生物催化功能的生物大分子，即生物催化劑，它能夠加快生化反應的速度，但不改變反應的方向和產物，是一種催化反應條件溫和、高選擇性、無汙染的天然高分子催化劑。在生物體內，酶參與機體所有的生命活動，使生物體內極其複雜的代謝活動不斷地、有條不紊地進行。例如人體從食物中攝取的蛋白質，必須在胃蛋白酶的作用下，水解成胺基酸，成為人體可吸收利用的營養成分。在生產生活中，酶同樣發揮著極其重要的作用，例如釀造醬油、食醋、酒，製作診斷疾病的試劑盒，治理環境汙染等，因此酶在食品加工、醫藥、環境保護等方面有著廣闊的應用前景。 [0003]然而，處於自由狀態下的酶具有不穩定性，容易變形，在反應體系中的很難分離和提純，因此固載酶技術應運而生。固載酶技術是用物理或化學方法處理生物酶使之固定於固相載體，但仍具有酶活性的一種技術。酶經固載後，不僅容易分離，而且對溫度與PH值變化的穩定性聞，可提聞生成物的質量。
[0004]常用的酶固載方法有物理吸附法、包埋法和共價結合法。物理吸附法是通過物理吸附或靜電引力將酶吸附在活性炭、氧化鋁、離子交換樹脂等具有活潑表面的載體上，優點是操作簡便，缺點是結合不牢，酶容易脫落，從孔道裡漏出，導致很差的操作穩定性。包埋法是將酶分子包埋在凝膠的網格中或微型膠囊中，優點是酶包埋在聚合物中不易漏出，操作條件溫和，對外界環境的緩衝作用大，可防止酶體的機械損傷，易於再生，產物分離提取容易，適合實驗室操作，缺點是持久性差，包埋反應可能會減損酶的活性。共價法相對於物理吸附法和包埋法具有一定的優勢，它是通過酶分子上的官能團，如氨基、羧基、腈基、酚基、巰基、咪唑基，將酶分子通過共價鍵結合於天然或合成高聚物載體上，酶與載體結合牢固，酶分子不會脫落，具有較好的穩定性，因此目前多採用共價結合法進行酶的固載。例如將澱粉酶、脂肪酶和蛋白酶通過共價結合方法固載到聚氯乙烯材料上，由這些材料製造成刷子、毛巾、容器等，在用於去除汙潰時具有很好的效果。
[0005]但利用現有的固載方法，酶的固載量相對較低。例如:通過使用金屬離子和戊二醛將過氧化氫酶固載到皮膠原纖維上，載體上酶的固載量只有20~30mg/g ;採用聚合物微球固載生物酶，酶的固載量在30mg/g以下；用交聯法將葡萄糖異構酶固載到活性炭上，並將固載酶應用於填充床反應器中，固載酶質量分數也只有1%~3%。因此，如何提高生物酶的固載量成為固載酶技術中亟需解決的問題。

【發明內容】

[0006]有鑑於此，本發明提供了矽烷化活性炭的製備方法、固載化酶的製備方法。該製備方法通過在矽烷化反應體系中加入少量的水，提高了生物酶的固載量。[0007]為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案:
[0008]本發明提供了一種矽烷化活性炭的製備方法，包括如下步驟:
[0009]取活性炭，經氧化，得到氧化後的活性炭；
[0010]在有機溶劑和水存在的條件下，氧化後的活性炭與矽烷偶聯劑發生矽烷化反應，即得；
[0011]以g/mL計，氧化後的活性炭與水的用量比為1: (0.05~0.2)。
[0012]矽烷偶聯劑比較活潑，在水中易分解，所以矽烷化反應體系中一般不加入水進行矽烷化反應。本發明在矽烷化反應體系中加入少量水，從而可將矽烷偶聯劑固載量提高10倍，其機制為:加入少量水有利於矽烷試劑與活性炭表面上的酚羥基發生水解反應，更容易將矽烷試劑共價固載到活性炭載體上。本發明中使用多胺基的矽烷偶聯劑也可以使酶的固載量增加。
[0013]在本發明提供的一些實施例中，矽烷偶聯劑為二乙稀二胺基丙基二甲氧基矽烷、3-氨丙基二甲氧基矽烷、3-氨丙基二乙氧基矽烷、3-氨丙基甲基二甲氧基矽烷、3-氨丙基甲基二乙氧基矽烷或2-氨乙基三甲氧基矽烷中的一種或兩者以上的混合物。
[0014]二乙烯三胺基丙基三甲氧基矽烷能夠提高固載量，這種矽烷偶聯劑除了有一個伯胺之外還有另外兩個仲氨基團，在接枝戊二醛時也會參與反應，相對於其他矽烷偶聯劑能夠接枝更多的戊二醛。目前，還未見將二乙烯三胺基丙基三甲氧基矽烷作為矽烷偶聯劑的報導。作為優選，矽烷化反應採用的矽烷偶聯劑為二乙烯三胺基丙基三甲氧基矽烷。
[0015]作為優選，氧化後的活性炭與水的用量比為1: (0.1~0.17)。
[0016]在本發明提供的一些實施例中，以g/mL計，氧化後的活性炭與矽烷偶聯劑的用量比為 1: (0.67 ~I)。
[0017]在本發明提供的一些實施例中，矽烷化反應為在63~120°C條件下進行矽烷化反應12~24h。
[0018]作為優選，矽烷化反應的時間為13~24h。
[0019]矽烷化反應需在有機溶劑中發生反應。作為優選，有機溶劑為甲苯、二氯甲烷、二甲基亞碸或乙醇中的一種或兩者以上的混合物。
[0020]活性炭與生物酶發生共價結合前，需採用一系列的手段對活性炭進行改性，首先需要對活性炭進行氧化，使活性炭表面產生大量的酚羥基，用於矽烷化反應。在本發明提供的一些實施例中，氧化採用的試劑為硝酸。
[0021]在本發明提供的一些實施例中，硝酸的質量百分濃度為15%~25%。
[0022]在本發明提供的一些實施例中，氧化為在75~80°C的條件下氧化3~5h。
[0023]本發明還提供了一種固載化酶的製備方法，如本發明提供的矽烷化活性炭製備方法製得的矽烷化活性炭與戊二醛發生交聯反應，得到接枝戊二醛的活性炭，再與生物酶共價結合，即得。
[0024]在本發明提供的一些實施例中，戊二醛的質量百分濃度為5%~10%。
[0025]在本發明提供的一些實施例中，交聯反應具體為在50~60°C的條件下交聯6~8h。
[0026]經過改性的活性炭可固載多種生物酶，在本發明提供的一些實施例中，生物酶包括脲酶、葡萄糖氧化酶、木瓜蛋白酶、過氧化氫酶、辣根過氧化物酶、漆酶、脂肪酶、葡萄糖異構酶、果膠酶、穀氨醯胺轉氨酶或α-澱粉酶。但生物酶的種類並非局限與此，本領域技術人員認為可行的生物酶均在本發明的保護範圍之內，本發明在此不做限定。
[0027]固載生物酶的過程中，將生物酶與緩衝溶液混合製得生物酶溶液，再與經接枝戊二醛的活性炭進行共價結合。在本發明提供的一些實施例中，生物酶溶液的質量體積濃度為 1.5 ~3g/L。
[0028]生物酶溶液中採用的緩衝溶液優選為磷酸鹽、酒石酸、檸檬酸或醋酸鹽製得的緩衝溶液。[0029]在本發明提供的一些實施例中，共價結合具體為在O~50°C的條件下共價結合12 ~36h。
[0030]作為優選，共價結合具體為在4~10°C的條件下固載10~24h。
[0031]活性炭是一種廉價、易得、無毒的多孔材料，孔徑可在製備過程中調節，具有較高的機械強度，良好的耐磨性和固有的顆粒結構，滿足填充床反應器連續操作的要求。在本發明提供的一些實施例中，活性炭的原料來源於煤質和/或果殼。
[0032]在本發明提供的一些實施例中，果殼選自椰殼、桃核殼、杏核殼或核桃殼中的一種或兩者以上的混合物。
[0033]在本發明提供的一些實施例中，活性炭的孔徑為I~200nm。
[0034]作為優選，活性炭的孔徑為2~lOOnm。
[0035]在本發明提供的一些實施例中，活性炭的比表面積為200~1600m2/g。
[0036]在本發明提供的一些實施例中，活性炭的粒徑為0.3~5mm。
[0037]本發明提供了矽烷化活性炭的製備方法、固載化酶的製備方法。本發明中矽烷化活性炭製備方法包括:取活性炭，經氧化，得到氧化後的活性炭；在有機溶劑和水存在的條件下，氧化後的活性炭與矽烷偶聯劑發生矽烷化反應，即得；以g/mL計，氧化後的活性炭與水的用量比為1: (0.05~0.2);本發明中固載化酶的製備方法為:本發明製得的矽烷化活性炭與戊二醛發生交聯反應，得到接枝戊二醛的活性炭，再與生物酶共價結合，即得。經過檢測後，本發明提供的製備方法製得的固載化酶的固載量在85~120mg/g之間，酶活力保持在35.5%~55.2%之間，而利用現有固載技術生物酶的固載量低於45mg/g,活力低於37%。由此可見，本發明提供的固載化酶的製備方法可大大提高生物酶的固載量，酶活力也有所提聞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1示實施例1中椰殼活性炭的碳元素X射線光電子能譜(XPS)圖；
[0039]圖2示實施例1中氧化後的活性炭的碳元素XPS圖；
[0040]圖3示實施例1提供的紅外光譜(FT-1R)圖。其中，線I示氧化後的活性炭，線2示矽烷化活性炭；
[0041]圖4示實施例1提供的FT-1R圖。其中，線2示矽烷化活性炭，線3示接枝戊二醛的活性炭；
[0042]圖5示實施例1提供的FT-1R圖。其中，線3示接枝戊二醛的活性炭，線4示固載化脲酶。【具體實施方式】
[0043]本發明公開了矽烷化活性炭的製備方法、固載化酶的製備方法，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0044]本發明提供的矽烷化活性炭的製備方法、固載化酶的製備方法中所用原料、試劑均可由市場購得。
[0045]下面結合實施例，進一步闡述本發明:
[0046]實施例1固載化脲酶的製備
[0047]將200mL質量百分濃度為20%的硝酸與5g椰殼活性炭(從sigma公司購買)進行混合，反應溫度為80°C，反應時間為4h，用去離子水煮沸lh，過濾，然後用去離子水洗滌，重複三次，直至硝酸全部衝洗乾淨，置於105°C下乾燥12h，得到第一產物。
[0048]150mL甲苯作為溶劑，將3g第一產物在氮氣保護下與2mL的3_氨丙基三甲氧基矽烷(矽烷偶 聯劑)混合，再加入0.3mL去離子水，在110°C下攪拌反應24h，然後再用乙醇進行索氏提取24h，除去未反應的矽烷試劑，在80°C下乾燥，得到第二產物。
[0049]取製得的第二產物與質量濃度為5%的戊二醛溶液150mL在60°C條件下反應6h，過濾，並用乙醇洗滌除去未反應的戊二醛，得到第三產物。
[0050]用pH為6.8的磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉緩衝溶液將脲酶(EC3.5.1.5)配成3g/L的脲酶溶液，取IOOmL脲酶溶液與Ig第三產物在冰浴下攪拌36h，過濾，再用pH為6.8的磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉緩衝溶液衝洗，除去物理吸附的酶。最後經真空冷凍乾燥，得到第四產物，於4°C下保存。
[0051]取第一產物與椰殼活性炭(原料活性炭)利用X射線光電子能譜方法進行檢測，結果如圖1、圖2所示。由圖1、圖2可知，氧化後的活性炭的-C-OH峰強度大大增強，結果表明第一產物含有大量的酚羥基官能團，酚羥基含量為0.25mmol/g，即得到了氧化後的活性炭。
[0052]取第二產物與第一產物利用紅外光譜法進行檢測，結果如圖3所示。由圖3可以看出，矽烷化活性炭在779CHT1處出現Ar-O-Si基團，721(^1是-(CH2) 3_基團的伸縮振動峰，同時在1546CHT1處出現-NH2伸縮振動峰，此外在1405CHT1處Ar-OH峰矽烷化後明顯減弱。結果表明活性炭表面的酚羥基官能團與矽烷偶聯劑發生了縮合，即得到了矽烷化活性炭。
[0053]取第三產物利用紅外光譜法進行檢測，結果如圖4所示。由圖4可以看出，1546CHT1處的-NH2伸縮振動峰消失，而在1564CHT1處出現C=N雙鍵的伸縮振動，同時在1726CHT1處出現醛基的C=O伸縮振動。矽烷化結果表明矽烷化活性炭上的伯胺基與戊二醛上一端的醛基發生了縮合反應，即得到了接枝戊二醛的活性炭。
[0054]取第四產物利用紅外光譜法進行檢測，結果如圖5所示。由圖5可以看出，接枝戊二醛的活性炭在固載酶後醛基的C=O雙鍵伸縮振動消失，而在1500~1700cm-1處出現酶的醯胺I帶和醯胺II帶吸收峰。結果表明酶成功固載在接枝戊二醛的活性炭上，即得到了固載化脲酶。
[0055]實施例2固載化脂肪酶的製備[0056]將200mL質量百分濃度為20%的硝酸與5g椰殼活性炭進行混合，反應溫度為80°C，反應時間為4h，得到氧化後的活性炭。用去離子水將氧化後的活性炭煮沸lh，過濾，然後用去離子水洗滌，重複三次，直至硝酸全部衝洗乾淨，置於105°C下乾燥12h，得到第一產物。
[0057]150mL乙醇作為溶劑，將3g第一產物在氮氣保護下與2mL的3-氨丙基甲基二甲氧基矽烷混合，再加入0.3mL去離子水，在78°C下攪拌反應24h，然後再用乙醇進行索氏提取24h，除去未反應的矽烷試劑，在80°C下乾燥，得到第二產物。
[0058]取製得的第二產物與質量濃度為5%的戊二醛溶液150mL在60°C條件下反應6h，過濾，並用乙醇洗滌除去未反應的戊二醛，得到第三產物。
[0059]最後用pH為6.5磷酸鹽緩衝溶液將脂肪酶(EC3.1.1.3)配成3g/L的脂肪酶溶液，取IOOmL脂肪酶溶液與Ig第三產物冰浴下攪拌36h。最後，過濾、真空冷凍乾燥，得到第四產物，於4°C下保存。
[0060]取第一產物、第二產物、第三產物、第四產物採用實施例1相同的檢測方法進行檢測，得到的圖譜與實施例1提供的圖譜相似，結果表明第一產物為氧化後的活性炭、第二產物為矽烷化活性炭、第三產物為接枝戊二醛的活性炭、第四產物為固載化脂肪酶。
[0061]實施例3固載化葡萄糖氧化酶的製備
[0062]將200mL質量百分濃度為15%的硝酸與5g桃核活性炭進行混合，反應溫度為80°C，反應時間為4h，得到氧 化後的活性炭。用去離子水將氧化後的活性炭煮沸lh，過濾，然後用去離子水洗滌，重複三次，直至硝酸全部衝洗乾淨，置於105°C下乾燥12h，得到第一產物。
[0063]用150mL氯仿(二氯甲烷)作為溶劑，將3g第一產物在氮氣保護下與2mL3_氨丙基三乙氧基矽烷矽混合，加入0.3mL去離子水，在63°C下反應24h，然後再用乙醇進行索氏提取24h，除去未反應的矽烷試劑，在80°C下乾燥，得到第二產物。
[0064]取製得的第二產物與質量濃度為5%的戊二醛溶液150mL在60°C條件下反應6h，過濾，並用乙醇洗滌除去未反應的戊二醛，得到第三產物。
[0065]用pH為6.5的磷酸鹽與檸檬酸緩衝溶液將葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)配製成
1.5g/L的葡萄糖氧化酶溶液，取IOOmL的葡萄糖氧化酶溶液與Ig第三產物在冰浴下攪拌36h，過濾，再用pH為6.5的磷酸鹽與檸檬酸緩衝溶液衝洗，除去物理吸附的酶。最後經真空冷凍乾燥，得到第四產物，於4°C下保存。
[0066]取第一產物、第二產物、第三產物、第四產物採用實施例1相同的檢測方法進行檢測，得到的圖譜與實施例1提供的圖譜相似，結果表明第一產物為氧化後的活性炭、第二產物為矽烷化活性炭、第三產物為接枝戊二醛的活性炭、第四產物為固載化葡萄糖氧化酶。
[0067]實施例4固載化木瓜蛋白酶的製備
[0068]將200mL質量百分濃度為15%的硝酸與5g桃核活性炭進行混合，反應溫度為80°C，反應時間為4h，得到氧化後的活性炭。用去離子水將氧化後的活性炭煮沸lh，過濾，然後用去離子水洗滌，重複三次，直至硝酸全部衝洗乾淨，置於105°C下乾燥12h，得到第一產物。
[0069]150mL甲苯作為溶劑，將3g第一產物在氮氣保護下與2mL的3-氨丙基甲基二乙氧基矽烷混合，加入0.3mL去尚子水，在110 C下反應24h,然後再用乙醇進彳丁索氏提取24h,除去未反應的矽烷試劑，在80°C下乾燥，得到第二產物。
[0070]取製得的第二產物與質量濃度為5%的戊二醛溶液150mL在60°C條件下反應6h，過濾，並用乙醇洗滌除去未反應的戊二醛，得到第三產物。
[0071 ] 用pH為6.5磷酸鹽緩衝液將木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2 )配成2g/L的木瓜蛋白酶溶液。取IOOmL木瓜蛋白酶溶液與Ig第三產物在4°C下攪拌24h，過濾，再用pH為6.5的磷酸鹽緩衝液衝洗，除去物理吸附的酶。最後經真空冷凍乾燥，得到第四產物，於4°C下保存。
[0072]取第一產 物、第二產物、第三產物、第四產物採用實施例1相同的檢測方法進行檢測，得到的圖譜與實施例1提供的圖譜相似，結果表明第一產物為氧化後的活性炭、第二產物為矽烷化活性炭、第三產物為接枝戊二醛的活性炭、第四產物為固載化木瓜蛋白酶。
[0073]實施例5固載化過氧化氫酶的製備
[0074]將200mL質量百分濃度為15%的硝酸與5g杏核活性炭進行混合，反應溫度為80°C，反應時間為5h，得到氧化後的活性炭。用去離子水將氧化後的活性炭煮沸lh，過濾，然後用去離子水洗滌，重複三次，直至硝酸全部衝洗乾淨，置於105°C下乾燥12h，得到第一產物。
[0075]150mL 二甲基亞碸作為溶劑，將3g第一產物在氮氣保護下與3mL2_氨乙基三甲氧基矽烷矽混合，加入0.15mL去離子水，在120°C下反應24h，然後再用乙醇進行索氏提取24h，除去未反應的矽烷試劑，在80°C下乾燥，得到第二產物。
[0076]取製得的第二產物與質量濃度為5%的戊二醛溶液150mL在60°C條件下反應6h，過濾，並用乙醇洗滌除去未反應的戊二醛，得到第三產物。
[0077]用pH為6.5的磷酸鹽緩衝溶液將過氧化氫酶(EC1.11.1.6)配成2g/L的過氧化氫酶溶液，取IOOmL過氧化氫酶溶液與Ig第三產物在冰浴下攪拌36h，過濾，再用pH為6.5的磷酸鹽緩衝溶液衝洗，除去物理吸附的酶。最後經真空冷凍乾燥，得到第四產物，於4°C下保存。
[0078]取第一產物、第二產物、第三產物、第四產物採用實施例1相同的檢測方法進行檢測，得到的圖譜與實施例1提供的圖譜相似，結果表明第一產物為氧化後的活性炭、第二產物為矽烷化活性炭、第三產物為接枝戊二醛的活性炭、第四產物為固載化過氧化氫酶。
[0079]實施例6固載化果膠酶的製備
[0080]將200mL質量百分濃度為15%的硝酸與5g杏核活性炭進行混合，反應溫度為80°C，反應時間為5h，得到氧化後的活性炭。用去離子水將氧化後的活性炭煮沸lh，過濾，然後用去離子水洗滌，重複三次，直至硝酸全部衝洗乾淨，置於105°C下乾燥12h，得到第一產物。
[0081]150mL乙醇作為溶劑，將3g第一產物在氮氣保護下與3mL 二乙烯三胺基丙基三甲氧基矽烷矽混合，加入0.4mL去離子水，在78°C下反應24h，然後再用乙醇進行索氏提取24h，除去未反應的矽烷試劑，在80°C下乾燥，得到第二產物。
[0082]取製得的第二產物與質量濃度為5%的戊二醛溶液150mL在60°C條件下反應6h，過濾，並用乙醇洗滌除去未反應的戊二醛，得到第三產物。
[0083]用pH為4.0磷酸鹽與檸檬酸緩衝液將果膠酶(3.2.1.15)配成2g/L的果膠酶溶液，取IOOmL果膠酶溶液與Ig第三產物在冰浴下攪拌36h，過濾，再用pH為4.0磷酸鹽與檸檬酸緩衝液衝洗，除去物理吸附的酶。最後經真空冷凍乾燥，得到第四產物，於4°C下保存。[0084]取第一產物、第二產物、第三產物、第四產物採用實施例1相同的檢測方法進行檢測，得到的圖譜與實施例1提供的圖譜相似，結果表明第一產物為氧化後的活性炭、第二產物為矽烷化活性炭、第三產物為接枝戊二醛的活性炭、第四產物為固載化果膠酶。
[0085]實施例7固載化葡萄糖異構酶的製備
[0086]將200mL質量百分濃度為20%的硝酸與5g煤質活性炭進行混合，反應溫度為80°C，反應時間為5h，得到氧化後的活性炭。用去離子水將氧化後的活性炭煮沸lh，過濾，然後用去離子水洗滌，重複三次，直至硝酸全部衝洗乾淨，置於105°C下乾燥12h，得到第一產物。
[0087]150mL甲苯作為溶劑，將3g第一產物在氮氣保護下與2mL的3-氨丙基甲基二乙氧基矽烷混合，加入0.6mL去尚子水，在110 C下反應24h,然後再用乙醇進彳丁索氏提取24h,除去未反應的矽烷試劑，在80°C下乾燥，得到第二產物。
[0088]取製得的第二產物與質量濃度為10%的戊二醛溶液150mL在60°C條件下反應6h，過濾，並用乙醇洗滌除去未反應的戊二醛，得到第三產物。
[0089]用pH為7.5磷酸鹽緩衝液將葡萄糖異構酶(EC5.3.1.5)配成3g/L的葡萄糖異構酶溶液，取IOOmL葡萄糖異構酶溶液與Ig第三產物在4°C下攪拌24h，過濾，再用pH為7.5磷酸鹽緩衝液衝洗，除去物理吸附的酶。最後經真空冷凍乾燥，得到第四產物，於4°C下保存。
[0090]取第一產物、第二產物、第三產物、第四產物採用實施例1相同的檢測方法進行檢測，得到的圖譜與實施例1提供的 圖譜相似，結果表明第一產物為氧化後的活性炭、第二產物為矽烷化活性炭、第三產物為接枝戊二醛的活性炭、第四產物為固載化葡萄糖異構酶。
[0091]實施例8固載化α -澱粉酶的製備
[0092]將200mL質量百分濃度為20%的硝酸與5g煤質活性炭進行混合，反應溫度為80°C，反應時間為5h，得到氧化後的活性炭。用去離子水將氧化後的活性炭煮沸lh，過濾，然後用去離子水洗滌，重複三次，直至硝酸全部衝洗乾淨，置於105°C下乾燥12h，得到第一產物。
[0093]150mL甲苯作為溶劑，將3g第一產物在氮氣保護下與2mL的2_氨乙基三甲氧基矽烷混合，加入0.5mL去離子水，在110°C下反應24h，然後再用乙醇進行索氏提取24h，除去未反應的矽烷試劑，在80°C下乾燥，得到第二產物。
[0094]取製得的第二產物與質量濃度為5%的戊二醛溶液150mL在60°C條件下反應6h，過濾，並用乙醇洗滌除去未反應的戊二醛，得到第三產物。
[0095]用pH為6.0磷酸鹽與檸檬酸緩衝液將α -澱粉酶(EC3.2.1.1)配成3g/L的α -澱粉酶溶液，取IOOmL α -澱粉酶溶液與Ig第三產物在10°C下攪拌12h，過濾，再用pH為6.0磷酸鹽與檸檬酸緩衝液衝洗，除去物理吸附的酶。最後經真空冷凍乾燥，得到第四產物，於4°C下保存。
[0096]取第一產物、第二產物、第三產物、第四產物採用實施例1相同的檢測方法進行檢測，得到的圖譜與實施例1提供的圖譜相似，結果表明第一產物為氧化後的活性炭、第二產物為矽烷化活性炭、第三產物為接枝戊二醛的活性炭、第四產物為固載化α -澱粉酶。
[0097]實施例9固載化辣根過氧化物酶的製備
[0098]將200mL質量百分濃度為20%的硝酸與5g核桃核活性炭進行混合，反應溫度為80°C，反應時間為5h，得到氧化後的活性炭。用去離子水將氧化後的活性炭煮沸lh，過濾，然後用去離子水洗滌，重複三次，直至硝酸全部衝洗乾淨，置於105°C下乾燥12h，得到第一產物。
[0099]150mL 二甲基亞碸作為溶劑，將3g第一產物在氮氣保護下與3mL2_氨乙基三甲氧基矽烷混合，加入0.3mL的去尚子水，在120 C下反應13h,然後再用乙醇進彳丁索氏提取24h,除去未反應的矽烷試劑，在80°C下乾燥，得到第二產物。
[0100]取製得的第二產物與質量濃度為5%的戊二醛溶液150mL在60°C條件下反應6h，過濾，並用乙醇洗滌除去未反應的戊二醛，得到第三產物。
[0101]用pH為5.0磷酸鹽和檸檬酸緩衝液將辣根過氧化物酶(EC1.11.1.7)配成38/1的辣根過氧化物酶溶液，取IOOmL辣根過氧化物酶溶液與Ig第三產物在冰浴下攪拌36h，過濾，再用pH為5.0磷酸鹽和檸檬酸緩衝液衝洗，除去物理吸附的酶。最後經真空冷凍乾燥，得到第四產物，於4°C下保存。
[0102]取第一產物、第二產物、第三產物、第四產物採用實施例1相同的檢測方法進行檢測，得到的圖譜與實施例1提供的圖譜相似，結果表明第一產物為氧化後的活性炭、第二產物為矽烷化活性炭、第三產物為接枝戊二醛的活性炭、第四產物為固載化辣根過氧化物酶。
[0103]實施例10固載化穀氨醯胺轉氨酶的製備
[0104]將200mL質量百分濃度為20%的硝酸與5g核桃核活性炭進行混合，反應溫度為80°C，反應時間為5h，得到氧化後的活性炭。用去離子水將氧化後的活性炭煮沸lh，過濾，然後用去離子水洗滌，重複 三次，直至硝酸全部衝洗乾淨，置於105°C下乾燥12h，得到第一產物。
[0105]150mL甲苯作為溶劑，將3g第一產物在氮氣保護下與2mL的二乙烯三胺基丙基三甲氧基矽烷混合，加入0.3mL去離子水，在110°C下反應13h，然後再用乙醇進行索氏提取24h，除去未反應的矽烷試劑，在80°C下乾燥，得到第二產物。
[0106]取製得的第二產物與質量濃度為8%的戊二醛溶液150mL在60°C條件下反應6h，過濾，並用乙醇洗滌除去未反應的戊二醛，得到第三產物。
[0107]用pH為7.2磷酸鹽緩衝液將穀氨醯胺轉氨酶(EC2.3.2.13)配成2g/L的穀氨醯胺轉氨酶溶液，取IOOmL穀氨醯胺轉氨酶溶液與Ig第三產物在冰浴下攪拌36h，過濾，再用PH為7.2磷酸鹽緩衝液衝洗，除去物理吸附的酶。最後經真空冷凍乾燥，得到第四產物，於4°C下保存。
[0108]取第一產物、第二產物、第三產物、第四產物採用實施例1相同的檢測方法進行檢測，得到的圖譜與實施例1提供的圖譜相似，結果表明第一產物為氧化後的活性炭、第二產物為矽烷化活性炭、第三產物為接枝戊二醛的活性炭、第四產物為固載化穀氨醯胺轉氨酶。
[0109]實施例11固載化漆酶的製備
[0110]將200mL質量百分濃度為20%的硝酸與5g椰殼活性炭進行混合，反應溫度為78°C，反應時間為4h，得到氧化後的活性炭。用去離子水將氧化後的活性炭煮沸lh，過濾，然後用去離子水洗滌，重複三次，直至硝酸全部衝洗乾淨，置於105°C下乾燥12h，得到第一產物。
[0111]150mL氯仿(二氯甲烷)作為溶劑，將3g第一產物在氮氣保護下與2mL的二乙烯三胺基丙基三甲氧基矽烷混合，加入0.4mL去離子水，在65°C下反應24h，然後再用乙醇進行索氏提取24h，除去未反應的矽烷試劑，在80°C下乾燥，得到第二產物。
[0112]取製得的第二產物與質量濃度為5%的戊二醛溶液150mL在50°C條件下反應8h，過濾，並用乙醇洗滌除去未反應的戊二醛，得到第三產物。
[0113]用pH為7.2磷酸鹽緩衝液將漆酶(EC1.10.3.2)配成3g/L的漆酶溶液，取IOOmL漆酶溶液與Ig第三產物在0°c下36h，過濾，再用pH為7.2磷酸鹽緩衝液衝洗，除去物理吸附的酶。最後經真空冷凍乾燥，得到第四產物，於4°C下保存。
[0114]取第一產物、第二產物、第三產物、第四產物採用實施例1相同的檢測方法進行檢測，得到的圖譜與實施例1提供的圖譜相似，結果表明第一產物為氧化後的活性炭、第二產物為矽烷化活性炭、第三產物為接枝戊二醛的活性炭、第四產物為固載化漆酶。
[0115]實施例12固載化脲酶的製備
[0116]將200mL質量百分濃度為25%的硝酸與5g椰殼活性炭進行混合，反應溫度為75°C，反應時間為3h，得到氧化後的活性炭。用去離子水將氧化後的活性炭煮沸lh，過濾，然後用去離子水洗滌，重複三次，直至硝酸全部衝洗乾淨，置於105°C下乾燥12h，得到第一產物。
[0117]150mL乙醇作為溶劑，將3g第一產物在氮氣保護下與2.5mL的二乙烯三胺基丙基三甲氧基矽烷混合，加入0.3mL去離子水，在78°C下反應12h，然後再用乙醇進行索氏提取24h，除去未反應的矽烷試劑，在80°C下乾燥，得到第二產物。
[0118]取製得的第二產物與質量濃度為5%的戊二醛溶液150mL在60°C條件下反應6h，過濾，並用乙醇洗滌除去未反應的戊二醛，得到第三產物。
[0119]用pH為7.2磷酸鹽緩衝液將脲酶(EC3.5.1.5)配成2g/L的脲酶溶液，取IOOmL脲酶溶液與Ig第三產物在50°C下10h，過濾，再用pH為7.2磷酸鹽緩衝液衝洗，除去物理吸附的酶。最後經真空冷凍乾燥，得到第四產物，於4°C下保存。
[0120]取第一產物、第二產物、第三產物、第四產物採用實施例1相同的檢測方法進行檢測，得到的圖譜與實施例1提供的圖譜相似，結果表明第一產物為氧化後的活性炭、第二產物為矽烷化活性炭、第三產物為接枝戊二醛的活性炭、第四產物為固載化脲酶。
[0121]實施例13固載化果膠酶的製備
[0122]將200mL質量百分濃度為15%的硝酸與5g杏核活性炭進行混合，反應溫度為80°C，反應時間為5h，得到氧化後的活性炭。用去離子水將氧化後的活性炭煮沸lh，過濾，然後用去離子水洗滌，重複三次，直至硝酸全部衝洗乾淨，置於105°C下乾燥12h，得到第一產物。
[0123]150mL乙醇作為溶劑，將3g第一產物在氮氣保護下與3mL2_氨乙基三甲氧基矽烷混合，加入0.4mL去離子水，在78°C下反應24h，然後再用乙醇進行索氏提取24h，除去未反應的矽烷試劑，在80°C下乾燥，得到第二產物。
[0124]取製得的第二產物與質量濃度為5%的戊二醛溶液150mL在60°C條件下反應6h，過濾，並用乙醇洗滌除去未反應的戊二醛，得到第三產物。
[0125]用pH為4.0磷酸鹽與檸檬酸緩衝液將果膠酶(3.2.1.15)配成2g/L的果膠酶溶液，取IOOmL果膠酶溶液與Ig第三產物在冰浴下攪拌36h，過濾，再用pH為4.0磷酸鹽與檸檬酸緩衝液衝洗，除去物理吸附的酶。最後經真空冷凍乾燥，得到第四產物，於4°C下保存。
[0126]取第一產物、第二產物、第三產物、第四產物採用實施例1相同的檢測方法進行檢測，得到的圖譜與實施例1提供的圖譜相似，結果表明第一產物為氧化後的活性炭、第二產物為矽烷化活性炭、第三產物為接枝戊二醛的活性炭、第四產物為固載化果膠酶。
[0127]實施例14固載化穀氨醯胺轉氨酶的製備
[0128]將200mL質量百分濃度為20%的硝酸與5g核桃核活性炭進行混合，反應溫度為80°C，反應時間為5h，得到氧化後的活性炭。用去離子水將氧化後的活性炭煮沸lh，過濾，然後用去離子水洗滌，重複三次，直至硝酸全部衝洗乾淨，置於105°C下乾燥12h，得到第一產物。
[0129]150mL甲苯作為溶劑，將3g第一產物在氮氣保護下與2mL的2-氨乙基三甲氧基矽烷混合，加入0.3mL去離子水，在110°C下反應13h，然後再用乙醇進行索氏提取24h，除去未反應的矽烷試劑，在80°C下乾燥，得到第二產物。
[0130]取製得的第二產物與質量濃度為8%的戊二醛溶液150mL在58°C條件下反應7h，過濾，並用乙醇洗滌除去未反應的戊二醛，得到第三產物。
[0131]用pH為7.2磷酸鹽緩衝液將穀氨醯胺轉氨酶(EC2.3.2.13)配成2g/L的穀氨醯胺轉氨酶溶液，取IOOmL穀氨醯胺轉氨酶溶液與Ig第三產物在冰浴下攪拌36h，過濾，再用PH為7.2磷酸鹽緩衝液衝洗，除去物理吸附的酶。最後經真空冷凍乾燥，得到第四產物，於4°C下保存。
[0132]取第一產物、第二產物、第三產物、第四產物採用實施例1相同的檢測方法進行檢測，得到的圖譜與實施例1提供的圖譜相似，結果表明第一產物為氧化後的活性炭、第二產物為矽烷化活性炭、第三產物為接枝戊二醛的活性炭、第四產物為固載化穀氨醯胺轉氨酶。
[0133]實施例15生物酶固載量及活力測定試驗
[0134]取實施例1至14製得的固載化酶，進行固載量及活力測定實驗。固載量測定實驗具體方法為:使用分光光度計法測定洗脫液的中酶的含量，酶的固載量可通過前後濃度變化計算出，計算公式為:酶的固載量=酶初始濃度X酶體積一酶終濃度X洗脫液體積。活力測定實驗具體方法為:測定反應前後反應底物的濃度差計算出酶活力:酶活力(u/mg) = (C0-C) V/tm，其中，C0是反應前底物濃度，C是反應後底物濃度，V是底物體積，t是反應時間，m是生物酶質量。測定結果如表1所示。
[0135]表1生物酶固載量及活力測定結果
[0136]
【權利要求】
1.一種矽烷化活性炭的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟: 獲得氧化後的活性炭； 在有機溶劑和水存在的條件下，所述氧化後的活性炭與矽烷偶聯劑發生矽烷化反應，即得； 以g/mL計，所述氧化後的活性炭與所述水的用量比為1: (0.05~0.2)。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述矽烷偶聯劑為二乙烯三胺基丙基二甲氧基矽烷、3-氨丙基二甲氧基矽烷、3-氨丙基二乙氧基矽烷、3-氨丙基甲基二甲氧基矽烷、3-氨丙基甲基二乙氧基矽烷或2-氨乙基三甲氧基矽烷中的一種或兩者以上的混合物。
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，以g/mL計，所述氧化後的活性炭與所述矽烷偶聯劑的用量比為1: (0.67~1)。
4.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述矽烷化反應為在63~120°C條件下進行矽烷化反應12~24h。
5.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述有機溶劑為甲苯、二氯甲烷、二甲基亞碸或乙醇中的一種或兩者以上的混合物。
6.—種固載化酶的製備方法,其特徵在於，如權利要求1至5中任一項所述的製備方法製得的矽烷化活性炭與戊二醛發生交聯反應，得到接枝戊二醛的活性炭，再與生物酶共價結合，即得。
7.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述交聯反應具體為在50~60°C的條件下交聯6~8h。
8.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述生物酶為脲酶、葡萄糖氧化酶、木瓜蛋白酶、過氧化氫酶、辣根過氧化物酶、漆酶、脂肪酶、葡萄糖異構酶、果膠酶、穀氨醯胺轉氨酶或α -澱粉酶。
9.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述共價結合具體為在O~50°C的條件下共價結合12~36h。
【文檔編號】C01B31/08GK103723725SQ201310749707
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月31日 優先權日:2013年12月31日
【發明者】熊春榮, 姜宏, 王磊, 李長久 申請人:海南大學