輸送物質的方法和裝置的製作方法

2023-05-26 08:39:01 1

專利名稱：輸送物質的方法和裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於磨擦皮膚的方法和裝置。更具體而言，本發明涉及一種磨擦角質層以促進物質經由皮膚輸送或取樣的方法。
背景技術：
通過皮膚將物質輸送給機體通常是侵襲性的，涉及使用針和注射器促進皮內(ID)、肌肉內(IM)或皮下(SC)注射。這些方法使對象產生疼痛，因而需要非常熟練的醫師的技術，而且還常常出血。已作出努力使用磨擦角質層(由角質化細胞形成的厚約10-20μm的薄外層)的裝置來克服這些缺點。將生物活性物質輸送給暴露的活表皮。
這種技術避開了神經網絡，將生物活性物質置於血管和淋巴腺附近，使物質吸收和輸送入機體。
對於疫苗的局部輸送，表皮本身是特別理想的靶標，因為它富含抗原遞呈細胞。與其相比，表皮下的真皮層含有較少的抗原遞呈細胞。此外，角質層和表皮不含有神經或血管，因此，上述方法在使疫苗到達能對抗原產生應答的皮膚層的同時具有基本上無疼痛和不出血的優點。
現有技術報導了用於破壞角質層以向機體輸送物質的各種裝置和方法。例如，如Carson等的美國專利5679647所述，可通過穿刺使角質層破裂。這件專利提出，使用小直徑的尖頭，如結核菌素皮膚試驗和變態反應試驗裝置中使用的那些尖頭，可將使其包塗上多核苷酸或寡核苷酸，用以將這些物質輸送給皮膚。使用這類裝置的方法涉及用這種尖頭穿刺皮膚，結果導致該包塗物質的皮內注射。
美國專利5003987、5879326和3964482提出通過切割使角質層破裂。
發明概述本發明涉及用於磨擦皮膚(具體是磨擦皮膚的角質層)的方法和裝置。本發明還涉及獲得樣品的方法，或者通過角質層上磨擦區域將物質如藥物或藥劑輸送給皮膚的方法。
待輸送的物質具體包括生物活性物質，包括藥劑、藥物、疫苗等。根據劑型和輸送方法，物質可以是固體或液體形式。它們尤其可以乾粉末、凝膠、溶液、懸浮液和膏狀物形式輸送。本領域技術人員熟悉合適的劑型。可採用本發明方法輸送的特別優選的藥物包括疫苗、變應原和基因治療劑。
本發明的一個方面涉及用於在皮膚製備輸送部位、以提高透過皮膚角質層將藥劑輸送給足夠深度(在那裡藥劑可被機體吸附和利用)的方法和裝置。
真皮組織提供了輸送疫苗和基因治療劑的一種具有吸引力的靶部位。對於疫苗(包括基因疫苗和常規疫苗)，皮膚是具有吸引力的輸送部位，因為皮膚組織中發現含有高濃度的抗原遞呈細胞(APC)和APC前體細胞，尤其是表皮的朗格漢斯細胞(LC)。設計了幾種基因治療劑，用於治療皮膚異常、皮膚病和皮膚癌症。在這些病例中，需要將治療劑直接輸送給受影響的皮膚組織。此外，皮膚細胞是基因治療劑的具有吸引力的靶標。這些基因治療劑編碼的蛋白質在遠離皮膚的部位有活性。這樣的病例中，皮膚細胞(如角質細胞)可起到「生物反應器」(bioreactor)的作用，通過乳頭真皮(papillary dermis)產生快速吸收入循環系統中的治療性蛋白質。在其它情況下，治療遠離皮膚的疾病需要使疫苗或治療劑直接進入與全身循環。在這種情況下，可通過乳頭真皮實現藥物的全身分布。
本發明提供一種方法和微磨擦裝置，用於磨擦與輸送生物活性物質(包括但不限於核酸、胺基酸、胺基酸衍生物、肽或多肽)至相關的皮膚。已發現，在磨擦角質層的同時輸送核酸，該核酸能顯示出增強的基因表達，和導致對表達的蛋白質增強的免疫應答。類似地，在磨擦的同時輸送變應原也產生比常規的變應原測試方法更強的免疫應答。
在一個優選的實施例中，本發明包括一種將物質輸送給皮膚的微磨擦器，該微磨擦器具有一個基底和一磨擦面(abrading facet)。在該磨擦面上附著、固定或整合有一磨擦表面(abrading surface)和一手柄連接面，該磨擦表面排列著微突出(microprotrusion)，這些微突出具有至少一個刮擦嵴(scraping edge)，而該手柄連接面連接、固定或整合有手柄或其它抓具。「磨擦表面」指在磨擦時呈給皮膚的表面，包含微突出、微突出之間的表面區域以及周圍的表面。
本發明還涉及將物質輸送給皮膚的方法，該方法包括在皮膚的一區域上橫向移動微磨擦器，產生足夠深度的溝，以使事先、同時或磨擦皮膚後給予的物質被預定的皮膚層攝取。使用本發明的微磨擦裝置在皮膚上橫向來回多次，可在皮膚上產生逐漸加深的溝，從而使物質能輸送給所需的皮膚深處。
附圖描述

圖1A是優選實施例手柄端的上視圖。
圖1B是微磨擦器優選實施例的側視圖。
圖2A是圖1A和1B的微磨擦裝置的透視圖。
圖2B是圖1B的微磨擦裝置的橫截面圖。
圖3是圖1A、1B、2A和2B的微磨擦器在對象皮膚上所產生的磨擦表面的側視圖。
圖4是圖3實施例中的磨擦表面的透視圖。
圖4A是磨擦器表面的橫截面側視圖。
圖5是圖3實施例的磨擦器表面的仰視圖。
圖6是皮膚上磨擦產生的溝部分截面的透視圖。
圖7闡述了實施例1中測試的採用各種核酸輸送方案獲得的報導基因活性的水平。
圖8闡述了實施例2所述的通過改變磨擦次數獲得的皮膚中報導基因的活性。
圖9闡述了實施例3所述的通過改變核酸製劑和輸送方案獲得的皮膚中報導基因的活性。
圖10闡述了實施例4所述的在輸送編碼B肝病毒表面抗原(HBsAg)的質粒DNA後的血清抗體應答。
圖11闡述了採用結核菌素試驗注射技術(組1A)、本發明的塑料微針頭陣列(組2A)、壓於皮膚上並刮出大約0.06cm2面積的尖頭裝置(組3A)、壓於皮膚上並橫向移動約1cm2面積的尖頭裝置(組4A)、壓於皮膚上然後移開的尖頭裝置(圖5A)、以液滴形式直接施加於刮過的皮膚上的質粒DNA(圖6A)，經報導基因處理後大鼠的皮膚樣品中的平均螢光素酶活性(±SEM)。
圖12顯示使用本發明的塑料微針頭陣列(組1B)、刮一次皮膚約0.06cm2面積的尖頭裝置(組2B)、刮多次產生約1cm2刮擦面積的尖頭裝置(組3B)、壓於皮膚上然後移走的尖頭裝置(圖4B)，施加組胺並磨擦斷奶豬皮膚後的皮膚反應。各組中，數字1-5是重複的；「C」是對照，其中未磨擦就使用組胺。
圖13顯示，在減去無組胺僅使用該裝置觀察到的腫脹測量值之後，圖12所示各組的組織腫脹的相對面積。
圖14和15比較了經塑料微磨擦器和矽微磨擦器處理的皮膚的跨表皮水分損失(Trans Epidermal Water Loss，TEWL)。
圖16闡述了使用塑料微磨擦器和矽微磨擦器輸送編碼報導基因的質粒DNA後皮膚中報導基因的活性。
圖17比較了使用塑料微磨擦器和矽微磨擦器輸送編碼HBsAg的DNA質粒後的血清抗體應答。
圖18闡述了給予編碼流感病毒血凝素(HA)的DNA質粒(裸質粒)後血清的抗體應答。
圖19闡述了給予編碼流感血病毒凝素(HA)的DNA質粒(質粒+佐劑)後血清的抗體應答。
圖20闡述了用編碼流感HA的裸質粒DNA初次免疫，再用滅活的流感全病毒加強免疫後血清的抗體應答。
圖21闡述了用編碼流感HA的質粒DNA和佐劑初次免疫，再用滅活的流感全病毒加強免疫後血清的抗體應答。
圖22闡述了給予狂犬病病毒的滅活疫苗後血清的抗體應答。
圖23闡述了採用實施例11a所述的輸送方案給予HBsAg後血清的抗體應答。
圖24闡述了給予HbsAg後T-細胞的增殖反應。
圖25闡述了針對腺病毒載體編碼的黑素瘤疫苗的細胞免疫應答。
發明的詳細描述本發明涉及用於磨擦角質層以提高給予的物質透過患者皮膚的角質層的裝置和方法。
在本文中，術語「磨擦」指除去角質層的至少一部分，以增加皮膚的滲透性，但不引起過多的皮膚刺激或不導致皮膚對感染因子的屏障作用受損。這與「穿刺」不同，穿刺可產生透過角質層的分散的孔，各孔之間存在未受破壞的角質層區域。
本發明的微磨擦器是一種能磨擦皮膚以獲得所述結果的裝置。在優選的實施例中，該裝置能磨擦皮膚，從而深入角質層而不將其穿透。在一個優選的實施例中，此微磨擦器還含有有效量的待輸送物質。該物質可包含在如貯存器中，該貯存器整合於該微磨擦器，或者是該微磨擦器的可取下部分，或者可將該物質包塗在該微磨擦器的輸送表面上。物質的「有效量」指將在對象中引起所需的反應的量，包括但不限於在變應原或疫苗情況下引起免疫刺激或免疫調節反應，或者其它治療性或診斷性反應。
在本文中，「深入」(penetrating)指進入角質層，但不完全穿透角質層和進入毗鄰層。這並不是說角質層不能完全被穿透以暴露出皮膚下層的界面。另一方面，穿透(piercing)指完全穿過角質層並進入角質層以下的毗鄰層。
據信，本發明的微磨擦裝置在輸送疫苗時具有潛在的增加疫苗臨床價值的獨特免疫學優點。認為多個微突出深入角質層可能具有佐劑樣的刺激效果。據信，多個微突出產生的「深入」反應要高於簡單的急性炎症反應。這些「深入」效果能引起各種細胞和細胞結構的損傷，導致多形核嗜中性白細胞(PMN)和巨噬細胞的出現以及IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)和其它因子的釋放，從而可引起許多其它免疫學反應。這些可溶性刺激因子影響著淋巴細胞的增殖，而且是針對疫苗免疫應答的中心環節。此外，這些因子影響常駐的抗原遞呈細胞(包括朗格漢斯細胞和樹突細胞)的遷移和激活。本發明的微磨擦器在促進磨擦區域中針對疫苗的顯著免疫應答方面頗有價值。據信，經微突出陣列在磨擦區域上產生的溝槽和溝，與在無磨擦時局部給予疫苗或用標準的針頭給予疫苗時相比，能增加與抗原遞呈細胞相互作用的疫苗抗原的可利用度。
據信，本發明的微突出陣列能將單一針刺微不足道或不合理的免疫刺激影響放大好幾倍。微磨擦器通過與佐劑樣免疫刺激可促進和增強疫苗的免疫原性。
皮膚最基本屏障特徵，包括對藥物、疫苗和基因治療劑輸送的抵制，在於表皮的最外層，即角質層。表皮內層通常包括三層，稱為粒層、表皮生發層和生發層。一旦藥物或其它物質出現在角質層下，必然不會遇到抵抗而擴散到皮膚隨後的各層，最後被細胞攝取或透過血流或淋巴引流(lymphaticdrainage)而被機體吸收。
幫助物質透過角質層可能是一種促進某些物質尤其是某些疫苗被機體吸收的有效方法。本發明主要涉及促進物質尤其是生物活性物質或藥劑輸送給或通過角質層的裝置和方法，以使患者能更快速、較大量地吸收生物活性物質或藥劑。
較佳的是，本發明的裝置能深入但不穿透角質層。可在磨擦前、磨擦的同時或磨擦後採用本發明方法將待給予的物質施加給皮膚。但是，根據本發明方法的一個實施例，在磨擦前或磨擦的同時給予皮膚某些或者特定的生物活性物質，而不是將它們施加給先前磨擦的皮膚。這些物質包括核酸、變應原和病毒活疫苗。即，當某些物質如核酸、變應原和病毒活疫苗通過磨擦進入皮膚而非被動地施加給事先被磨擦的皮膚上時，它們的輸送得到提高。但是，在本發明方法的另一實施例中，當將某些或特定的生物活性物質(包括病毒樣顆粒和亞單位蛋白質)施加到預先磨擦的皮膚上時，它們的輸送也得到提高。但是，在本發明方法的其它實施例中，某些或特定生物活性物質，包括滅活或殺死的病毒，不論在磨擦之後給予還是在磨擦的同時給予皮膚，它們都顯示出類似的效果。
物質可以任何藥學上可接受的形式輸送給皮膚。在一個實施例中，將物質施加到皮膚上，然後在皮膚和該物質上移動磨擦裝置或反覆磨擦皮膚。較佳的是，使用最少量的磨擦產生所需的結果。被選物質的適當磨擦量的測定在本領域技術人員所掌握的知識範圍之內。在另一實施例中，在使用前，可以乾燥的形式將物質施加到輸送裝置的磨擦表面上。在此實施例中，將重建液體施加到皮膚上的輸送部位，在該重建液體部位的皮膚上使用包塗有物質的磨擦裝置，然後在皮膚上反覆移動或磨擦，這樣可使物質溶解於皮膚表面上該重建液體中，並在磨擦的同時被輸送。或者，可將重建液體裝在磨擦裝置中，並在使用該裝置磨擦皮膚時釋放以溶解此物質。已發現某些物質，如核酸製品，也可以凝膠的形式被包塗在此磨擦裝置上。
用於將物質輸送給患者皮膚的方法包括用藥劑或其它物質包塗患者皮膚外層或微磨擦器2(參見圖1B)，然後在患者的皮膚上橫向移動微磨擦器2，進行磨擦以產生足夠的溝槽，使物質能夠進入患者的活表皮。由於微磨擦器2的結構設計，其前緣首先刮擦患者的皮膚，然後微磨擦器2的頂部表面磨擦外層保護性皮膚層，將角質層打開，從而使藥物或其它物質進入患者體內。對外層保護性皮膚層進行的最初磨擦之後，微磨擦器2的尾部和前緣可磨擦該磨擦區域的表面，使藥物或物質進入已磨擦的皮膚區域，從而提高其藥效。
如圖1B、2A和2B所示，微磨擦器2包括基底4，在該基底上可固定磨擦表面5。或者，磨擦表面可與該基底整合，製作成單一的兩組件部件。較佳的是，基底4是固體模塊。在一個實施例中，基底4被製作成蘑菇形的花冠4b，該花冠上部成曲面形，並在頂部被截短。基底4的頂部通常是平的，磨擦表面5被固定在其上或與其整合在一起。或者，該截短頂部具有接納磨擦表面5的凹室。在所有的實施例中，磨擦表面5包括具有微突出陣列的平臺，該平臺延伸到該截短頂部的上面。在微磨擦器的另一例子中，手柄、基底和磨擦表面可相互整合在一起，製成單一的三組件裝置。
通過在對象的皮膚上以足以使磨擦表面5打開該對象的外層保護性皮膚層或角質層的壓力移動微磨擦器2而給對象施用微磨擦器2。施加於基底的向內壓力使微磨擦器2壓到對象的皮膚內。因此，較佳的是，當施用微磨擦器2時，滑動的蘑菇形花冠4b的高度應足以防止所施加的物質流出以及流到表面4c上。如下文將描述的，磨擦表面5含有微突出陣列。
手柄6附著於基底4上，或者可與基底4整合在一起。如圖2A所示，手柄的上端6a可以是基底4的內圓周側壁4a之間的搭扣配合(snap fit)，也可以是磨擦配合(friction fit)。或者，如圖1A和2A所示，可而將手柄6膠合(如環氧化)到基底4的下部4c。或者，將此手柄和基底製成(如注模)單一的兩組件部分。手柄的直徑可以小於基底的直徑，或者與基底的直徑類似。基底4的下部4c可以與該蘑菇形花冠4b齊平，或者伸出該蘑菇形花冠。手柄6的下端6b可比其軸6c寬，或者其直徑可與軸類似。下端6b可包括壓痕6d，用於讓給予物質的人擱拇指和移動微磨擦器2。此外，在手柄6的外側形成突出8，以幫助使用者在抵緊患者皮膚或在其上移動時牢固地抓緊手柄6。
如圖1B和2B的截面圖所示，下端6b可以是圓柱形的。微磨擦器2可由透明的材料製成(如圖2A所示)。壓痕6d被放置在圓柱形下端6b的兩側，以幫助使用微磨擦器2的人抓牢微磨擦器。即，微磨擦器2的移動可通過手或手指進行。微磨擦器的手柄6以及基底4較佳由塑料等材料鑄模製成。微磨擦器2較佳以便宜的價格製造，這樣在將其使用於一個患者後可將整個微磨擦器和磨擦表面丟掉。
設計磨擦表面5，使得在患者皮膚上橫向移動微磨擦器2時，其所產生的磨擦能深入角質層。磨擦表面5可用待輸送給患者活表皮的藥物或物質包塗。
為了獲得所需的磨擦，微磨擦器2應在患者的皮膚上移動至少一次。可沿交替的方向磨擦患者的皮膚。本發明微磨擦器的結構設計使得藥物或物質能更有效地被吸收，從而節約了施加給患者的皮膚或者包塗於磨擦表面5的藥物或物質。
磨擦表面5可以包塗有需要輸送給患者的物質。在一個實施例中，物質可以是放在磨擦表面5上的粉末。在另一實施例中，在患者皮膚上應用和移動微磨擦器2前，可直接將待輸送的物質施加於患者的皮膚上。
結合圖3，本發明的微磨擦裝置10包括基本上平坦的具有大量微突出14的基體或磨擦表面支撐面12，該微突出14從支撐面的底部表面伸出。通常，支撐面的厚度足以使得磨擦表面附著於微磨擦裝置的基底上，從而使得該裝置易於操作，如圖1B、2A和2B所示。或者，可將不同的手柄或抓握裝置附著於或整合到該磨擦表面支撐面12的頂部表面。磨擦表面支撐面12的尺寸可以根據微突出的長度、給定面積中微突出的數量以及要輸送給患者的物質的量而改變。通常，磨擦表面支撐面12具有約1-4cm2的表面積。在優選的實施例中，磨擦表面支撐面12具有約1cm2的表面積。
如圖3、4、4A和5所示，微突出14從磨擦表面支撐面12的表面凸出，基本上垂直於磨擦表面支撐面12的平面。在所述實施例中微突出被排列成許多排和列，較佳的是，它們間隔均一的距離。微突出14通常為錐形，其邊16延伸到頂18。從橫截面看，所示的邊16通常為凹形，形成一曲線表面，從磨擦表面支撐面12延伸到頂18。在所述的一個實施例中，微突出由4條形狀和尺寸基本上相等的邊16形成。如圖4A和5所示，微突出14的各邊16具有與毗鄰邊相鄰的相對的邊嵴(edge)，形成了從磨擦表面支撐面12向外延伸的刮擦嵴22。刮擦嵴22限定了通常為三角形或梯形的刮擦表面，對應於邊16的形狀。在另一實施例中，微突出14可由較少的或較多的邊形成。
較佳的是，微突出14在鈍的頂部18終止。通常，頂18基本上是平的，且與支撐面14平行。當這些頂為平時，微突出的總長度不會刺破皮膚，因此，微突出的長度大於該微突出深入皮膚的總深度。頂18較佳形成一個界定清楚的尖稜20(edge)，在那它與邊16相遇。稜20基本上與磨擦表面支撐面12平行延伸，並界定了另一個刮擦嵴。在另一實施例中，稜20可以稍微是圓形的，以在邊16到頂18之間形成光滑的過度。較佳的是，微突出是截頭圓錐形或者是截頭金字塔形的(frustopyramidal)。
可用與所給予的物質不發生反應的塑料材料製備微磨擦裝置10和微突出。合適的塑料材料的非限制性名單包括，例如本領域已知的聚乙烯、聚丙烯、聚胺、聚苯乙烯、聚酯和聚碳酸酯。或者，可使用金屬，如不鏽鋼，鎢鋼，鎳、鉬、鉻、鈷、鈦合金或他們的合金，或其它材料如矽、陶瓷和玻璃聚合物製備微突出。可採用本領域已知的各種類似於矽晶片的照相平板印刷蝕刻技術，或者採用使用金剛石尖頭研磨機(diamond tipped mill)的顯微機械加工製造金屬微突出。也可採用本領域已知的標準技術通過矽晶片照相平板蝕刻技術製造微突出。還可通過注模法製造塑料微突出，例如可參見2002年7月12日提交的美國申請號10/193317中的描述，本文將其納入作為參考。
根據要給予的具體物質和要使用該裝置部位角質層的厚度選擇微突出的長度和厚度。較佳的是，微突出可深入角質層而基本上不刺破或穿透角質層。微突出可長達約500微米。合適的微突出的長度約為50-500微米。較佳的是，外側得體長約50-300微米，更佳的是約為150-250微米，最佳的是180-220微米。在闡述性實施例中，微突出通常為金字塔形，且與該裝置的平面垂直。這些形狀在確保產生所需深度的磨擦上具有特殊的優點。在優選的實施例中，微突出是實心的。在另一實施例中，微突出可以是空心的。
如圖2和5所示，微突出的排和列較佳均勻地隔開，以形成一陣列，用於在磨擦過程中接觸皮膚和深入角質層。微突出之間的間隔根據要給予皮膚表面或皮膚組織中的物質而改變。通常，以每毫米約2-10行的密度使微突出隔開。通常，各行和各列之間隔距離基本上等於陣列中各微突出之間的距離，以提供約每平方毫米約4-100個微突出的密度。在另一實施例中，可以圓形模式排列微突出。在又一實施例中，可以隨機排列微突出。當以行和列的方式排列時，微突出中心之間的距離較佳至少為微突出長度的兩倍。在一個優選的實施例中，微突出中心之間的距離為微突出的長度的兩倍±10微米。也包括更寬的距離，包括達到微突出長度的3、4、5倍以及更大倍數的距離。此外，如上所述，微突出的形狀可以為微突出的高度可以大於各突出深入皮膚的深度。
截頭圓錐形的或截頭金字塔形的平坦上表面的寬度通常為10-100微米，較佳為30-70微米，更佳為35-50微米。
在皮膚上製備輸送部位的方法包括將微磨擦器放置在患者皮膚28所需的位置上。使該微磨擦器輕輕壓在皮膚上，然後在皮膚上來回或橫向移動。微磨擦器劃一次(stroke)的長度可根據輸送部位的所需尺寸而改變，由所需的輸送區域確定。選擇輸送部位的尺寸，以獲得所期望的結果，該尺寸可根據要輸送的物質及其物質的形態而變化。例如，輸送部位可覆蓋治療皮疹或皮膚疾病的大區域。通常，微磨擦器移動約2-15釐米(cm)。在本發明的一些實施例中，移動微磨擦器，以產生表面積約為4-300平方釐米的磨擦部位。
然後從皮膚移開微磨擦器，暴露出磨擦區域，然後可將合適的輸送裝置、貼片(patch)或局部製劑施用到該磨擦區域。或者，可在磨擦前或在磨擦的同時將要給予的物質施用於該皮膚表面。
磨擦角質層的程度依賴於移動過程中所施加的壓力和微磨擦器的反覆磨擦的次數。在一個實施例中，在第一次磨擦後將微磨擦器移開皮膚，將其放回基本上相同的地方和位置的起始部位。然後以相同的方向第二次移動微磨擦器相同的距離。在另一實施例中，在第一次磨擦後，以交替方向在相同的部位上反覆橫向移動微磨擦器，而不使微磨擦器離開皮膚。通常，用微磨擦器進行兩次或多次磨擦。
在另一實施例中，僅以相同的方向，使微磨擦器以格柵樣模式、圓周模式或者其它一些模式磨擦角質層足夠時間，磨擦出合適的深度，以提高所需物質的輸送。微磨擦器在皮膚28上以一個方向進行的橫向線性移動除去了一些組織，形成溝槽26，這些溝槽被皮膚28中的峰27隔開，基本上對應於微突出的各行(如圖6所示)。微突出的稜20、嵴22和鈍頂18提供了刮擦或磨擦動作，而不是簡單的切割動作，結果除去了一部分角質層，在皮膚中形成溝槽或溝。微突出14的鈍頂18的稜20刮擦和去除溝槽26底部的一些組織，使得溝槽保持開放的狀態，從而使物質能進入溝槽而被機體吸收。較佳的是，微突出14具有足夠的長度，能深入角質層，並形成具有足夠深度的溝槽26，使施加於磨擦區域的物質被吸附，而不引起患者疼痛或不必要的不舒適。較佳的是，溝槽26不刺破，但能伸入角質層。金字塔形微突出14的嵴22形成從磨擦表面支撐面12延伸到頂18的刮擦嵴。鄰近該磨擦表面支撐面12的嵴22在刮擦和磨擦峰27(形成於溝槽26之間的皮膚)的微突出之間形成刮擦表面。在溝槽之間形成的峰27通常受到輕微地磨擦。
在又一實施例中，微磨擦器可在其支撐面上或者在微突出上或微突出之間包含一乾燥的或凍幹的藥劑。可施加乾燥的藥劑作為微突出上或微突出之間的溝谷中的覆蓋物。在磨擦皮膚過程中，該藥劑被轉移到皮膚的磨擦區域。可將微磨擦器維持在磨擦輸送部位上足夠長的時間，以使藥劑通過磨擦輸送部位進入表皮。可用膠帶或貼片縛住微磨擦器，從而將其貼附在皮膚上。較佳的是，採用上述方法將微磨擦器貼附在磨擦輸送部位，藥劑在該部位被動地輸送，而不需使用稀釋劑或溶劑。
在另一實施例中，可通過支撐面上的開口將合適的溶劑或稀釋劑如蒸餾水或鹽水溶液注入，以在微磨擦器貼附於輸送部位時溶解和重建該藥劑。可用注射器或其它容器注射溶劑或稀釋劑，或者使它們裝在為微磨擦裝置的整合部分的貯存器中。
較佳的是微突出被均勻地隔開，形成一陣列，並具有基本上均一的長度和寬度。在另一個實施例中，微突出具有不同的長度，以不同深度深入皮膚。改變微突出的長度將使得物質在皮膚中沉積不同的深度，可提高輸送的效率。
如果磨擦裝置不包括容納和排放液體的貯存器，則必須在磨擦前或後將含有物質的液體或重建液體用如別處的分配器或泵分別施加到皮膚上。但是，貯存器可以是磨擦裝置的整合部分。較佳的是，貯存器與裝置或皮膚的磨擦表面有液體相溝通，例如通過貫通針頭或突出物的管道，或者這些針透或突出物之間排出貯存液的通道，或者通過多孔材料，或者使貯存器鄰近磨擦表面。在此實施例中，將物質或重建液體裝在磨擦裝置的貯存器中，並在磨擦之前、磨擦的同時或者磨擦後分配給皮膚表面。磨擦裝置還可包括能控制物質或重建液體的輸送速率、或者能控制輸送物質或重建液體的量的裝置。作為另一選擇，可在磨擦之後將乾燥的或預先溼潤的貼片施用於部位上，以促進重建，或增強皮膚對物質的引入或攝取。在另一實施例中，貼片可含有藥劑，且可被施用於經微磨擦裝置預處理的皮膚。
用於本發明方法的核酸可以是RNA或DNA。核酸可以是適合局部給藥或被細胞攝取和表達的任何物理形態。可將核酸包含在病毒載體、脂質體、顆粒、微米顆粒、納米顆粒或本領域已知的其它合適的製劑中。或者可以游離的多核苷酸(如本領域已知的質粒)輸送核酸。通常將核酸配製成藥學上可接受的製劑，如與核酸相容的液體或凝膠。用於本發明的藥學上可接受的製劑，包括疫苗和變應原組合物的製劑，也是本領域已知的。
已發現，最小程度的磨擦(小至在皮膚上通過一次)足以提高核酸向皮膚細胞的輸送。核酸輸送和表達的量隨著皮膚磨擦次數的增加而持續增加。在實驗動物研究中，六次或更多次的磨擦產生核酸輸送的最大改進。雖然皮膚上所有的磨擦通過(pass)可以相同方向進行，但較佳的是，在磨擦過程中可改變方向。目前最常用的輸送核酸疫苗的方案是IM注射。採用這種方案，當劑量低時，通常需要其它的反應增強劑。採用本發明方法輸送的核酸疫苗的合適劑量的確定屬於本領域熟練的技術人員所掌握的知識範圍之內。如免疫應答的基因表達和刺激水平所證明，本發明方法的一個優點是，即使沒有反應增強劑，核酸疫苗的輸送仍比IM輸送更有效。
也可採用本發明的裝置和方法局部輸送胺基酸、胺基酸衍生物、肽和多肽，尤其是變應原。通常使用類似於結核菌素劃痕實驗的裝置進行皮內穿刺輸送變應原。但是，出乎意料地發現，通過同時磨擦和輸送可獲得增強的變應原性應答。這產生一種更敏感的測試，優點是可採用本發明的方法更容易地檢測針對到常規變應原測試的最小的或難以察覺的應答。因而，與採用本領域先前已知的劃痕裝置相比，本發明的裝置和方法具有更好的性能和更少的皮膚刺激和紅斑(erthyma)。輸送疫苗和其它藥劑的其它合適的磨擦器包括1999年9月24日提交的美國專利申請09/405488中公開的磨擦器。應明白，磨擦器的表面區域的大小和形狀、針頭或突出物的形狀和模式可根據要輸送的具體疫苗或其它製劑以及其它因素(如應用的簡易程度和效果)而變化，這些變化也在本領域熟練的技術人員所掌握的知識範圍之內。
通常，為了採用本發明給予疫苗或其它藥劑，醫生將用注射器從用隔片密封的小瓶中取出適量體積，用微磨擦器磨擦前或後將疫苗或藥劑施加給皮膚。這種方法將導致每次給藥使最小程度使用注射器針頭和微磨擦器以及劑量測量所需的時間和注意力。因此，理想的是，提供一試劑盒，該試劑盒包括微磨擦裝置和待輸送物質的組合，或者將待輸送的物質裝在微磨擦裝置中。
含有給予器具和治療性組合物的試劑盒等是本領域技術人員周知的。但是，用於輸送藥物和疫苗的最小侵入性微磨擦裝置的應用清楚地提出了將裝置和製劑相結合的迫切需要，以提供安全、有效、經濟和相容的反覆，用於給予引起免疫原性或其它治療性應答的製劑。
本發明提供的試劑盒含有至少一個具有磨擦表面的微磨擦器輸送裝置，其中，所述磨擦表面包括凸出並以某種模式排列的微突出，且其中所述微突出包括至少一個刮擦嵴。試劑盒中包含的微磨擦器輸送裝置可以是完全整合的，即，包括適合接受或與所述磨擦表面整合的面、手柄連接面以及與所述基底整合或可分離的手柄。裝有疫苗或其它藥劑的貯存器以及影響輸送的裝置也可被整合到輸送裝置中。或者，試劑盒可僅含有微磨擦器可任意使用的部分(如磨擦表面和藥劑)和可再使用的部分，如另外提供的手柄和連接面。這些試劑盒可包括例如多個可貼附的磨擦表面和適用於大量接種的多劑疫苗，手柄和連接面(任選地少量)可另外提供。或者，試劑盒可含有一個或多個完全是「一次性」的微磨擦裝置，包括「一次性使用和丟棄」形式的磨擦表面、連接面和手柄。在一個優選的實施例中，試劑盒還包括用於包裝、測量和/或輸送單劑疫苗或其它藥劑的裝置。在一個特別優選的實施例中，試劑盒還包括有效劑量的疫苗或其它藥劑，這些疫苗或其它藥劑任選地包裝在整合於或者能功能性附著於該輸送裝置的貯存器中。或者，可在包裝於也含有磨擦裝置的試劑盒中的貼片中提供疫苗或其它藥劑。在此實施例中，磨擦裝置首先被用於處理皮膚，然後將貼片施用於處理的皮膚部位上。
在一個特別優選的實施例中，本發明的試劑盒裝有包塗了有效量的待給予藥劑或疫苗的微磨擦器。物質的「有效量」或「有效劑量」指能在對象中引起所需的應答反應的量，包括但不限於在變應原或疫苗情況下引起免疫刺激性反應或者其它治療性或診斷性反應。
為了使用本發明的試劑盒，醫生將打破密封(hermetic seal)，以提供取出微磨擦裝置以及任選的疫苗或免疫原性或治療性組合物的途徑。可預先將組合物加到微磨擦裝置中的貯存器或另外的施加裝置中，該組合物可以是任何形式，包括但不限於凝膠、糊狀物、油、乳液、顆粒、納米顆粒、微米顆粒、懸浮液或液體，或者以合適的劑量包塗在微磨擦裝置上。可將組合物分別包裝在試劑盒包中，例如，包裝在貯存器、小瓶、管、小袋、貼片等中。可將製劑的一種或多種組分凍幹(lyophilized)、冷凍乾燥(freeze-dried)、噴霧冷凍乾燥，或者將其製成任何其它可重建的形式。如果需要，還可進一步提供各種重建媒介、清潔劑或消毒劑，或者局部殺菌劑(酒精擦拭紙(alcohol wipes)、碘酒)。然後，醫生將在磨擦之前或之後將該製劑施加到患者的皮膚上，或者，在預先加樣或預先包塗的微磨擦裝置的情況中，醫生實施該磨擦步驟而不需要另外施加藥劑。
實施例1用微磨擦裝置輸送編碼報導基因的質粒DNA用標準的30g針頭和1cc注射器，通過IM注射或ID注射給予麻醉的BALB/c小鼠編碼螢火蟲螢光素酶的質粒DNA(35μg)；或者使用包括磨擦表面的微磨擦裝置局部給予，該磨擦表面由200毫米長的截頭圓錐體形矽微突出組成(如圖4所示)。將磨擦表面安裝到微磨擦裝置上，如圖1和2所示。
採用以下兩個方案，使用微磨擦裝置給予DNA1)同時磨擦和輸送(ABRdel)使用電動剃鬚刀剃掉小鼠尾背部上的毛，接著用10號解剖刀片除去殘留的毛髮。然後在皮膚表面1平方釐米大小的部位上施加DNA溶液，並使微磨擦裝置的磨擦表面與該溶液接觸，然後側向移動該微磨擦裝置，以交替的方向(alternating direction)在皮膚表面上移動6次(各方向通過3次)。使該DNA溶液留置在空氣中乾燥，不覆蓋皮膚，直到獲得皮膚活檢組織。
2)預磨擦(preABR)在如上述剃毛後，在皮膚表面上以交替方向(兩個方向，各通過3次)側向移動微磨擦裝置6次，預磨擦1平方釐米的部位。然後將DNA溶液塗覆在磨擦的皮膚表面上，如上所述留置在空氣中乾燥。
作為DNA可能通過毛囊或剃毛過程產生的劃痕而輸送的對照，如上述給動物剃毛，但是不使用微磨擦裝置磨擦(noABR)。將DNA溶液局部施加到1平方釐米的剃毛皮膚部位上，留置於空氣中乾燥。
在所有組中，給予DNA後24小時收集組織樣品。使用發光試驗分析組織勻漿的螢光素酶活性。如採用標準BCA蛋白試驗所測定的，所有樣品都根據總蛋白含量歸一化。數值以每毫克總蛋白的相對光單位(RLU)表示，結果顯示於圖7中。各標記代表單只小鼠的反應。顯示了兩個分開實驗獲得的累積數據(每組n＝6)。ABRdel獲得的螢光素酶報導基因活性的水平在數量級上類似於基於針頭的IM和ID注射，明顯高於局部輸送給預磨擦或未磨擦的皮膚上所獲得的水平(p＝0.02)。
實施例2輸送與磨擦通過(passes)次數的關係如實施例1所述通過ABRdel給予螢光素酶質粒DNA(35μg)，但微磨擦裝置在皮膚上橫向通過的次數不同(12、10、6、4和2次)。此外，將DNA溶液加到剃毛但未磨擦的皮膚表面上後，反覆將微磨擦裝置的磨擦表面壓在皮膚上(6次)，以刺激穿刺介導的輸送。還包括在無磨擦情況下局部給予DNA溶液(noABR)，作為DNA可能通過毛囊或劃痕進行輸送的對照。應用24小時後收集皮膚活檢組織(1cm2)，如實施例1所述檢測螢光素酶活性。
結果如圖8所述。各標記表示單只小鼠的反應。每組n＝3，但「x12」和「x6」中的n為5。隨著微磨擦裝置在皮膚表面上通過次數的增加，基因表達的水平也增加。在經6次或更多次磨擦處理的組中，表達的平均水平大於noABR對照1000-2800倍以上。在微磨擦裝置在皮膚表面上通過4、2或1次後得到的平均應答分別高出背景約300、200和30倍。「穿刺(puncture)」組的平均表達水平僅僅高於背景2倍，且與noABR對照沒有顯著差別。
這些數據證明，磨擦步驟是局部輸送DNA到皮膚中的步驟。增加微磨擦裝置的磨擦通過次數，可獲得增加的基因表達水平，雖然在單次通過後也觀察到基因表達。此外，與反覆使微磨擦裝置壓在皮膚上而無橫向磨擦相比，橫向磨擦或磨損皮膚顯著地增加了核酸輸送和基因表達。
實施例3質粒DNA的製劑通過ID注射或通過同時磨擦和輸送(「ABRdel液體」)給予液體製劑形式的螢光素酶質粒(35μg)，其中如實施例1所述微磨擦裝置在皮膚表面上通過6次。此外，將DNA凍幹成粉末，將其包塗在微磨擦裝置的磨擦表面的表面上，並在同時磨擦和輸送中以粉末形式(「ABRdel粉末」)直接給予，或在使用時用PBS緩衝液重建後(「ABRdel粉末/重建」)給予。使粉末包塗的磨擦表面直接與皮膚表面上的PBS液滴接觸，接著同時磨擦和輸送，從而實現重建。微磨擦裝置的磨擦表面還包塗有溶於0.5％瓊脂糖凝膠的DNA，通過如上所述同時磨擦和輸送的方式給予(「ABRdel凝膠」)。以無磨擦情況下(noABR)局部應用液體製劑為對照。應用後24小時收集皮膚活檢組織(1cm2)，如實施例1所述進行分析。結果列於圖9中。各標記代表單只小鼠的應答。顯示了從兩個分開的實驗獲得的累積數據，其中各組的n＝6。在ID注射組、ABRdel液體組和ABRdel粉末/重建組中觀察到皮膚中類似的螢光素酶表達水平(高於noABR組約20-30倍)。雖然直接用凝膠或粉末包塗的DNA直接輸送而不重建導致的基因表達在統計學上不高於noABR對照，但是基於凝膠的直接輸送而產生的應答仍高於對照平均應答約2-10倍。這些結果證明，在同時磨擦和輸送時重建乾燥形式的疫苗能產生相對於同時磨擦和輸送液體製劑的效果。這對於商業應用此方法是有利的，因為帶有裝滿液體的貯存器的磨擦裝置可預先包塗有在磨擦時用來重建疫苗的疫苗粉末。
實施例4通過微磨擦裝置輸送B肝DNA疫苗後的抗體應答使用標準的30g針頭和1cc注射器，通過IM或ID注射給予麻醉的BALB/c小鼠編碼B肝表面抗原(HBsAg)的質粒DNA，或者如實施例1所述，根據實施例1的ABRdel方案，使用微磨擦裝置給予。小鼠共免疫3次，每劑100μg。每次免疫2-3周後採用ELISA分析血清樣品中針對HBsAg的抗體(總Ig)。將DNA局部施加給剃毛但未磨擦的皮膚(noABR)作為可能的通過劃痕或毛囊輸送的對照。數據表示為抗-HBsAg滴度，定義為產生至少高於背景(從天然未免疫小鼠獲得的血清)3倍吸收值的血清樣品的最高稀釋度。
分析了每組共10隻小鼠。平均滴度表示為圖10中的棒(bar)，每隻小鼠的應答以空心記號表示。結果表明，根據ABRdel方案使用微磨擦裝置給予DNA疫苗在體內誘導了強烈的血清抗體。這些應答的數量級明顯大於通過IM(目前DNA疫苗輸送的標準方法)和ID注射誘導的應答(在第2和3次免疫後p＜0.05)。此外，ABRdel組中的應答的變化與通過標準的基於針頭的注射途徑所觀察到的結果相比相當地小。ABRdel組在3次免疫後獲得的平均滴度為12160，而IM注射為820，ID注射為4800。很明顯，在兩次免疫後，ABRdel方法是最有效的輸送途徑，100％的ABRdel處理動物(10/10)在兩次免疫後都發生了血清轉變，與其相比，IM途徑為40％(4/10)，而ID注射為50％(5/10)。在無磨擦情況下局部給予質粒DNA的動物沒有產生可檢測的抗體應答。抗體同種型的進一步特徵分析表面，根據ABRdel方案使用微磨擦裝置給予DNA疫苗誘導了與標準的基於針頭的IM和ID注射類似的混合應答，由IgG1和IgG2a兩者組成。這些結果與先前描述的使用基因槍進行的表皮疫苗接種獲得的結果相反，後者的抗體應答僅由IgG1組成，而無IgG2a(如參見McCluskie，MJ等，分子醫學，5287，1999)。此外，如採用抗原特異性細胞毒T細胞刺激所測定的那樣，通過微磨擦器輸送質粒DNA誘導了強的細胞免疫應答。
實施例5通過微磨擦裝置輸送變應原如實施例1所述，使用微磨擦裝置，通過同時進行磨擦和輸送向麻醉的豬皮膚給予二鹽酸組胺(2.5mg)(ABRdel；裝置在皮膚表明上通過4次)。將組胺配製成液體或者凍於粉末，將其包塗在磨擦表面的表面上，使用時直接在皮膚上用水重建。作為比較，使尖頭樣裝置與組胺溶液接觸並用於刺穿皮膚後，立即將組胺溶液以液滴施加到皮膚表面。這種尖頭樣裝置由長1mm的七金屬34g針頭組成，與市售的用於變應原實驗的裝置類似。在無組胺的情況下用微磨擦裝置或尖頭樣刺穿裝置處理鄰近的皮膚部位，以監測由裝置而非組胺導致的皮膚反應。其它對照包括在無磨擦或穿刺情況下用組胺局部處理皮膚部位。監測皮膚部位的即時炎症反應，包括紅腫(redness)、腫脹、和出現風團和潮紅(wheal-and-flare)。
在經微磨擦裝置使用組胺處理的皮膚部位上觀察到強烈炎症反應。在經組胺處理的皮膚的整個區域上觀察到嚴重的紅斑和腫脹(凸出組織高達2mm)，而在無組胺情況下經裝置處理的部位只是沿著磨擦途徑呈現輕微的紅腫，完全沒有腫脹。用液體和重建的粉末組胺製劑都觀察到類似的強反應。用尖頭樣穿刺裝置進行組胺溶液處理的皮膚部位也呈現嚴重的紅斑和腫脹，雖然反應局限在尖頭接觸點及緊靠近這些點的周圍區域。在無磨擦或穿刺情況下用組胺溶液局部處理的皮膚部位沒有發炎，看起來與正常的未處理皮膚不可區別。
二鹽酸組胺在本領域中被用作評估肽和多肽變應原的模型系統。這些結果表明，所述的同時進行磨擦和輸送的方案能有效地用於局部給予變應原(這些變應原為胺基酸或胺基酸衍生物)，且能預見到輸送肽或多肽變應原也能獲得類似的結果。與皮膚穿刺相比，微磨擦輸送變應原的好處包括可將物質分布在更寬的皮膚表面區域中，從而與使用尖頭樣裝置穿刺獲得的局部分配相比，增加了反應原性(reactogenic)部位。與目前的基於尖頭的皮膚穿刺測試方法相比，分布面積增加以及高度免疫刺激性表面組織的更好靶向可提高變應原測試的敏感性。此外，通過靶向毛細血管床和外周神經網絡上的淺表皮組織，本發明的輸送有可能具有比目前的測試方法具有更小的侵入性，並更安全。
實施例5B為了闡述本發明與本領域(美國專利3289670)先前已知方法之間的區別，進行了大量的實驗。在第一組實驗(A組)中，採用各種方法將編碼螢火蟲螢光素酶報導基因的質粒DNA輸送給許多Brown-Norway大鼠，並記錄結果。A組實驗的結果顯示，本發明與其它方法相比能在基因表達方面提供意想不到的提高。在第二組實驗中(B組)，將二磷酸組胺輸送給許多斷奶雌性Yorkshire豬，並記錄下結果。B組實驗的結果顯示，本發明與其它方法相比能在變應原應答方面提供意想不到的提高。
A組實驗在這個組各實驗中，將20微克編碼螢火蟲螢光素酶報導基因的質粒DNA給予Brown-Norway大鼠，總體積為10微升。根據Mantoux氏注射技術，使用30號針頭和1cc注射器，將針頭平行插入皮膚表面，皮內輸送注射液。
在組2A中，如實施例1所述，根據ABRdel方案使用微磨擦裝置，但是使用塑料的磨擦表面替換矽磨擦表面。首先以液滴形式將DNA溶液施加到大鼠剃毛的皮膚上。然後將微磨擦裝置放到DNA溶液和皮膚上。之後，使用該微磨擦裝置同時磨擦皮膚和將DNA輸送給皮膚內。為磨擦皮膚，在皮膚上橫向移動微磨擦裝置4次(以交替的方向移動，各方向2次)，磨擦的面積大約為1-1.5cm2。採集處理部位的中心1cm2皮膚用於分析。
在組3A、4A和5A中，根據美國專利3289670的教導，使用由6個基本上相同的尖角元件簇組成的尖頭裝置(Greer Laboratories，Lenoir，NC，目錄號GP-1)，這些元件排成環狀，直徑大約為0.19cm。通過將尖頭浸入10μl的液滴給裝置加載質粒DNA溶液，通過毛細作用，所有的溶液基本上懸浮在尖角元件(尖頭)組成的簇之間。
在組3A中，將此尖頭裝置壓在皮膚上，橫向刮出約0.06cm2的區域，刮時小心不要使尖頭插入太深，以免扎出血來。將此裝置向前移動1/8英寸(0.3175cm)長，以提供面積約為0.06cm2的刮擦區。
在組4A中，將尖頭裝置壓在皮膚上，橫向刮出約1cm2的區域，刮時小心不要使尖頭插入太深，以免扎出血來。將裝置向前移動1cm的距離。然後，從皮膚上移開裝置，將其壓在鄰近該初始處理部位的皮膚上。再將裝置向前移動1cm的距離。重複此步驟，直至獲得全部的1cm2處理皮膚。
在組5A中，將尖頭裝置壓在皮膚上，小心不使尖頭插入過深而導致出血。不使用該裝置刮皮膚，而是在將其壓在皮膚上一次之後立即將其移開皮膚。
在組6A中，直接以液滴的形式將質粒DNA施加到大鼠剃毛的皮膚上。然後，使用移液頭(pipette tip)將液滴均勻散布到1cm2區域內，注意不要刮或磨擦皮膚。
輸送24小時後，切下含有各輸送部位的皮膚區域，將其勻漿，然後使用螢光素酶檢測系統(Promega，Madison，WI)進行螢光素酶活性檢測。為了說明各組間收集到的組織總量的差異，根據BCA檢測(Pierce，Rockford，IL)測得的組織樣品中總蛋白含量，將螢光素酶活性歸一化，並將其表達為每毫克總蛋白的相對光單位(RLU)。
圖11顯示了從使用上述裝置和方法處理的大鼠獲得的皮膚樣品中平均螢光素酶活性(每組n＝4)±該平均值的標準誤差。組1A的螢光素酶活性最強，為10720RLU/mg。使用微磨擦裝置輸送(組2A)也導致切下的皮膚樣品中產生強的螢光素酶活性(3880RLU/mg)。相反，與局部的對照組相比，使用尖頭裝置輸送增加很少的螢光素酶活性，甚至沒有增加。當使用尖頭裝置刮出大約0.06cm2的區域時，螢光素酶活性為237RLU/mg(組2A)，當刮出1cm2的區域時，螢光素酶活性為122RLU/mg(組3A)，當將裝置壓在皮膚上而無橫向移動時，螢光素酶活性為61RLU/mg(組5A)。在無輸送裝置的情況下(組6A)局部施用DNA質粒也沒有在皮膚中誘導明顯的螢光素酶活性(43RLU/mg)。
因此，採用如應用中所述的微磨擦裝置和輸送方法給予質粒DNA產生的報導基因活性水平，要高於採用美國專利3289670所述的尖頭裝置和輸送方法輸送後觀察到的水平達32倍。此外，使用本發明的微磨擦裝置輸送所獲得的報導基因活性，要高於使用美國專利3289670所述的尖頭裝置壓在皮膚上後輸送所觀察到的水平或者單獨的局部應用所觀察到的水平達90倍。除上述以外，採用組3A-5A所述方法和裝置(尖頭裝置)給予物質後肉眼觀察發現，大量的物質仍然懸浮在尖頭的簇之間，相反，組2A的方法和裝置看起來基本上很少有物質殘留。
組B實驗在這個組的各個實驗中，將10微升276mg/ml的二磷酸組胺(Sigma，St.Loouis，MO)溶液(100mg/ml組胺)給予斷奶的雌性Yorkshire豬。
在組1B中，使用組A實驗中所述的微磨擦裝置。首先將組胺溶液以液滴的形式施加到豬的剃毛皮膚上。接著將微磨擦裝置放置在組胺溶液和皮膚上，用於同時磨擦皮膚和輸送組胺至皮膚中。為了磨擦皮膚，使微磨擦裝置在皮膚上橫向移動6次(以交替方向移動，每方向3次)，獲得大約1-1.5cm2的磨擦區域。
在組2B中，如組3A-5A實驗所述使用尖頭裝置。將裝置浸入10微升的組胺溶液液滴，從而使組胺溶液加載到裝置上，通過毛細作用，該溶液基本上全部懸浮在尖頭簇之間。然後使用輕微的壓力，將加樣的裝置壓在剃毛的皮膚上，小心不要將尖頭插入太深以免出血。然後移動裝置1/8英寸(0.3175cm)長，刮出約0.06cm2的區域。
在組3B中，如組3A-5A所述使用尖頭裝置。將尖頭裝置壓在剃毛皮膚上，橫向刮出約1cm2的區域，小心不要使尖頭插入太深以免出血。將裝置向前移動1cm的距離。然後，從皮膚上移開裝置，將其壓在鄰近該初始處理部位的皮膚上。再將裝置移動1cm的距離。重複此步驟，直至獲得全部的1cm2處理皮膚。
在組4B中，如組3A-5A所述使用尖頭裝置。將尖頭裝置壓在皮膚上，小心不使尖頭插入過深而導致出血。不用該裝置刮皮膚，而是在將其壓在皮膚上一次之後立即將其移開皮膚。
採用上述方法進行對照實驗，但不施加組胺溶液。
處理後20分鐘觀察皮膚部位上的紅腫和腫脹。使用數字卡尺測量水平和垂直方向腫脹皮膚部位的最長和最寬點距離。雖然反應部位不是均勻的幾何形狀，但將垂直測量值和水平測量值相乘可獲得面積的估算值。圖12顯示皮膚反應的照片。結果表明，使用本發明微磨擦裝置並施加組胺溶液(組1B)引起的組胺搖動腫脹區，比使用美國專利3289670公開的尖頭裝置誘導的相應反應(組2B-4B)的腫脹區大。很明顯，雖然使用微磨擦裝置輸送組胺產生明顯的皮膚反應，但是單獨用裝置處理的對照部位在20分鐘時完全清晰，沒有顯示出腫脹或紅腫的跡象。相反，無組胺而在皮膚上使用尖頭裝置導致相當的腫脹和紅腫，使得難以區分該裝置的單獨作用與組胺的作用。圖13顯示了減去僅使用此裝置而無組胺時觀察到的腫脹測量值後獲得的各組組織腫脹的相對面積。這些結果表明，與使用美國專利3289670的尖頭裝置(組2B-4B)相比，用本發明的微磨擦裝置給予(組1B)時，組胺誘導的腫脹的平均面積高於前者達4倍。除了上述之外，採用組2B-4B所述方法和裝置(尖頭裝置)給予物質後的肉眼觀察發現，大量的物質仍懸浮在尖頭的簇之間，相反，組1B的方法和裝置顯示出維持基本上很少有物質殘留。
實施例6包含塑料磨擦表面的微磨擦裝置現有技術已描述了基於微電子機械系統(Micro-Electro MechanicalSystems，MEMS)的方法，用矽來製作結構精密的磨擦表面。含塑料磨擦表面的微磨擦裝置相對於含矽磨擦表面的微磨擦裝置有幾個優點，包括容易製造、低成本和複製性。雖然這些塑料磨擦表面顯示出與矽原件具有類似的特徵，但是，仍未知它們是否能在體內具有相同的能力。
以下實施例涉及含塑料磨擦表面的微磨擦裝置的使用。
實施例6a皮膚屏障功能的破壞皮膚外層10-20微米厚的角質層是一種有效的物理和化學屏障。完整的角質層阻止了疫苗和其它藥物物質被動地局部吸收並通過皮膚。為了比較含塑料磨擦表面和含矽磨擦表面的微磨擦裝置破壞這種皮膚屏障的有效性，在如實施例1所述使用微磨擦裝置處理大鼠皮膚後測量皮膚上的跨表皮水損失(TEWL)。
處理步驟包括，使微磨擦裝置橫向通過麻醉動物尾背部上的剃毛區不同次數。使用標準儀器(cyberDERM，Media，Pennsylvania)在微磨擦裝置每次通過之前和之後讀取TEWL讀數。評估各組，每組n＝4。圖14表示了平均TEWL測量值和標準誤差。
這些結果證明，使用含塑料磨擦表面和含矽磨擦表面的微磨擦器對皮膚屏障功能的破壞程度相似。在各裝置通過皮膚一次後觀察到TEWL有顯著增加，並且，TEWL值隨著通過增加而繼續增加。兩種裝置都同樣破壞皮膚這種屏障，而不管通過的次數是多少。相反，缺少微磨擦器的微型結構(micro-architecture)的其它裝置(如牙刷)採用此通過次數也不引起TEWL的增加(數據未顯示)。
還在豬模型中測試了此微磨擦裝置。豬皮膚的外層角質層要比大鼠皮膚相應層厚約5-10微米。但是，矽和塑料磨擦表面都能有效地破壞這個屏障，該裝置在皮膚上通過次數少至1次的情況下也能產生明顯的TEWL，並且TEWL隨著通過的次數而繼續增加(圖15，對於單只豬而言，每個條件n＝3個部位)。如上述，兩種裝置類型獲得相同的結果。
當比較矽磨擦表面和塑料磨擦表面時，對豬的螢光珠角質層破壞和滲入進行的組織學分析揭示了類似的結果。在此實施例中，將螢光珠溶液施加到經微磨擦裝置橫向通過2次預處理過的皮膚部位。在局部使用珠溶液後，用酒精清洗此裝置，使其乾燥，然後使其與皮膚表面上的珠溶液接觸，並橫向磨擦皮膚額外2次。對回收的皮膚時間部位進行的組織學分析顯示，經由矽磨擦表面和塑料磨擦表面進行輸送後，角質層破壞和珠的分配模式和程度相似。珠出現在經處理皮膚部位的表面上，顯示錶皮被滲透。
實施例6b編碼報導基因的質粒DNA的輸送和表達使用含塑料磨擦表面或矽磨擦表面的微磨擦裝置給予編碼報導基因(螢光蟲螢光素酶)的質粒DNA(圖16)。給藥方案依照實施例1所述的ABRdel方案。給予總共37.5微克的裸質粒DNA，體積為25微升。對照包括使用標準的針頭和注射器進行的ID注射和局部施加於剃毛皮膚但不使用微磨擦裝置(每組n＝3隻小鼠)。
結果證明，含塑料磨擦表面的微磨擦器輸送質粒DNA非常有效，引起皮膚中顯著水平的局部基因表達(圖16)。經含塑料磨擦表面的微磨擦器接受質粒DNA的組中，平均螢光素酶活性比局部給予DNA而無微磨擦裝置幫助的對照高140倍。經含磨擦表面的微磨擦裝置的給予產生了類似的高表達，其平均活性大約為對照的100倍。與標準的基於針頭的ID注射相比，兩種微磨擦器組都觀察到較高水平的螢光素酶活性(平均RLU/mg塑料磨擦表面為43688，矽磨擦表面為31034，ID注射為2214，局部為313)。
總之，這些結果證明，含塑料磨擦表面的微磨擦器在質粒DNA的輸送和表達方面至少與含矽磨擦表面的微磨擦器一樣有效。此外，微磨擦裝置在輸送質粒DNA到皮膚上比標準的針頭更有效，能引起更高水平的基因表達。
實施例6cDNA疫苗的輸送將圖10給出的數據重新繪製成線圖，與實施例1所述方法免疫的另一組小鼠(每組n＝3)獲得的結果一起表示，但使用含塑料磨擦表面的微磨擦裝置。
結果證明，含塑料磨擦表面的微磨擦器與含矽磨擦表面的微磨擦誘導抗原特異性免疫應答一樣有效(圖17)。經兩種微磨擦裝置誘導的血清抗體滴度比標準的基於針頭的ID和IM注射誘導的滴度更強。在無微磨擦裝置的情況下局部使用後沒有觀察到明顯的應答，這證明本發明的裝置和方法能用於局部免疫。
實施例7經微磨擦裝置輸送未加入佐劑的流感DNA疫苗後的抗體應答為了進一步研究使用本發明裝置和方法輸送DNA疫苗的用途，用編碼A/PR/8/34株流感病毒血凝素(HA)的質粒DNA免疫Brown-Norway大鼠(質粒由Harriet Robinson提供，Emory University School of Medicine，Atlanta，GA)。使用質粒DNA的PBS溶液免疫大鼠3次(0、21和42天時)(每組n＝3，每隻大鼠50μg，體積為50微升)。如實施例6所述並根據實施例1所述的ABRdel方案，使用含塑料磨擦表面的微磨擦裝置給予疫苗。或者，使用針頭ID或IM注射疫苗。作為陰性對照，將DNA局部施加於剃毛但未處理的皮膚。在第3、5、8和11周收集血清，用ELISA分析流感特異性抗體的存在。簡言之，用0.1微克滅活的流感全病毒(A/PR/8/34；Charles River SPAFAS，North Franklin，CT)包塗微滴定孔(Nalge Munc，Rochester，NY)，4℃過夜。37℃在加5％脫脂乳的PBS中封閉1小時後，使平板與測試血清的連續稀釋液37℃培育1小時。然後洗滌平板，進一步與偶聯有抗-大鼠IgG(H+L鏈)(Souther Biotech，Birmingham，AL)的辣根過氧化物酶37℃一起培育30分鐘，然後使TMB底物(Sigma，St.Louis，MO)顯色。在Yecan SunriseTM平板讀數器(Tecan，RTP，NC)上讀取吸收測量值(A450)。
結果證明(圖18)，經微磨擦裝置輸送裸質粒DNA疫苗後誘導產生的血清抗體應答與ID或IM注射誘導的反應一樣強，或者更強。
實施例8經由微磨擦裝置輸送加了佐劑的流感DNA疫苗後的抗體應答為了進一步研究採用本發明的裝置和方法輸送加佐劑的基因疫苗，根據製造商的建議，使用MPL+TDM Ribi佐劑系統(RIBI Immunochemicals，Hamilton，MT)配製實施例7所述的編碼流感HA的質粒DNA。如實施例7所述免疫大鼠(每組n＝3)，，並分析流感特異性血清抗體。結果證明(圖19)，經微磨擦裝置輸送加佐劑的質粒DNA疫苗後，誘導產生的血清抗體應答強於並快於ID或IM注射誘導的應答。
實施例9經微磨擦裝置輸送不加佐劑的「初次-加強」流感疫苗後產生的抗體應答最近發展的一種用於許多疾病(包括HIV)的疫苗接種方法是所謂的「初次-加強」法，其中最初的「初次」免疫和再次的「加強」免疫使用不同的疫苗類型(Immunology Today，Apr 21(4)163-165，2000)。例如，可使用疫苗的質粒DNA形式作初次免疫，接種使用亞單位蛋白質、滅活病毒或載體DNA製品強化。為了研究採用本發明裝置和方法進行的輸送，在第11周用滅活的流感全病毒(A/PR/8/34，100微克，50微升的PBS，病毒從Charles RiverSPAFAS，North Franklin，CT獲得)加強免疫實施例7的大鼠(圖20)。結果顯示，在所有組中都具有類似的強化效果。因此，根據「初次-加強」策略使用微磨擦裝置給予疫苗產生的免疫應答的刺激水平至少與ID或IM注射誘導產生的水平一樣強。
在類似的實驗中，在使用加佐劑的疫苗後，第11周用上述滅活的流感全病毒加強免疫實施例8的大鼠。結果顯示(圖21)，所有組中都獲得相似的強化效果。IM組中，僅在這種強化免疫後，其免疫應答才相對於微磨擦器誘導產生的水平。因此，根據「初次-加強」策略加佐劑使用微磨擦裝置給予疫苗產生的免疫應答的刺激水平至少與ID或IM注射誘導產生的水平一樣強。
實施例10經微磨擦裝置輸送狂犬病疫苗後的抗體應答在第0、7和21天使用25微升的狂犬病疫苗(Aventis Imovax)免疫大鼠。使用實施例6所述的含塑料磨擦表面的微磨擦裝置給予疫苗，並依照實施例1所述的preABR方案或ABRdel方案進行。或者，使用針頭ID或IM注射疫苗。作為陰性對照，將DNA局部施加給剃毛但未處理的皮膚。在第0、7和21天免疫小鼠(每組n＝5)。第0、7、21和35天收集血清，並在勘薩斯州大學用快速螢光病灶抑制檢測(Rapid Fluorescence Focus Inhibition Assay)分析狂犬病病毒特異性抗體的存在。結果證明(圖22)，使用微磨擦器輸送後誘導產生的狂犬病毒中和抗體滴度與注射引起的滴度相比延遲。但是，到第21天和持續到第35天，滴度相對於注射獲得的滴度。此外，兩種輸送方法ABRdel和preABR都觀察到類似水平的應答。將疫苗局部給予剃毛但未處理的皮膚不能引起顯著的應答。因此，微磨擦器能使滅活病毒疫苗和標準的可注射疫苗製品得以局部輸送。此外，對於滅活的全病毒疫苗製品，使用微磨擦器輸送方法看來對免疫應答的強度沒有影響。
實施例11a經微磨擦裝置輸送B肝疫苗後的抗體和T細胞反應在另一實施例中，通過以下輸送途徑給予BALB/c小鼠B肝表面抗原(HBsAg)蛋白亞單位疫苗1)使用標準針頭肌肉內(IM)注射2)使用標準針頭皮內(ID)注射3)使用實施例1所述的微磨擦器，根據實施例1所述的「preABR」方法輸送4)使用實施例1所述的微磨擦器，根據實施例1所述的「ABRdel」方法輸送5)局部直接應用於剃毛的皮膚(不用磨擦器；圖23中標記為「局部」)。
所有動物(每組n＝4)接受2次免疫，每次免疫含10微克HbsAg加10微克作為佐劑的含CpG寡核苷酸。免疫在開始實驗時和第21天時進行。在第21、35和56天給小鼠放血並分析HbsAg-特異性血清抗體滴度。結果證明(圖23)，使用微磨擦裝置處理能進行局部免疫。preABR組的抗體應答明顯大於局部對照組中觀察到的相應的非常弱的應答。微磨擦裝置預處理誘導的應答的數量級相對於直接用標準針頭IM或ID注射後觀察到的應答。很明顯，與從核酸(實施例1)獲得的結果相反，通過同時磨擦和輸送(BARdel)而輸送HBsAg引起較弱的應答。因此，使用微磨擦裝置進行輸送的最適當方法至少部分依賴於待輸送的物質類型。HBsAg代表由能自聚集能病毒樣顆粒的蛋白質單體組成的亞單位疫苗。實施例11所述的結果證明，這類疫苗最好是通過用微磨擦器預處理而給予，雖然採用「同時磨擦和輸送」方法也可誘導明顯的應答。
實施例11b在另一實施例中，通過以下輸送途徑給予BALB/c小鼠HBsAg蛋白質亞單位疫苗1)使用標準針頭皮內(ID)注射2)使用實施例1所述的微磨擦器，根據實施例1所述的「preABR」方法，但將微磨擦器在皮膚表面上通過的次數限定為2次3)使用實施例1所述的微磨擦器，根據實施例1所述的「preABR」方法，但將微磨擦器在皮膚表面上通過的次數限定為4次4)使用實施例1所述的微磨擦器，根據實施例1所述的「preABR」方法(在皮膚上通過6次)局部直接應用於剃毛的皮膚上(不使用磨擦器，在圖24中標記為「局部」)所有動物(每組n＝3)接受1次免疫，為10微克HBsAg加10微克含有CpG的寡核苷酸。免疫後10天，從引流淋巴結(draining lymph nodes，DLN)中收集單細胞懸浮液，並在培養基中用所示劑量的HBsAg再刺激。培養5天後用市售的基於MTS的試驗檢測T細胞增殖。
結果證明(圖24)，使用微磨擦裝置預處理使得局部免疫得以實現。在所有用微磨擦器處理的組中都觀察到T細胞強增殖應答，與之相比，局部對照組的應答非常小甚至沒有。微磨擦器處理組的應答的數量級在大多數劑量時高於使用標準針頭ID注射後觀察到的相應應答。最強的應答僅在裝置通過皮膚2次的實驗中觀察到。通過4次或6次之後，增殖活性有輕微的下降。其它實驗顯示，裝置的通過次數大於6次時增殖活性進一步下降，通過10次則活性完全喪失(數據未顯示)。這些結果表明，存在最佳的裝置通過次數，必須確定該次數，以便能夠用給定疫苗局部免疫。此外，這些結果表明，溫和的處理方案(少至2次通過)在某些情況下可能足以破壞外層皮膚屏障，使得局部免疫得以實現。
實施例12經微磨擦裝置輸送黑素瘤腺病毒載體疫苗後的T細胞反應在黑素瘤模型尤其是小鼠黑素瘤模型中，使用微磨擦器、局部和ID輸送測試編碼gp100(一種黑素瘤腫瘤抗原)的腺病毒輸送DNA。研究以下實驗組(每組n＝8)1)採用實施例1所述的「ABRdel」方案，使用實施例1所述的微磨擦器，僅給予載體；2)採用實施例1所述的「ABRdel」方案，使用實施例1所述的微磨擦器，給予編碼黑素瘤gp100抗原的腺病毒(Ad2)載體疫苗；3)採用實施例1所述的「preABR」方案，使用實施例1所述的微磨擦器，僅給予載體；4)採用實施例1所述的「preABR」方案，使用實施例1所述的微磨擦器，給予編碼黑素瘤gp100抗原的腺病毒(Ad2)載體疫苗；5)局部給予剃毛但未處理的皮膚以編碼黑素瘤gp100抗原的腺病毒(Ad2)載體疫苗；6)使用常規針頭ID注射給予編碼黑素瘤gp100抗原的腺病毒(Ad2)載體疫苗。
每隻小鼠給予總共2×109腺病毒顆粒。給予疫苗後第30天，採用脾γ-幹擾素產生細胞的ELISPOT試驗測定gp100特異性細胞免疫應答。結果顯示在圖25中。與局部輸送(組5)相比，使用微磨擦器根據「ABRdel」方案(組2)進行的輸送產生了明顯的應答，雖然這種應答與ID注射(組6)產生的應答相比有些弱。明顯的是，對於這種腺病毒載體化的疫苗，在「ABRdel」組(組2)中觀察到比「preABR」組(組4)更強的細胞免疫應答。這些結果與質粒DNA實驗中(見實施例1)觀察到的結果類似。因此，使用微磨擦裝置輸送的最適當方法至少部分依賴於待輸送的物質類型。Ad2載體代表著活病毒。實施例13的結果證明，雖然採用「preABR」方法也可以誘導可檢測的免疫應答，但最佳是在磨擦的同時輸送這類疫苗。
還可找到關於用於疫苗的合適的腺病毒載體的更多描述，尤其在美國專利5882877中。
實施例13經微磨擦裝置輸送炭疽重組蛋白質亞單位疫苗後的抗體應答在另一實施例中，用炭疽桿菌(Bacillus anthracis)的重組保護性抗原(rPA)免疫小鼠。該rPA由United States Army Medical Research in Infectious Diseases(USAMRIID)的Robert Ulrich博士提供。在存在或不存在其它佐劑的情況下使用10微克的rPA免疫BALB/c小鼠(每組n＝10)，具體如下組1IM-rPA加Alhydrogel(明礬)佐劑組2微磨擦器，「preABR」-rPA(無佐劑)組3微磨擦器，「preABR」-rPA加Alhydrogel(明礬)佐劑組4微磨擦器，「preABR」-rPA加CpG-寡核苷酸佐劑組5微磨擦器，「ABRdel」-rPA(無佐劑)
組6微磨擦器，「ABRdel」-rPA加Alhydrogel(明礬)佐劑組7微磨擦器，「ABRdel」-rPA加CpG-寡核苷酸佐劑組8局部-rPA(無佐劑)組9局部-rPA加Alhydrogel(明礬)佐劑組10局部-rPA加CpG-寡核苷酸佐劑在第0、21和42天免疫小鼠。收集血清，採用ELISA分析第21、42和56天的rPA-特異性抗體。結果歸納於表1-3中。
表1第21天的抗-rPA血清抗體滴度(1劑炭疽疫苗)表中顯示各動物(n＝10)的滴度和各組的平均值組別 1)IM 2)preABR 3)preABR 4)preABR 5)ABRdel 6)ABRdel 7)ABRdel 8)局部 9)局部 10)局部佐劑 明礬 無明礬 CpG 無明礬 CpG 無 明礬CpG50 50＜50 ＜50 50＜50 ＜50 50 ＜50＜5050 ＜50 ＜50 50＜50 ＜50 ＜50 ＜50＜50＜50＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50＜50＜50＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50＜50＜50＜50 ＜50 5050＜50 ＜50 ＜50 ＜50＜50＜50＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50＜50＜50＜50 ＜50 200 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50＜50＜50＜50 ＜50 ＜50 200 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50＜50＜50＜50 ＜50 100 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50＜50＜50＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50＜50＜50平均值10 5 35305 ＜50 ＜50 5 ＜50＜50表2第42天的抗-rPA血清抗體滴度(2劑炭疽疫苗)表中顯示各動物(n＝10)的滴度和各組的平均值組別 1)1M 2)preABR 3)preABR 4)preABR 5)ABRdel 6)ABRdel 7)ABRdel 8)局部 9)局部 10)局部佐劑 明礬 無明礬 CpG 無明礬 CpG 無 明礬CpG51200 12800 6400 6400 6400 1600 6400 400 50 5012800 12800 25600 25600 3200 6400 1600 ＜50＜50＜5025600 12800 25600 12800 400 3200 3200 ＜50＜50＜503200 12800 6400 6400 6400 6400 3200 ＜50＜50＜506400 6400 25600 51200 6400 6400 12800 ＜503200＜5025600 25600 6400 12800 1600 6400 6400 ＜50＜508003200 12800 25600 25600 3200 12800 6400 ＜50＜50＜503200 1600 3200 25600 6400 3200 ＜50 ＜50＜50640025600 6400 6400 1024003200 6400 6400 12800 ＜50＜5012800 25600 12800 12800 ＜503200平均值17,422 11,68015,68028,1604,133 5,867 6,578 1,320 361 1,045表3第42天的抗-rPA血清抗體滴度(3劑炭疽疫苗)
表中顯示各動物(n＝10)的滴度和各組的平均值組別 1)IM2)preABR 3)preABR 4)preABR 5)ABRdel 6)ABRdel 7)ABRdel 8)局部 9)局部 10)局部佐劑 明礬無明礬 CpG 無明礬 CpG 無 明礬CpG25600 51200 51200 51200 25600 25600 25600 12800 200 320051200 25600 51200 51200 25600 25600 51200 ＜5050 ＜5025600 51200 25600 20480025600 10240025600 ＜501600640025600 12800 51200 10240051200 51200 51200 ＜501600＜50102400 51200 51200 51200 25600 25600 102400＜503200＜5051200 25600 25600 51200 25600 25600 51200 ＜50＜50640051200 25600 51200 51200 12800 51200 51200 3200100 100102400 12800 12800 51200 51200 51200 25600 50 400 1280025600 25600 51200 51200 10240012800 100 80025600 25600 51200 204800＜50640平均值54,400 30,72037,12071,68032,71144,80069,1202,885 806 3,610結果證明，使用微磨擦器輸送炭疽重組亞單位疫苗獲得顯著的血清抗體滴度。使用微磨擦器輸送產生的抗體滴度至少與使用常規的IM注射途徑產生的滴度一樣強。不使用微磨擦器的局部給藥在一些動物中誘導產生了相當弱的應答。與實施例11a獲得的結果類似，僅在給予第1劑或第2劑疫苗之後，「preABR」方案導的免疫應答高於「ABRdel」方案誘導的應答(表1和表2)。但是，到給第3劑時，這些組之間的滴度是相當的(表3)。因而，使用微磨擦裝置輸送的最適當方法至少部分依賴於待輸送的物質的類型。rPA代表由重組蛋白組成的亞單位疫苗。表1-3的結果證明，雖然採用「同時磨擦和輸送」的方法最終也能誘導顯著的應答，但是，最佳是用微磨擦器進行預處理來給予這類疫苗。
此外，結果證明，本發明的裝置和方法適用於多種類型的疫苗佐劑，包括如明礬和含CpG的寡核苷酸。
這些結果證明，本發明的微磨擦器和技術使得各種各樣類型的疫苗得以輸送，並且，與使用標準針頭和注射器的常規輸送方法相比，在許多情況下提高了輸送。
本文將在文中引用到的參考文獻和專利納入作為參考。
權利要求
1.一種用於將物質輸送給皮膚的微磨擦器，所述微磨擦器包括磨擦表面和有效量的所述物質，其中，所述磨擦表面包含截頭圓錐形的或截頭金字塔形的微突出，所述微突出包含至少一個刮擦嵴並從所述磨擦表面凸出。
2.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微磨擦器還包含一基底，該基底包含適合於接受所述磨擦表面或與所述磨擦表面整合的磨擦面。
3.如權利要求2所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微磨擦器還包含適合於將手柄連接於所述基底的手柄連接面。
4.如權利要求2所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微磨擦器還包含與所述基底整合或可與所述基底分離的手柄。
5.如權利要求2所述的微磨擦器，其特徵在於，所述磨擦表面從所述磨擦面上凸出。
6.如權利要求3所述的微磨擦器，其特徵在於，所述手柄連接面和所述磨擦面基本上相互平行放置在所述基底的相反兩側。
7.如權利要求3所述的微磨擦器，其特徵在於，所述基底包括將所述磨擦面連接到所述手柄連接面的光滑的嵴。
8.如權利要求7所述的微磨擦器，其特徵在於，所述光滑的嵴形成弧形，將所述磨擦面連接於所述手柄連接面。
9.如權利要求7所述的微磨擦器，其特徵在於，所述磨擦面基本上為圓形，具有第一直徑，所述手柄連接面基本上為圓形，具有第二直徑，其中，所述第二直徑大於所述第一直徑。
10.如權利要求4所述的微磨擦器，其特徵在於，所述手柄是可拆卸的。
11.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微突出至少部分包塗有所述待輸送的物質。
12.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微磨擦器具有用於容納所述物質的貯存器。
13.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微突出的長度足以深入所述皮膚的角質層。
14.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微突出包含至少兩個刮擦嵴。
15.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微突出包含至少三個面，且其中任何兩個所述面的交叉部分形成刮擦嵴。
16.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微突出具有微突出基底，且以各微突出基底的中心之間的距離至少為所述微突出長度的兩倍的模式構建和排列。
17.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微突出以所述基底中心之間的距離至少為所述微突出長度5倍的模式構建和排列。
18.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微突出排列成模式。
19.如權利要求18所述的微磨擦器，其特徵在於，所述模式由行和列組成。
20.如權利要求18所述的微磨擦器，其特徵在於，所述模式為圓形模式。
21.如權利要求18所述的微磨擦器，其特徵在於，所述模式為隨機模式。
22.如權利要求16所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微突出的基底相隔開，形成所述微突出之間的溝槽。
23.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，在所述磨擦面上具有生物活性物質的塗層。
24.如權利要求23所述的微磨擦器，其特徵在於，所述生物活性物質是藥劑。
25.如權利要求23所述的微磨擦器，其特徵在於，所述生物活性物質是疫苗。
26.如權利要求23所述的微磨擦器，其特徵在於，所述生物活性物質是變應原。
27.如權利要求23所述的微磨擦器，其特徵在於，所述生物活性物質是基因治療劑。
28.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微突出的長度大於它們深入皮膚的深度。
29.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，當用於磨擦所述皮膚時，所述微突出的長度足以深入所述皮膚的角質層。
30.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微突出的長度約為5-500微米。
31.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微突出的長度約為30-300微米。
32.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微突出的長度約為75-250微米。
33.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述微突出的長度約為180-220微米。
34.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述磨擦表面是塑料。
35.如權利要求1所述的微磨擦器，其特徵在於，所述磨擦表面是矽。
36.一種將物質輸送給皮膚的方法，包括在所述皮膚上橫向移動微磨擦器，產生磨擦區域，和將所述物質施加於該磨擦區域，其中，所述微磨擦器包括一磨擦表面，該磨擦表面包含截頭圓錐形的或截頭金字塔形的微突出，所述微突出包含至少一個從所述磨擦表面凸出的刮擦嵴。
37.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，在微磨擦之前施加所述物質。
38.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，在微磨擦過程中施加所述物質。
39.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，隨著微磨擦施用所述物質。
40.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述微突出至少部分包塗有所述待輸送的物質。
41.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，所述微突出的長度足以深入所述皮膚的角質層。
42.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，所述微突出包含至少兩個刮擦嵴。
43.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，所述微突出含有至少三個面，其中任何兩個所述面的交叉部分形成一刮擦嵴。
44.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，所述微突出還包括一平坦的頂。
45.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，所述微突出具有微突出基底，且以各微突出基底中心之間的距離至少為所述微突出的長度兩倍的模式構建和排列。
46.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，所述微突出以各微突出基底中心之間的距離至少為所述微突出長度的五倍的模式構建和排列。
47.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，所述微突出以均勻的模式排列。
48.如權利要求45所述的方法，其特徵在於，所述微突出的所述基底相隔開，在所述微突出之間形成溝槽。
49.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，所述微磨擦器磨擦表面上含有生物活性物質。
50.如權利要求49所述的方法，其特徵在於，所述生物活性物質是藥劑。
51.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，所述微磨擦器在所述皮膚上橫向移動至少一次。
52.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，所述微磨擦器以交替的方向在所述皮膚上橫向移動。
53.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，所述待輸送的物質是生物活性物質。
54.如權利要求53所述的方法，其特徵在於，所述物質是變應原。
55.如權利要求53所述的方法，其特徵在於，所述物質是基因治療劑。
56.如權利要求53所述的方法，其特徵在於，所述物質是疫苗。
57.如權利要求56所述的方法，其特徵在於，所述疫苗包括活的、減毒的病毒或病毒載體。
58.如權利要求56所述的方法，其特徵在於，所述疫苗包括滅活的或殺死的病毒。
59.如權利要求56所述的方法，其特徵在於，所述疫苗包括滅活的或殺死的細菌。
60.如權利要求56所述的方法，其特徵在於，所述疫苗含有核酸。
61.如權利要求56所述的方法，其特徵在於，所述疫苗還含有所述核酸編碼的蛋白質或肽。
62.如權利要求56所述的方法，其特徵在於，所述疫苗還含有佐劑。
63.如權利要求56所述的方法，其特徵在於，所述疫苗含有活的、非減毒的病毒或細菌。
64.如權利要求56所述的方法，其特徵在於，所述疫苗含有多糖或多糖-偶聯物。
65.如權利要求56所述的方法，其特徵在於，所述疫苗含有蛋白質或肽。
66.如權利要求65所述的方法，其特徵在於，所述疫苗還含有佐劑。
67.一種試劑盒，其特徵在於，該試劑盒裝有權利要求1所述的至少一種微磨擦器。
68.如權利要求67所述的試劑盒，其特徵在於，所述藥劑包塗於微磨擦器的表面上。
69.如權利要求67所述的試劑盒，其特徵在於，所述藥劑裝在與所述微磨擦器整合的貯存器中。
70.如權利要求67所述的試劑盒，其特徵在於，在所述試劑盒中，所述藥劑是分開包裝的。
71.一種將物質輸送給皮膚中的裝置，其特徵在於，該裝置包含包塗有所述物質的磨擦表面和裝有重建液體並與所述磨擦表面液體相溝通的貯存器。
72.如權利要求71所述的裝置，其特徵在於，所述磨擦表面是一陣列，含有許多微突出。
73.如權利要求71所述的裝置，其特徵在於，所述物質包塗在微突出上。
74.如權利要求71所述的裝置，其特徵在於，所述貯存器通過磨擦表面上微突出內的通道與該磨擦表面相溝通。
75.如權利要求71所述的裝置，其特徵在於，所述貯存器通過磨擦表面上微突出之間的通道與該磨擦表面相溝通。
76.如權利要求71所述的裝置，其特徵在於，所述貯存器通過貯存器和磨擦表面之間的多孔材料與該磨擦表面相溝通。
全文摘要
一種用於輸送物質給皮膚的摩擦裝置和方法，包括用於將物質輸送給予皮膚的微摩擦器，該微摩擦器具有一個基底，該基底上有摩擦面和手柄連接面，在該摩擦面上附著、固定或整合有一摩擦表面，該摩擦表面上排列有微突出，這些微突出具有至少一個刮擦嵴；在手柄連接面上連接或固定有手柄和其它握持裝置。
文檔編號A61KGK1662266SQ02821447
公開日2005年8月31日 申請日期2002年10月29日 優先權日2001年10月29日
發明者J·A·米克斯塔, R·J·佩蒂斯, J·阿拉爾康, J·M·布裡特廷罕, J·P·迪克三世 申請人:貝克頓迪肯森公司