2-o-葡糖糖苷抗壞血酸在製備性別控制精液中的應用的製作方法
2023-05-29 02:55:06
專利名稱：2-o-葡糖糖苷抗壞血酸在製備性別控制精液中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及2-0-葡糖糖苷抗壞血酸的新用途，具體地說，涉及2-0-葡糖糖苷抗壞 血酸在製備性別控制精液中的應用。
背景技術：
2-0-葡萄糖苷抗壞血酸(AA-2G)是抗壞血酸(VC)的一種衍生物，其是將抗壞血 酸2位上的羥基用葡萄糖基取代後形成的。由於2位上有葡萄糖基掩蔽，所以AA-2G不易 發生氧化，在水溶液中特別穩定；並且AA-2G沒有直接還原性，但在酶的作用下能很快的釋 放出高活性的VC，VC能很快與自由基反應從而降低脂質過氧化作用。目前，AA-2G作為抗氧化劑在化妝品、準藥品和食品等諸多領域具有廣泛應用，且 在繁殖領域也應用於家畜精子的冷凍保存。性別控制(sex control)技術，即X/Y精子分離技術，是利用X、Y精子中DNA 含量的差異，藉助特異性染色劑染色，然後根據發出的螢光強度，通過計算機預測精子類 別，給液滴附加電荷，根據靜電原理，將X、Y精子分離開來(例如，Johnson LA, Pinkel D. Modificationof a laser-based flow cytometer for high resolution DNA analysis ofmammalian spermatozoa. Cytometry 1986，7 :268 273)。該技術在畜牧生產中意義重 大，該技術可以按照生產需求人為地控制動物後代的性別，快速繁育高產家畜，加速家畜育 種進程，提高畜牧業的經濟效益，促進畜牧業發展。目前還沒有將AA-2G應用於製備性別控制精液的製備過程中的報導。
發明內容
本發明的目的在於提供2-0-葡糖糖苷抗壞血酸的新用途。為了實現上述目的，本發明提供2-0-葡糖糖苷抗壞血酸(AA-2G)在製備性別控制 精液中的應用，優選為2-0-葡糖糖苷抗壞血酸在製備哺乳動物的性別控制精液中的應用。 所述哺乳動物優選為家畜，所述家畜優選為豬或羊。本發明中所述性別控制精液是將精子進行性別分離製得的單一性別精液。其是 通過X/Y精子分離技術，利用X、Y精子中DNA含量的差異，藉助特異性染色劑染色，然後根 據發出的螢光強度，通過計算機預測精子類別，然後給液滴附加電荷，根據靜電原理，將X、Y 精子分離開來，從而對精子進行性別分離，製得單一性別精液。其具體操作過程如下1、取一定量原精液，用H印es緩衝液稀釋至200X 106精子/mL，然後加入終濃度為 0. llmM H33342 及終濃度為 150 250 ii MAA-2G，在 34°C水浴中染色 45min ；2、用含有4% (重量體積比g/ml)提純卵黃和5% (重量體積比g/ml)食品紅的 Hepes緩衝液進一步稀釋至100 X 106精子/mL ；其中，添加食品紅的目的是減弱死精子上的H33342螢光，使這部分精子在分離過 程中被棄除，提高分離精子的活力；3、然後用SX-MoFlo流式細胞分離儀進行精子分離和回收，對收集得到的單一性別精子進行檢測。其中，AA-2G的終濃度優選為200 u M。本發明的優點在於，本發明將AA-2G應用於性別控制精液的製備過程中，能夠抑 制製備過程中產生的大量的自由氧；並且由於AA-2G在水溶液中穩定，因此能最大限度地 避免精子在製備過程中因分離和離心等處理過程造成的損傷；從而能夠明顯提高精子活 力、頂體完整性、質膜完整性等精子質量參數，從作用效果和作用時間上都明顯優於本領域 中現有的抗氧化劑。
圖1為本發明實施例3中不同抗氧化劑對豬性別控制精液的頂體完整性的影響 (17°C )。圖2為本發明實施例3中不同抗氧化劑對豬性別控制精液的質膜完整性的影響 (17°C )。
具體實施例方式以下通過具體實施例來進一步說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。(注實 施例中的百分數均為重量體積比，單位g/ml)實施例11、取一定量豬的原精液，用H印es緩衝液稀釋至200X 106精子/mL，然後加入終濃 度為 0. llmM H33342 及終濃度為 200 u M AA-2G (0. 068mg/ml)，在 34°C水浴中染色 45min ；2、用含有4% (g/ml)提純卵黃和5%食品紅(g/ml)的H印es緩衝液進一步稀釋 至 100X 106 精子 /mL ；3、然後用SX-MoFlo流式細胞分離儀進行精子分離和回收，對收集得到的單一性 別精子進行檢測，製得豬性別控制精液。實施例21、取一定量豬的原精液，用H印es緩衝液稀釋至200 X 106精子/mL，然後加入終濃 度為 0. llmM H33342 及終濃度為 250 u M AA-2G(0. 085mg/ml)，在 34°C水浴中染色 45min ；2、用含有4% (g/ml)提純卵黃和5%食品紅(g/ml)的H印es緩衝液進一步稀釋 至 100X 106 精子 /mL ；3、然後用SX-MoFlo流式細胞分離儀進行精子分離和回收，對收集得到的單一性 別精子進行檢測，製得豬性別控制精液。用螢光顯微鏡檢測製得的豬性別控制精液，結果表明，精子的頂體完整性、質膜完 整性均良好。實施例3與實施例1方法相同，只是將AA-2G的終濃度調整為150 uM(0. 051mg/ml)，製得豬 性別控制精液。用螢光顯微鏡檢測製得的豬性別控制精液，結果表明，精子的頂體完整性、質膜完 整性均良好。實施例4
用羊的原精液代替豬的原精液，按照實施例1方法，製得羊性別控制精液。用螢光顯微鏡檢測製得的羊性別控制精液，結果表明，精子的頂體完整性、質膜完 整性均良好。實施例5為了進一步說明本發明的效果，根據實施例1的豬性別控制精液的製備方法，進 行了 8組試驗，分別在步驟1中染色前添加不同的抗氧化劑，其中，對照組不添加任何抗氧 化劑、也不添加精清；P組不添加任何抗氧化劑、只添加10%精清；A組添加AA-2G、不添加 精清；E組添加維生素E、不添加精清；G組添加穀胱甘肽(GSH)、不添加精清；P+A組添加 AA-2G及10%精清；P+E組添加VE及10%精清；P+G組添加GSH及10%精清。抗氧化劑的 用量如表1所示，各組添加藥品用等量hepes緩衝液進行溶解，其餘步驟均與實施例1方法 相同。其中，GSH及VE的劑量是在參考現有文獻的基礎上，通過預實驗確定得到的；在該劑 量下，GSH及VE對豬精子的保護效果最好，當劑量大於或小於該值時，GSH及VE對豬精子的 保護效果均比該值時差。將製得的豬性別控制精液在37°C條件下，螢光顯微鏡檢測精子活力、頂體完整性、 質膜完整性。結果如表1、圖1 2所示。表1不同抗氧化劑對豬精子活力及存活時間的影響
權利要求
2 O 葡糖糖苷抗壞血酸在製備性別控制精液中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述應用是指2-0-葡糖糖苷抗壞血酸在 製備哺乳動物的性別控制精液中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述哺乳動物為家畜。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述家畜為豬或羊。
5.根據權利要求1-4任意一項所述的應用，其特徵在於，所述性別控制精液是將精子 進行性別分離製得的單一性別精液。
全文摘要
本發明提供了2-O-葡糖糖苷抗壞血酸在製備性別控制精液中的應用。本發明的優點在於，本發明將AA-2G應用於性別控制精液的製備過程中，能夠抑制製備過程中產生的大量的自由氧；並且由於AA-2G在水溶液中穩定，因此能最大限度地避免精子在製備過程中因分離和離心等處理過程造成的損傷，從而能夠明顯提高精子活力、頂體完整性、質膜完整性等精子質量參數，從作用效果和作用時間上都明顯優於本領域中現有的抗氧化劑。
文檔編號A01K67/02GK101971797SQ20101027792
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月9日 優先權日2010年9月9日
發明者夏春梅, 揚升, 田見暉 申請人:中國農業大學