用於哺乳動物細胞的高通量聚集和操作的裝置的製作方法
2023-05-31 11:53:11
本申請涉及用於細胞的高通量聚集的裝置和所述細胞的長期培養以及在所述裝置內對所述細胞的操作。所述細胞聚集用於基礎生物學中，特別用於發育和癌症生物學、再生醫學和藥物篩選中。本發明還涉及用於製造所述裝置的方法。
背景技術：
：組織自組織為特化細胞、相鄰支持細胞、細胞外基質組分與其它連續串擾以確保並維持功能的結構和尺寸元件的複雜三維實體(李(li)等人2005)。這種多組分微環境稱為生態位(niche)，已在用作基礎研究的標準化平臺的經典二維細胞培養系統中經最低限度的簡化，所述基礎研究在從研究所關注細胞類型的分化的發育生物學到例如致瘤細胞的藥理性篩選範圍內。然而，所述二維分析的結果關鍵性地缺少轉換回到三維活體內環境的方面(格裡菲斯(griffith)等人2006)。因此，在過去十年間，實驗設計已顯著朝向更為相關的3d模型(例如細胞聚集物培養)的實施轉變(阿博特(abbott)2003、張(zhang)2004、帕帕羅尼(pampaloni)等人2007)。對於球狀體形成，已建立懸滴系統以可靠地以良好控制方式形成細胞群集(凱勒(keller)1995)。簡單地說，將細胞懸浮於來自培養板的蓋的培養基滴中以通過重力誘導細胞聚集。這種方法極為費力，耗時，並且通常不易適於可擴展培養。儘管對所生成球狀體的整個表面確保營養物遞送，但以這種模式交換培養基以使得能長期培養聚集物是不可能的。此外，這種系統僅能覆蓋一定尺寸範圍的細胞群集(林(lin)等人2008)。已將常規圓底聚苯乙烯96孔板引入用於簡化細胞聚集的標準生物細胞培養中。儘管這種培養模式允許接近天然的構造，也就是球形底部空腔(groundcavity)，用於產生寬尺寸範圍的細胞群集，但缺點包括難以在不幹擾所形成球狀體的情況下交換培養基，並且通量仍較低。但是，96孔圓底板是使用最廣泛的用於活體外器官發生分析的培養模式(永樂(eiraku)等人2011、菅直人(suga)等人2011、那須(nasu)等人2012、蘭凱斯特(lancaster)等人2013)。為了克服早期發育生物學領域(這個研究領域中通常在細胞聚集物中培養並分化胚胎幹細胞)中的這個問題，最近已提出用於大規模產生胚胎幹細胞群集的裝置(昂格林(ungrin)等人2008)。以aggrewelltm(幹細胞技術(stemcelltechnologies)，加拿大，pct/ca08/00397)出售的裝置廣告為可再現地大規模產生一致且尺寸受控的胚胎體(eb)的容易的標準化方法。eb是通過將確定濃度的細胞懸浮液離心到尺寸為稜錐體基部直徑400或800微米的稜錐形微孔的高密度陣列中以在24小時內起始細胞聚集來生成。aggrewelltm800系統實際上具有微孔，所述微孔具有平坦底部平面，代表稜錐形平截頭臺的最終結構，其部分地(如果並非完全)使初始發明的提供其中將所有細胞收集於總重力的中心點的細胞收集裝置的目的失敗。此外，所述系統通常展現多個限制，這使得它難以應用於細胞球狀體的長期培養。在aggrewelltm板中通過高起始細胞接種密度或細胞聚集之後使球狀體生長超過24h形成的較大尺寸的eb往往形成錐形結構，反映aggrewelltm微孔的架構。迫使細胞呈非天然構造對細胞的生物功能具有未知影響，並且目前提出，培養基質的形狀可誘導不受控並且不確定的細胞系定型(石庫(shiku)等人2013)。另外，aggrewelltm板受限於培養期間的最佳培養基交換，因為例如移液等處理步驟會因朝向平面的大開口暴露於主體培養基而幹擾將球狀體約束在微孔內。aggrewelltm板是作為在聚二甲基矽氧烷(pdms)中鑄造的微孔陣列出售，聚二甲基矽氧烷是不容許營養物擴散的矽酮彈性體，所述營養物擴散會影響在暴露於pdms表面的側面上的細胞的生長和存活(李(lee)等人2004)。此外，眾所周知，pdms易於在其表面上吸附生物分子(杜普克(toepke)等人2006)，此因素有使細胞信號傳導和藥物篩選實驗的最終結果出現偏差的風險。在最新技術中解決了適宜細胞培養基質的缺乏，所述技術通過應用生物相容性支架(例如天然產生或合成的水凝膠)綜合生物學與材料科學(羅利(rowley)等人1999、盧妥夫(lutolf)等人2005、蒂比特(tibbitt)等人2009)。最新技術已開始探索通過2d平底微孔(戈巴(gobaa)等人2011)或通過3d支架(蘭加(ranga)等人2014)，通過生態位微陣列使用所述生物材料來遞送生物活性分子。業內需要介接(interfacing)可再現細胞聚集技術以用智能功能性生物材料生成單一或多個給定細胞類型的細胞球狀體的方法。業內需要在微型空腔中生成這些細胞聚集，所述微型空腔模擬所形成球狀體的幾何規範並且其中幾何形狀完全可定製以滿足給定生物系統的個別需求。業內需要將所有前述需求應用於細胞球狀體地大規模產生以提供臨床相關數目。業內還需要容許在相同裝置上對所產生細胞聚集進行實驗和局部操作。其它現有技術出版物揭示類似的微結構。例如，kr20130013537a涉及微結構的製造方法和使用所述微結構收集細胞的方法。然而，在kr20130013537中，所揭示方法具有若干限制和缺點，例如：-)孔的形狀為半球形或橢球體；-)孔開口的接觸角為最少20°；-)小孔不可能實現；-)孔距(孔間隔)與孔直徑相等；-)所用材料限於pdms；-)通量由於孔間隔(孔距)而受限；-)長期培養是不可能的。技術實現要素：本發明的目標是改良已知的細胞聚集物系統。本發明的另一目標是提出一系統，所述系統容許針對使用者關於通量、尺寸和幾何形狀以及與原位操作技術的相互關係的需要更好地加以調整。另一目標是提出一系統，所述系統對使用者友好，可再現並且可靠。根據本發明提出新穎細胞聚集物系統家族，其將還使得能在相同培養模式內長期培養所形成的細胞球狀體。根據本發明，3d培養系統由高縱橫比圓底形微孔以及u形底形微孔的陣列組成，所述微孔具有低孔距尺寸及高側壁，所述陣列可在不限於以下的多種材料中復現：pdms及其它聚合材料，例如塑料，但更重要的是水凝膠，例如那些基於合成親水聚合物的水凝膠，優選地聚(乙二醇)(peg)，或天然產生的組分，例如基質膠(matrigel)、瓊脂糖、明膠或膠原。為製造這些陣列，本發明利用稀聚合物溶液的溶劑蒸發產生圓形以及u形結構。圓形底部形狀包括在u形底部形狀中。圓底微孔是指u形底形微孔，其中微孔高度等於球形底的半徑。下文中將僅使用術語u形底或u形。然後在所關注基質中模製所形成的u形底微孔結構。尤其使用基於peg的水凝膠作為基質材料的優點在於對營養物的高通透性、最佳且定製的生物活性，同時確保其它方面的生物惰性(盧妥夫等人2005)。此外，基於peg的基質將允許所需生物分子選擇性偶聯到所描繪的微孔的底部，從而還容許研究關於聚集物內的細胞特徵和發育的不溶性因子。通過利用u形底微孔的架構，特別是孔深度對直徑的縱橫比，球狀體可包埋在培養基質的表面平面的下方以使例如移動或培養基更換的處理程序的幹擾最小化。孔之間在數個細胞直徑範圍內的最小孔距尺寸足以抑制單細胞停留在這些邊界上，所述停留過程可幹擾每個孔中的均勻細胞分布並且可展現不受控的信號傳導。此外，緊靠微孔平面的用於局部定時遞送目標分子的微流體網絡的整合容許在長期培養期間選擇性操作所形成聚集物。另外，這個平臺可應用於通過在所形成球狀體的頂部夾心式鑄造第二基質層來完全囊封所形成的聚集物，這將容許平面定位並顯著促進培養期間的自動化成像。因此，本發明提供通過以下方式生成包括一或多個細胞類型的細胞聚集物的方法：(1)對一或多個細胞類型同時進行重力沉降或離心。(2)對一個細胞類型進行重力沉降或離心，之後接著在前一細胞類型聚集後的任一給定時間通過重力沉降添加另一細胞類型。總而言之，本發明提出新穎的一體化(all-in-one)2d和3d細胞培養平臺，其提供細胞球狀體的高通量形成，同時容許其長期培養而無需改變培養模式，同時還通過局部遞送用於功能性研究的所需生物活性分子而使得能操作所形成聚集物。具體實施方式在一個實施例中，本發明涉及用於聚集細胞的裝置，所述裝置包含至少一個空腔，其中所述空腔包含多個微孔用於接收至少一個細胞，其中每一所述孔包含垂直側壁和彎曲底部。優選地，所述裝置包含多個空腔，每一所述空腔包含多個微孔。在一個實施例中，微孔的直徑(d)、高度(h)和孔間距離(孔距，p)沒有關聯並且可彼此獨立地改變。在一個實施例中，微孔具有1μm至3mm的開口直徑。在一個實施例中，微孔具有1μm至3mm的高度(h)。在一個實施例中，微孔具有不同尺寸或形狀的空腔。在一個實施例中，微孔之間的間隔(孔距尺寸)極小，使得落在孔區域內的細胞會落在微孔中並參與聚集物形成。在一個實施例中，微孔之間的間隔在1μm至100μm範圍內。在一個實施例中，裝置包含具有通道的微流體網絡。在一個實施例中，通道網絡在微孔平面下方。在一個實施例中，通道網絡與微孔對準。在一個實施例中，通道網絡與微孔底部之間的距離小於500μm。在一個實施例中，所述微孔是在水凝膠層中製得。在一個實施例中，水凝膠層是基於合成親水聚合物或天然產生的組分或合成聚合物與天然產生的組分的雜合物。在一個實施例中，合成親水聚合物選自包含以下的群組：聚(乙二醇)、聚脂肪族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚醯胺、聚乙烯醇、聚(環氧乙烷)、聚環氧丙烷、聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化四亞甲、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醯胺、聚(丙烯酸羥乙酯)、聚(甲基丙烯酸羥乙酯)或其混合物。在一個實施例中，通過混合併使用化學反應交聯至少兩種前體組分來製備水凝膠，其中第一前體組分包含n個親核基團並且第二前體組分包含m個親電子基團，其中n和m為至少2並且n+m的和為至少5，並且其中所述交聯優選地在以下兩者之間進行：-多臂peg大分子單體，優選地四臂peg大分子單體，其經親核基團、優選地硫醇基團末端官能化，與-多臂peg大分子單體，優選地八臂peg大分子單體，其經親電子基團、優選地乙烯碸基團末端官能化，所述交聯是在適當的濃度和條件下進行以例如容許經交聯水凝膠層展現介於0.1與100kpa之間的剪切模量。在一個實施例中，水凝膠包含過量游離官能基，優選地親核基團，更優選地選自包含胺和硫醇的群組，以及另外或或者親電子基團，優選地選自包含以下的群組：丙烯酸根、甲基丙烯酸根、醯基-醯胺、甲基丙烯醯胺、丙烯腈、醌、乙烯基-碸、馬來醯亞胺和其衍生物。在一個實施例中，微孔可經一或多種類型的生物分子功能化。在一個實施例中，生物分子是蛋白質、寡肽、寡核苷酸或糖。在一個實施例中，蛋白質或肽是ecm產生的或ecm模擬的並且使用異雙官能連接體附接到基於peg的層的親核或親電子基團、優選地硫醇基團，其中所述連接體的一個官能基可與附接到聚合物鏈末端的官能基反應，並且所述連接體的選自包含以下的群組的另一官能基能通過其胺基團非特異性地系接到目標生物分子：琥珀醯亞胺基活性酯，例如n-羥基琥珀醯亞胺(nhs)、α-甲基丁酸琥珀醯亞胺基酯、丙酸琥珀醯亞胺基酯；醛、硫醇、硫醇選擇性基團，包含丙烯酸酯、馬來醯亞胺或乙烯碸；吡啶基硫酯和二硫吡啶。在一個實施例中，將生物分子加標籤以例如通過親和力系接到水凝膠表面。在一個實施例中，加標籤的生物分子具有標籤以使得能結合到選自包含以下的群組的靶：蛋白質a、蛋白質g、蛋白質a/g、抗生蛋白鏈菌素、中性抗生物素蛋白、nta、抗體、rnasea的s-片段、鈣調蛋白、纖維素、殼多糖、穀胱甘肽、直鏈澱粉或具有可與水凝膠網絡上的官能基反應的親核或親電子官能基的官能化寡肽及寡核苷酸。在一個實施例中，天然產生的組分選自包含以下的群組：多糖、明膠蛋白和ecm組分，例如瓊脂糖、藻酸鹽、殼聚糖、葡聚糖、明膠、層粘連蛋白、膠原、透明質酸、纖維蛋白或其混合物，或選自包含以下的複雜組織產生的基質的群組：基質膠、myogel和cartigel。根據本發明，描述用於細胞聚集物的可再現形成和其長期培養的由高密度微米級u形底形微孔製得的新穎培養平臺。所述平臺受到高度關注，因為顯示這些聚集物可形成自組織結構，所述自組織結構顯示與常規培養系統相比增強的細胞功能並且因此顯示更強的關聯性。即使過去十年間已描述其它細胞聚集平臺，例如上述aggrewellstm(昂格林等人2008)和其它平臺(吉賽布萊希特(giselbrecht)等人2006、陳(chen)等人2008、蔡(choi)等人2010、劉(liu)等人2014)，但其都不能製造得到令人滿意的細胞聚集的微結構。實際上，球形微米級圖案製造是微技術中的主要瓶頸，因為大多數標準工藝都形成具有邊緣的結構。最新研究已顯示通過使用冰光刻和隨後的pdms複製來製造準球形微孔(劉等人2014)。儘管使用一般可獲得的工具簡單容易地製造，但這種技術仍受限於所形成微孔的高度、直徑和孔距尺寸的相互依賴性。此外，所述平臺的可擴縮性不可靠，如每個陣列的低球狀體數目所顯示(低於25個)。與之相比，通過利用稀聚合物溶液的溶劑蒸發(例如基於環氧樹脂的負性光致抗蝕劑su-8)，在濃縮液體於剛性表面上的界面處形成蒸發彎月面(meniscus)，從而賦予形成具有高几何再現性的緻密封裝的球形微結構的能力。本發明的主要優勢在於，消除微孔直徑、高度和孔間距離之間的聯繫，從而使得陣列幾何完全自由。需要對於上文所提到的已經存在的現有技術平臺不可能的獨立改變這三個參數的能力來研發基於生物應用的平臺而不是用於尋找應用的平臺。同樣，所提出的u形底形微孔陣列優選地用柔軟且高度水合的基質(例如水凝膠)而不是彈性體(例如pdms)來形成，以儘可能接近地模擬細胞的生理環境。顯示在所提出基質上的單細胞存活顯著高於基於pdms的平臺(例如在上文引用的kr現有技術申請中所揭示)並且在所提出基質上催化細胞聚集物生長。一方面，這些結果確證最近顯示的水凝膠與非水合基質相比支持細胞培養的潛力。另一方面，三維細胞培養系統似乎是二維系統缺少關聯性的重要解答。對於本發明基於水凝膠的微孔陣列平臺顯示，可將以高通量方式聚集細胞的能力與通過將這些細胞囊封在水凝膠的上層中而為這些細胞提供三維環境的潛力聯繫起來。另外，因為所述平臺是由水凝膠製得，所以可顯示將微流體網絡整合到平臺中的可能性。並且，作為使用水凝膠的另一個優點，可顯示將生物功能配體化學交聯到微孔表面上，使得能評價所系接信號對所培養聚集物的影響的可能性。將三維培養、微流體網絡和微孔圖案化和生物功能化整合到同一平臺中為3d微組織的高解析度篩選打開了全新的物理化學和時空空間。最後，顯示所述平臺可用於任何細胞類型，並且更具體地可用於不形成球狀體的細胞類型，例如mda-mb231，它是在2至3天後形成聚集物並保持緊密聚集至少5天的人類乳癌細胞。本發明呈現使得能「可控地」細胞共培養的唯一機會。通過以下方式使共培養成為可能：首先同時接種多個細胞類型，或將其它細胞類型添加到進行中的球狀體培養中。另外，可在培養期間的任何給定時間添加兩個以上細胞類型，以容許系統地研究自組織、遷移和細胞再分布。所呈現技術是高度通用並且創新的多維篩選平臺，用於在空間和時間上進行高解析度篩選。與上文所提到的大多數平臺不同，本發明方法在於基於生物應用特異性的平臺研發。認為這些種類的完全整合的技術將支持基礎生物學進步以及顯著催化將研究轉化為臨床。根據下文對圖的說明將更好地理解本發明，其中圖1a至1d說明本發明的原理；圖2說明根據本發明的微孔陣列三維幾何形狀(倒置)；圖3說明微孔陣列俯視幾何形狀；圖4說明u形底微孔陣列的全景；圖5說明對u形底孔製造工藝的概念性描述；圖6a至6c說明u形底微孔的幾何形狀的理論和實際視圖；圖7說明對水凝膠鑄造的概念性描述；圖8a至8d說明不同u形微孔尺寸；圖9a至9d說明在具有不同勁度的材料中再現的u形微孔；圖10說明在如所指示的多種材料中產生的u形微孔的實例；圖11說明較小尺寸微孔的實例；圖12a-n說明標準aggrewelltm平臺的限制；圖13a-g說明不同細胞密度的實例；圖14a-g說明聚集物生長、尺寸分布和多潛能性維持的實例；圖15說明如所指示的不同細胞類型的聚集潛力的實例；圖16說明如所指示的不形成球狀體的細胞類型的聚集潛力的實例；圖17a-c說明三維培養模式的實例；圖18a-f和放大圖18g說明具有微流體整合的u形底微孔陣列的實例；圖19說明微孔底的生物功能化的實例；圖20說明呈不同形狀的微孔的實例(俯視圖和剖視圖)。圖1a至1d說明本發明的原理。根據這種原理，提供具有一系列孔2的板1。所述市售孔2的典型尺寸為約6.4-34.8mm直徑和1.76cm深度，容納的總液體體積為0.36-16.8ml，對應於0.1-0.2ml至1.9-2.9ml的工作容積。當然，這是個實例並且可使用具有其它尺寸的其它板1，不管是市售板或特製板。圖1b顯示圖1a中的板1和其孔2的側切視圖。在這個圖1b中見到一組微孔3，其位於每一孔2的底部，形成本發明的一個特徵。在圖1c中更詳細地說明所述微孔3，圖1c是取自圖1b的孔2的放大視圖。因此，本發明在實施例中提出，在板1的一組較大孔2中提供一組微孔3。圖2顯示具有三維幾何形狀(倒置)的微孔3陣列4。出於可視化目的，微孔陣列4的三維幾何形狀是倒置顯示。這以用於鑄造u形底微孔陣列的負性pdms印模(例如)的透視圖說明u形底微孔3的一般結構。圖3以俯視幾何形狀說明微孔陣列4的實例。這裡顯示這些陣列4的理論俯視圖。微孔3已經組織化以將陣列4的給定區域的孔密度最大化。同樣，微孔3的這種組織化使得可將孔間距離最小化，由此防止細胞在微孔3之間生長。定義於圖1c中的距離d、h和p可用本申請中描述的製造技術獨立選擇。作為實例，d和h的尺寸可在1μm至3000μm(3mm)範圍內；p的尺寸範圍可自由選擇。對於裝置的最佳使用，h應始終大於或等於d，並且p應該儘可能地小，遠小於d(p＜＜d)並且通常在1μm-100μm範圍內。如果需要，可實現大於100μm的p而不受限制。圖1d說明隨孔距尺寸對孔直徑的比率而變的細胞捕獲面積(由微孔覆蓋的面積)的百分比。在10:1比率下，微孔已覆蓋總面積的74.95％。這個百分比無法通過進一步減小孔距尺寸來顯著增加。圖4說明u形底微孔3陣列的全景。在12孔板1的孔2中鑄造底部直徑為8mm的陣列(見圖1a)。顯示具有72個含有oct4::gfpesc群集的微孔3的陣列4區域的亮視野和螢光代表圖(較小插入部分，左側)。聚集物的尺寸是單分散並且多潛能性標記物oct4在每個細胞群集中顯示。這種聚集物同質性說明u形底微孔3平臺的高再現性。下表1給出每個板具有不同數目的孔2(6、12、24、48和96)的孔板1(見圖1a)的實例，孔底部面積和微孔3直逕取決於每個孔2中微孔3的數目。孔板16孔12孔24孔48孔96孔底部直徑(mm)34.822.115.6116.4底部面積(cm2)9.53.81.90.950.32微孔3直徑(μm)501355915468327247135474586100560352259811260559818952001906776893831190564430095003831190994932140056722287113956619150037661518756376127600268110815382679070020058084032006780015566273121555290012425012491244210001015409204101341250659266132652215004631869346151750342138683411200026310653268表1本發明的一個優點在於，其容許在微孔3中容易地再填充培養基。實際上，不是個別地再填充每個所述微孔3，另外這在低於給定微孔尺寸下是不可能的。對於本發明，可能在大於微孔3的孔2水平上作用並且因此更易於再填充。圖5說明根據本發明的u形底微孔3製造工藝的概念性代表圖。u形底微孔3是通過稀液體材料(例如聚合物，例如基於環氧樹脂的光致抗蝕劑su-8)的確定體積沉積來形成，以容許通過溶劑蒸發形成球形底部形狀。在溶劑蒸發期間，所沉積材料濃縮並潤溼微孔3壁以通過表面張力在孔底部形成倒置半球形底部形狀5。在所沉積材料固化後，可使用所述結構複製模製以製造微孔3陣列4。圖6a說明蒸發後微孔的最終幾何形狀的理論描述，如上文關於圖5所討論。顯示在孔底部具有倒置su-8帽5的單一si孔3的透視圖，包括沿中心的剖面。r描繪倒置帽的半徑，其等於預蝕刻孔的半徑。h1是指孔的深度，其等於在si中預蝕刻的深度。h2是指在溶劑蒸發前所印刷su-8的總高度，其約等於預蝕刻孔的半徑(圖6b)。複製模製到peg水凝膠中的具有su-8沉積以形成u形孔底(底部左側)或不具有(底部右側)的微孔3的實例給出於圖6c的圖像中。圖7說明根據本發明的板1的pdms和水凝膠鑄造的概念性描述的實例。在將模板矽印模矽烷化以使表面疏水後，將u形底結構複製模製到pdms中。然後使用所形成的pdmsu形底微孔底版將任何所需材料鑄造至蓋玻片上或直接在組織培養板1的孔2底部鑄造。蓋玻片(如果採用)可以任何適宜方式固定在孔2中，例如通過生物相容性粘合劑薄膜、例如peg水凝膠薄層來固定。圖8a-8d說明不同u形微孔尺寸的實例。使用peg水凝膠(g'約12.5kpa)，實現各個參數(距離d、高度h和孔距p)的不同組合。代表100μm、250μm、400μm和1.25mm直徑的微孔3的共焦圖像(正交視圖)(a-d)。這三種不同樣品的確切設計如下：圖8a：微孔3具有100μm直徑、200μm高度和40μm孔間距離。圖8b：微孔3具有250μm直徑、400μm高度和40μm孔間距離。圖8c：微孔3具有400μm直徑、400μm高度和40μm孔間距離。圖8d：微孔3具有1.25mm直徑、1mm高度和40μm孔間距離。這顯示根據本發明的微孔平臺的高度通用性。圖9a至9d說明不同勁度中的u形底微孔。使用具有不同聚合物含量(w/v，1.25％、2.5％、5％、10％，如圖中所指示)的peg水凝膠，顯示不同絕對勁度可模製為u形底微孔陣列。本發明的u形底微孔結構易於蓋印在勁度為150pa(g')(圖9a)至約30kpa(g')(圖9d)的水凝膠中。這個寬覆蓋範圍對解決關於細胞聚集物與不同剛度基質的相互作用的生物學問題至關重要。圖10說明如圖中所指示的可使用的多種材料。從pdms負模以上述圖案蓋印不同材料。可將pdms複製模製以在pdms中產生u形底微孔陣列。優選地，將u形底微孔陣列在柔軟生物相容性聚合物中再現：顯示標準合成水凝膠(例如聚乙二醇(peg))以及天然水凝膠(例如瓊脂糖、藻酸鹽、明膠、基質膠和膠原)可模製。當然，可使用其它等效材料。圖11說明小尺寸孔的實施例。在12.5kpapeg水凝膠中模製尺寸包含在10μm與50μm孔之間的微孔3以產生單細胞培養平臺。單細胞順利接種於單獨孔中。圖12(a)至(n)顯示標準aggrewelltm平臺的限制。在400μm直徑u形底微孔(a-d)中以及400μm尺寸aggrewellstm(e-h)中培養24h後所收穫oct4::gfpesc聚集物(即500、1000、2000和3000個細胞/微孔)的亮視野代表圖。觀察到aggrewelltm平臺的若干個限制。如已提出(石庫等人2013)在稜錐形微孔中聚集的細胞採用稜錐形(頂部)。這可在多種不同細胞接種密度下見到，例如500、1000、2000和3000個細胞/微孔(箭頭)。然而，在u形底微孔中形成的細胞聚集物顯著更圓。實際上，發現對於大多數細胞密度，球狀體偏心率(i)、形狀因子(j)和緊性(k)在u形底微孔與aggrewellstm之間顯著不同。這種緊性的缺乏通過評價兩個平臺之間收穫後的漂浮細胞數來確認(l)，並且發現，與本發明的u形底微孔相比，在收穫後更多單細胞漂浮在aggrewellstm條件的上清液中。最後，使用延時成像，觀察到接種至aggrewelltm表面(pdms表面)上的細胞聚集物(例如oct4::gfpesc(m)和nih3t3成纖維細胞(n)聚集物)沿微孔壁爬行。這些觀察顯示需要新穎培養平臺(例如本發明)，其使用更加惰性的培養基質和顯示高於pdms的生物相容性的培養基質。圖13(a)至(g)說明所測量不同細胞密度的實例。使用小鼠oct4::gfpesc，以三種細胞密度(a)1個細胞/微孔，(b)100個細胞/微孔，(c)500個細胞/微孔，接種至400μm直徑和400μm高度u形底微孔中。在24h後評價每種密度的尺寸分布。在這個階段期間，1個細胞/微孔、100個細胞/微孔和140個細胞/微孔的聚集物分別生長到約25μm、110μm和140μm。(d)單細胞在5天階段期間的生長的亮視野代表圖。可觀察到不同單細胞的生長潛力不同。因此，本發明微孔陣列是在單細胞水平評價幹細胞群的異質性(例如其不同克隆擴增潛力)的有效工具。(e)在本發明u形底微孔陣列(rbwpeg)中評價單一胚胎幹細胞活力並與標準aggrewelltm陣列(awpdms)相比較。本發明陣列支持顯著單細胞存活。***對應於p<0.001。(f)在aggrewelltm中5天後評價來自單細胞的克隆擴增集落的尺寸分布，和(g)在本發明u形底微孔陣列中5天後評價所述尺寸分布。與aggrewelltm平臺相比，在本發明u形底微孔中形成並培養的聚集物的尺寸更均勻。圖14(a)至(g)說明聚集物生長、尺寸分布和多潛能性維持。評價與aggrewelltm平臺(awpdms)相比，在本發明u形底微孔平臺中5天(rbwpeg)的小鼠oct4::gfpesc的聚集物生長(a)。與aggrewellstm相比，在壓實細胞後，在本發明u形底微孔中群集的生長顯著改良(b、c)。在第5天評價聚集物的尺寸分布。本發明u形底微孔平臺(c)顯示聚集物尺寸與aggrewellstm(b)相比的較高單分散性。(d)在u形底微孔陣列中在5天階段期間，500個細胞/微孔的生長的亮視野代表圖。聚集物生長在陣列中幾乎一致。因此，本發明微孔平臺顯示高通量生成單分散聚集物的高潛力。(e)另外，評價兩個平臺在更換培養基時的聚集物損失。未觀察到顯著差異。在更換培養基時損失平均少於7％的聚集物。(f)還評價平臺的聚集物回收。未觀察到顯著差異。可回收近100％的聚集物。最後，每天通過facs分析主要esc多潛能性標記物oct4的維持(數據未顯示)。在第5天(g)，仍有99.0％細胞表達所述標記物，其與標準維持培養物相當。圖15說明如圖中所指示的不同細胞類型的聚集潛力的實例。將各種細胞類型接種到本發明的u形底微孔陣列上。顯示c2c12、hek293t、nih3t3成纖維細胞、nmumg/e9和人類mscpt-2501的亮視野代表圖。不同細胞類型順利形成聚集物並且可維持5天。所述細胞類型也都順利收穫並保持群集(僅顯示hmscpt-2501的數據作為代表性實例)。這種高度通用性顯示本發明微孔平臺的高潛力。圖16說明如圖中所指示的不形成球狀體的細胞類型的聚集潛力的實例。將不形成球狀體的細胞接種到本發明u形底微孔陣列上。顯示mcf-7、mda-mb231和op9在不同培養時間的亮視野代表圖以及在第5天的相應收穫聚集物。不同細胞類型順利形成聚集物並且可維持5天。同樣，所有三種細胞類型都順利收穫並保持群集。圖17(a)至(c)說明三維培養模式的實例。(a)通過基質的第二層6的夾心式鑄造3d囊封的聚集物的透視圖，顯示本發明技術組合將聚集物定位於一個單一z平面中以使得能進行囊封三維培養的潛力。(b)說明夾心式鑄造概念的證明。製造u形底微孔3(400μm直徑，400μm高度和40μm孔距)的第一層。在這個第一層的微孔中通過重力沉降捕獲peg微珠(≈200μm直徑，g'10-40kpa)以模擬細胞群集。在陣列頂部上鑄造peg水凝膠的第二層以形成三維培養物，從而完全囊封peg微珠。(c)夾心式鑄造方法的共焦代表圖。這顯示本發明平臺製造高通量平面三維培養物的潛力。圖18(a)至(f)和18g說明本發明u形底微孔陣列，其具有通過可灌注微米級通道的微流體整合。示意性說明本發明u形底微孔3陣列的俯視圖(a)和側切視圖(b)，所述陣列整合有微流體網絡，其例如包含通道15、16，所述通道連接至相應入口15'、16'和出口15"和16"，透視圖見圖18g。網絡5、6可位於微孔3平面下方並與其對準或不對準。在變體中，可存在若干個彼此相鄰或互聯的獨立網絡。圖19說明微孔底的功能化的實例。u形底形微孔3(270μm直徑，400μm高度，40μm孔距)的共焦代表圖。微孔3的底部經模型蛋白質(此處為bsa)功能化。圖20說明不同形狀的本發明微孔3的實例。具有多種幾何形狀的微孔3的示意性代表圖。可用上文所討論技術使用任何形狀(例如三角形、正方形、環形體和完全不規則結構)產生u形底微孔。這些形狀可用於多種應用；其尤其可為用於評價培養基質幾何形狀對細胞功能的影響的有效工具。圖20說明俯視圖和沿a-a和b-b的剖視圖。製造/材料和方法u形底微孔陣列製造使用sibosch工藝，在矽基質中蝕刻出所需尺寸的平底微孔(此處為圓柱形)。然後，使用噴墨印刷將準確體積的稀液體材料(例如聚合物，例如正性光致抗蝕劑su-8)添加至這些孔中。其它沉積技術可包括自動化液體分配(例如機器人液體處理工作站)、人工分配(例如移液)或任何其它類型的沉積方法。蒸發後，材料形成蒸發彎月面，並產生球形底以形成u形結構(見圖5和6)。所述材料完全固化並且用作用於pdms複製模製的圖案，然後使用其作為最終基質(例如水凝膠)的模製圖案。這種複製模製工藝容許將矽基質幾何形狀複製到所需最終基質中(見圖7)。對於如圖11和13-16中所示的單細胞培養和聚集物培養，使用上文所提到的方法和數值的在每個尺寸範圍內的本發明u形底微孔3的微型製造很有希望產生極高密度的微孔陣列(見圖4)。可模製材料任何種類的水凝膠(即合成水凝膠以及天然的或天然產生的水凝膠)，例如peg、瓊脂糖、藻酸鹽、明膠、膠原、基質膠、聚合物(例如pdms、su-8等)、塑料(例如pmma、pla、ppa、pp、pe等)、陶瓷、金屬、合金、礦物質、非金屬礦物質和玻璃。細胞培養將由奧斯汀史密斯(austinsmith)(劍橋大學(universityofcambridge))提供的oct4::gfp小鼠胚胎幹細胞(mesc)在沒有飼養細胞的情況下以常規方式在補充有白血病抑制因子(lif)、esc篩選的胎牛血清(fbs，吉布科(gibco))(15％)培養基、非必需胺基酸(neaa)丙酮酸鈉(10mm)和b-巰基乙醇(0.1mm)的杜爾貝科改良伊戈爾培養基(dulbecco'smodifiedeaglemedium，dmem)(下文稱作es細胞培養基(史密斯1991))中擴增。將人類間質幹細胞(hmsc,pt-2501,龍沙(lonza))和op9鼠類基質細胞以常規方式維持在補充有10％fcs(海克隆(hyclone)，批號aua33984)和1ng/ml人類fgf-2(派普泰克(peprotech))的α-mem中。將nih3t3成纖維細胞、mcf-7人類乳癌細胞、mda-mb231人類乳癌細胞、c2c12小鼠成肌細胞、nmumge9小鼠乳癌細胞和人類胚腎(hek)293細胞以常規方式維持在補充有10％胎牛血清(fbs)、hepes(10mm)和丙酮酸鈉(1mm)的dmem中。聚集物形成用胰蛋白酶使細胞脫離。在細胞類型特異性培養基中製備具有目標密度的細胞懸浮液(即3×105個細胞/ml、6×104個細胞/ml和1000個細胞/ml，分別用於實現500個細胞/微孔、100個細胞/微孔和1個細胞/微孔)。在24孔板的孔底部鑄造u形底形微孔陣列並在孔中添加2ml所製備細胞溶液。通過重力沉降使細胞沉降。將細胞培養5天並且每天更換相應培養基。結果/應用和實例不同基質中和不同尺寸的u形底微孔在多種細胞培養相容性基質(包括pdms、peg、瓊脂糖、明膠、藻酸鹽和基質膠)中模製不同尺寸(圖8)的u形底微孔3陣列4。為了測試在不同勁度的基質中的再現性，在聚合物含量(w/v)在2.5％至10％範圍內的peg中模製u形底微孔3陣列4(圖9)。可鑄造的最低peg勁度被測定為150pa，相當於2.5％peg聚合物含量(如通過流變學所測定)，在低於其的勁度下不再完全保證微孔3結構的架構。通過所保留的架構顯示，u形底微孔3可在上文所提到的材料中有效再現(見圖10)。單細胞擴增和活力平鋪小於的數目的低細胞密度以最大化孔3內的單細胞分布。在peg(rbwpeg)與aggrewelltm400(awpdms)的400μm直徑的u形底微孔之間，在5天時間範圍期間每24小時對單細胞的擴增和活力進行量化(見圖17d)。所培養單一oct4::egfpes細胞的存活率從awpdms上的48.36％±31.74％顯著(p<0.0001)增加到rbwpeg上的85.05％±8.51％(見圖17e)。在rbwpeg上培養的其它單細胞在5天擴增後生長為與awpdms相比更大且更加單分散的聚集物群體(見圖17f-g)。最先進商業平臺的限制在400μm直徑的u形底微孔(見圖12a-d)相對於最先進aggrewellstm400(見圖12e-h)中生成的eb之間比較接種後24h的聚集物尺寸。觀察到與u形底微孔相反，aggrewelltm空腔的稜錐形狀導致生成變形eb，這是由於聚集物適應孔形狀所致(圖3.4a-c，黑色箭頭)。還觀察到在較高接種密度(2000和3000個細胞/eb)下，對於u形底微孔與aggrewellstm相比(圖12c-d相對於g-h)觀察到更穩健的球狀體形成，如上清液中漂浮細胞的較低計數所顯示(圖12l)。通常，在u形底微孔中形成的eb顯示更佳偏心率(圖12i)、形狀因子和緊性(圖12i-k)指數。這些結果指示，球狀體形成通常在u形底微孔中得以加強。另外觀察到，在aggrewellstm中聚集並培養的es細胞通常在不到24h內就開始附著到pdms表面(圖12m、n)。所附著聚集物利用傾斜的稜錐形微孔的邊界沿邊緣爬行。這導致聚集物融合併形成更分散的球狀體群體。聚集物尺寸使用5％(w/v)peg水凝膠中的u形底微孔3陣列4聚集並培養oct4::egfp轉基因小鼠es細胞。初始聚集物尺寸可通過調整細胞接種密度來控制。以單細胞、100個細胞/eb和500個細胞/eb的密度為目標。測定並比較接種後24h的聚集物尺寸(見圖13a-c)。單細胞、100個細胞、500個細胞導致eb為10-40μm、90-130μm和110-170μm直徑。聚集物生長在peg中具有400μm直徑的u形底微孔(rbwpeg)與aggrewelltm400(awpdms)之間，在5天時程期間從起始密度為500個細胞的eb對聚集物生長進行量化(見圖14d)。對於rbwpeg，在48h後生長速率顯著增加(p<0.0001)(見圖14a)。此外，與awpdms相比，在rbwpeg上培養500個oct4::egfp細胞/微孔導致更大並且更加單分散的最終聚集物群體(見圖14c-d)。培養基更換和聚集物回收在awpdms和rbwpeg二者上，對於連續5天中的每天，每24h通過抽吸出全部體積的舊培養基並通過在培養板的側壁溫和移液等量交換來交換培養基。在每次更換培養基後對全部陣列表面進行成像並對聚集物損失進行量化。awpdms和rbwpeg二者的聚集物損失遠低於10％(見圖14e)。通過在孔中心上下移液三次回收聚集物，每輪完全液體交換，並且隨後將上清液轉移到新的培養板。在這個程序後對全部陣列進行成像以對聚集物回收進行量化。awpdms和rbwpeg二者的聚集物回收接近100％(見圖14f)。所回收聚集物可用於其它生物學分析。通過流式細胞術測定從在rbwpeg上培養5天的eb解離的細胞的oct4表達。99％的所述細胞在培養後保留其oct4表達(見圖14g)。各種細胞類型的聚集在5％(w/v)peg水凝膠中模製u形底微孔陣列。在這些微孔陣列內以給定的開始密度形成各種細胞類型的聚集物。c2c12、hek293t、nih3t3成纖維細胞、nmumg克隆e9和人類間質幹細胞可在u形底微孔上在24小時內有效形成群集。所述群集穩定並且可在培養後有效收穫，如對於人類msc所顯示(圖15)。u形底微孔3可用於分析固有地抵抗聚集的細胞，如通過不形成球狀體的癌症細胞系mdamb231所顯示。在24小時內，細胞形成鬆散封裝的群集，其在培養中在後續幾天期間進一步壓實，使得甚至可在120小時後從微孔3陣列4收回穩定的群集(圖16頂部圖)。小鼠op9細胞在24小時內形成穩定群集。使細胞在培養中保持這種構造，所述細胞在外生脂肪形成分化因子(地塞米松(dexamethasone)、ibmx和胰島素)不存在下也在3天內有效分化為脂肪細胞。可在這個時間點從微孔陣列收穫脂肪細胞群集(見圖16，底部圖)。平面3d囊封u形底微孔陣列可用於細胞和球狀體的平面3d囊封以改良成像質量以及耗時。作為概念的證明，形成5％(w/v)peg-alexa546u形底微孔陣列。在聚合後，將200μm10％peg-alexa488珠分布在微孔陣列頂部上並使其沉降到空腔中。隨後用5％(w/v)peg-alexa647的第二層密封填充所述珠的陣列，從而在3dpeg環境中的一個焦平面中完全囊封所述珠(見圖17)。聚集物微流體為了容許在形成後在無需轉移到新的培養板的情況下對細胞球狀體進行局部並且短暫的生物化學操作，通過在微孔3的平面下微模製生成緊密鄰近的(距離<500μm)微流體通道，以確保所需分子在24h內擴散。作為原理的證明，通過u形底微孔陣列下方的通道灌注fitc標記的高分子量(2000kda)葡聚糖。葡聚糖無法通過水凝膠網絡灌注，因此只能有效並且選擇性地標記微流體通道的內側(見圖18)。微孔功能化u形底微孔3可根據先前所述的方法用不同蛋白質功能化(科布爾(kobel)等人2012)。簡單來說，在親水載玻片上形成蛋白質薄膜，在其上放置pdms印模以容許蛋白質吸附到pdms表面上。在peg的後續模製步驟期間，將蛋白質轉移到水凝膠表面，其中通過靜電相互作用或共價鍵的形成將其納入水凝膠網中。作為原理的證明，使用alexa-647標記的bsa功能化5％(w/v)peg-alexa488水凝膠(見圖19)。不同形狀的微孔使用所呈現的技術，可製造任何形狀的u形底微孔3用於特定應用(見圖20)。實際上，已顯示細胞或細胞聚集物功能受到其培養基質的幾何形狀的顯著影響。因此，所呈現的微孔3陣列4有很大可能可解答功能如何與幾何形狀相關聯的問題。本申請中所述的實例、實施例和工藝步驟是以實例方式給出並且不應以限制性方式來理解。藉助等效裝置、材料和方法或步驟，在本發明範圍內其它變化形式是可能的。也可根據情況視需要組合本文所述的實施例。參考文獻阿博特,a.(2003).「細胞培養：生物學的新維度(cellculture:biology'snewdimension).」自然(nature)424(6951):870-872。陳,c.s.、j.佩甘(j.pegan)、j.露娜(j.luna)、b.夏(b.xia)、k.麥克洛斯基(k.mccloskey)、w.c.金(w.c.chin)和m.凱恩(m.khine)(2008).「熱縮懸滴：形成並培養胚狀體的簡單方式(shrinky-dinkhangingdrops:asimplewaytoformandcultureembryoidbodies).」)可視化實驗雜誌(jvisexp)(13)。蔡,y.y.、b.g.鍾(b.g.chung)、d.h.李、a.卡登胡希尼(a.khademhosseini)、j.h.金(j.h.kim)和s.h.李(2010).「在凹面微孔陣列中的尺寸受控的胚狀體形成(controlled-sizeembryoidbodyformationinconcavemicrowellarrays).」生物材料(biomaterials)31(15):4296-4303。永樂,m.、n.高田(n.takata)、h.石橋(h.ishibashi)、m.川田(m.kawada)、e.坂倉(e.sakakura)、s.奧田(s.okuda)、k.關口(k.sekiguchi),t.安達(t.adachi)和y.笹井(y.sasai)(2011).「三維培養中的自組織光學杯形態發生(self-organizingoptic-cupmorphogenesisinthree-dimensionalculture).」自然472(7341):51-56。吉賽布萊希特,s.、t.吉策爾特(t.gietzelt)、e.哥特瓦爾德(e.gottwald)、c.特勞特曼(c.trautmann)、r.德拉肯穆勒(r.truckenmuller)、k.f.魏貝贊(k.f.weibezahn)和a.瓦力(a.welle)(2006).「通過預處理聚合物膜的微熱成型產生的3d組織培養基質(3dtissueculturesubstratesproducedbymicrothermoformingofpre-processedpolymerfilms).」生物醫學微型裝置(biomedmicrodevices)8(3):191-199。戈巴,s.、s.赫尼爾(s.hoehnel)、m.拉喬(m.roccio)、a.尼格若(a.negro)、s.科布爾和m.p.盧妥夫(2011).「用於以高通量探測單一幹細胞命運的人工生態位微陣列(artificialnichemicroarraysforprobingsinglestemcellfateinhighthroughput).」自然方法(natmethods)8f(11):949-955。格裡菲斯,l.g.和m.a.斯沃茨(m.a.swartz)(2006).「在體外捕獲複雜3d組織生理學(capturingcomplex3dtissuephysiologyinvitro).」自然評論：分子細胞生物學(natrevmolcellbiol)7(3):211-224。凱勒,g.m.(1995).「胚胎幹細胞的體外分化(in-vitrodifferentiationofembryonicstem-cells).」細胞生物學近論(currentopinionincellbiology)7(6):862-869。科布爾,s.a.和m.p.盧妥夫(2012).「用於高通量單一幹細胞培養和分析的peg水凝膠微孔陣列的製造(fabricationofpeghydrogelmicrowellarraysforhigh-throughputsinglestemcellcultureandanalysis).」分子生物學方法(methodsmolbiol)811:101-112。蘭凱斯特,m.a.、m.倫納(m.renner)、c.a.馬丁(c.a.martin)、d.文策爾(d.wenzel)、l.s.比克內爾(l.s.bicknell)、m.e.謝勒(m.e.hurles)、t.荷弗瑞(t.homfray)、j.m.彭寧格(j.m.penninger)、a.p.傑克遜(a.p.jackson)和j.a.諾布裡奇(j.a.knoblich)(2013).「人類腦發育和小頭畸形的大腦類器官模型(cerebralorganoidsmodelhumanbraindevelopmentandmicrocephaly).」自然501(7467):373-379。李,j.n.、x.姜(x.jiang)、d.萊恩(d.ryan)和g.m.懷特賽茲(g.m.whitesides)(2004).「聚(二甲基矽氧烷)表面上的哺乳動物細胞的相容性(compatibilityofmammaliancellsonsurfacesofpoly(dimethylsiloxane)).」朗繆爾(langmuir)20(26):11684-11691.李,l.和t.謝(t.xie)(2005).「幹細胞生態位：結構與功能(stemcellniche:structureandfunction).」細胞與發育生物學年度評論(annurevcelldey_biol)21:605-631。林,r.z.和h.y.章(h.y.chang)(2008).「用於生物醫學研究的三維多細胞球狀體培養的最新進展(recentadvancesinthree-dimensionalmulticellularspheroidcultureforbiomedicalresearch).」生物技術雜誌(biotechnolj)3(9-10):1172-1184。劉,t.、m.溫特(m.winter)和b.蒂埃裡(b.thierry)(2014).「用於多細胞球狀體的長期培養和高通量分析的超疏水基質上的準球形微孔(quasi-sphericalmicrowellsonsuperhydrophobicsubstratesforlongtermcultureofmulticellularspheroidsandhighthroughputassays).」生物材料.盧妥夫,m.p.和j.a.哈貝爾(j.a.hubbell)(2005).「作為用於組織工程化中的形態發生的指導性細胞外圍環境的合成生物材料(syntheticbiomaterialsasinstructiveextracellularmicroenvironmentsformorphogenesisintissueengineering).」自然生物技術(naturebiotechnology)23(1):47-55。那須,m.、n.高田、t.墰上(t.danjo)、h.坂口(h.sakaguchi)、t.角島(t.kadoshima)、s.二木(s.futaki)、k.關口、m.永樂和y.笹井(2012).「在小鼠es細胞培養中通過含有層粘連蛋白的基質穩健形成並維持連續分層皮質神經上皮(robustformationandmaintenanceofcontinuousstratifiedcorticalneuroepitheliumbylaminin-containingmatrixinmouseescellculture).」公共科學圖書館(plosone)7(12):e53024。帕帕羅尼,f.、e.g.雷諾(e.g.reynaud)和e.h.k.施特爾策(e.h.k.stelzer)(2007).「橋聯細胞培養與活組織之間的間隔的第三維度(thethirddimensionbridgesthegapbetweencellcultureandlivetissue).」自然評論：分子細胞生物學8(10):839-845。蘭加,a.、s.戈巴、y.岡和(y.okawa)、k.莫西維茨(k.mosiewicz)、a.尼格若和m.p.盧妥夫(2014).「用於在系統層面分析細胞命運的3d生態位微陣列(3dnichemicroarraysforsystems-levelanalysesofcellfate).」自然通訊(natcommun)5:4324。羅利,j.a.、g.麥德拉班(g.madlambayan)和d.j.穆尼(d.j.mooney)(1999).「作為合成細胞外基質材料的藻酸鹽水凝膠(alginatehydrogelsassyntheticextracellularmatrixmaterials).」生物材料20(1):45-53。石庫,h.、t.新井(t.arai)、y.周(y.zhou)、n.青木(n.aoki)、t.西條(t.nishijo)、y.堀口(y.horiguchi)、k.井野(k.ino)和t.松江(t.matsue)(2013).「小鼠胚狀體的呼吸活性和其與未分化/分化標記物的mrna水平的關聯的非侵入性測量(noninvasivemeasurementofrespiratoryactivityofmouseembryoidbodiesanditscorrelationwithmrnalevelsofundifferentiation/differentiationmarkers).」分子生物系統(molbiosvst)9(11):2701-2711。史密斯,a.(1991).「胚胎幹細胞的培養和分化(cultureanddifferentiationofembryonicstemcells).」組織培養方法學雜誌(i.tiss.cult.meth)(13):89-94。菅直人,h.、t.直樹(t.kadoshima)、m.皆口(m.minaguchi)、m.武司(m.ohgushi)、m.早園(m.soen)、t.中野(t.nakano)、n.高田、t.綿谷(t.wataya)、k.六車(k.muguruma)、h.三好(h.miyoshi)、s.米村(s.yonemura)、y.大磯(y.oiso)和y.笹井(2011).「三維培養中功能性腺垂體的自形成(self-formationoffunctionaladenohypophysisinthree-dimensionalculture).」自然480(7375):57-62。蒂比特,m.w.和k.s.安賽斯(k.s.anseth)(2009).「作為用於3d細胞培養的細胞外基質模擬物的水凝膠(hydrogelsasextracellularmatrixmimicsfor3dcellculture).」生物技術與生物工程(biotechnologyandbioengineering)103(4):655-663。杜普克,m.w.和d.j.畢比(d.j.beebe)(2006).「小分子的pdms吸收和在微流體應用中的結果(pdmsabsorptionofsmallmoleculesandconsequencesinmicrofluidicapplications).」晶片實驗室(labchip)6(12):1484-1486。昂格林,m.d.、c.喬西(c.joshi)、a.尼加(a.nica)、c.博旺(c.bauwens)和p.w.德史塔(p.w.zandstra)(2008).「來自單細胞懸浮液來源的人類胚胎幹細胞聚集物的多細胞組織的可再現的超高通量形成(reproducible,ultrahigh-throughputformationofmulticellularorganizationfromsinglecellsuspension-derivedhumanembryonicstemcellaggregates).」公共科學圖書館3(2):el565。張,s.(2004).「培養皿以外(beyondthepetridish).」自然生物技術(natbiotechnol)22(2):151-152。當前第1頁12