缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法
2023-05-30 04:00:01
缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法
【專利摘要】本發明提供了缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，該方法包括以沒食子酸為多酚類物質標準品繪製標準曲線、缺苞箭竹中多酚類物質的樣品溶液製備及缺苞箭竹樣品中多酚類物質含量的測定三個步驟，本發明提供的方法，檢測限低、準確度高、重現性好、精密高。
【專利說明】缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分析化學領域，尤其涉及福林酚法測定缺苞箭竹中多酚類物質含量的方法。
【背景技術】
[0002]大熊貓被譽為「活化石」，為我國國家一級保護動物，是世界野生動物保護的旗艦物種，隨著環境的改變和數千年的演化與適應，其逐漸轉化為以亞高山竹類為主食的植食性動物，主食竹為缺苞箭竹。
[0003]大熊貓的主食竹中含有較高含量的多酚類物質，研究人員認為，植物多酚會對動物產生阻食和降低消化率的作用，因此，竹子中多酚類物質的含量會影響大熊貓的取食利用及採食量，但目前，科研人員對竹子中，尤其缺苞箭竹中多酚類物質含量的檢測方法研究很少，尚未建立起對缺苞箭竹中多酚類物質的含量檢測方法。
[0004]目前僅有對其它植物或藥物製劑中多酚類物質含量檢測方法的報導，如中國專利CN103076425A和中國專利CN102590435A中公開了一種破布木果的質量檢測方法，採用福林酚-酚法測定破布木果中多酚的含量，但是不同的植物品種間細胞結構有所差別，而且多酚含量相差巨大，因此在不同的植物品種間多酚的提取方法、提取和檢測條件也無相互借鑑價值。因此，對於大熊貓主食竹缺苞箭竹中多酚類物質的含量檢測方法尚待建立。
【發明內容】
[0005]為了解決上述問題，本發明人經銳意研究，結果發現:缺苞箭竹粉末可被60?80%的乙醇溶液在60?80°C回流I?3小時的條件下提取出大量的多酚類物質而不會過量引入雜質；本發明人經探索，確定Na2CO3溶液濃度為5?15%，福林酚試劑與Na2CO3溶液體積比為1: 0.25?8，樣品溶液與福林酚試劑的體積比為1: 0.5?10，I: 0.5?10，顯色時間為5?30min,顯色溫度為10?45°C,檢測波長為410?900nm的條件下,可以使溶液的吸光度值在0.1?0.8之間，並且，以沒食子酸為標準品所做的標準曲線線性良好，相關係數R2 > 0.99，因此，本發明通過上述方法對大熊貓主食竹缺苞箭竹中多酚類物質進行提取並進行含量測定，再通過回歸方程和稀釋定律計算出缺苞箭竹中多酚類物質的含量，從而完成本發明。
[0006]本發明的目的在於提供以下幾方面:
[0007]第一方面，本發明提供缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，包括:
[0008](I)以沒食子酸為多酚類物質標準品繪製標準曲線:
[0009]配製濃度為80?120 μ g/mL的沒食子酸標準溶液，以梯度體積量取上述沒食子酸標準溶液，分別移至容量瓶內，配製成沒食子酸系列標準溶液，按沒食子酸系列標準溶液體與福林酚試劑積比1: 0.5?10向沒食子酸系列標準溶液中分別加入等量的福林酚試劑，5分鐘後向加入福林酚試劑後的沒食子酸系列標準溶液中按福林酚試劑與Na2CO3溶液體積比1: 0.25~8分別加入等量的Na2CO3溶液，靜置5~30分鐘後用高純水定容，配製成為標準曲線溶液，在顯色溫度為10~45°C的條件下，靜置顯色25~250分鐘；用紫外-可見分光光度計在檢測波長410~900nm測定標準曲線溶液的吸光度，並將測得的吸光度值繪製成為標準曲線，使其回歸方程為一次函數，並且相關係數R2 > 0.99 ；
[0010]其中，
[0011 ] 所述Na2CO3溶液的重量分數為5~15% ；
[0012]所述高純水為去離子水或二次蒸餾水；
[0013](2)缺苞箭竹中多酚類物質的樣品溶液製備，包括以下子步驟:
[0014](2-1)將缺苞箭竹粉碎，過60~80目的篩子篩分，得到缺苞箭竹粉末；
[0015](2-2)稱取(2-1)中製得的缺苞箭竹粉末，置於提取容器中，按重量比1: 10~30的比例加入重量分數為60~80%乙醇溶液)，在回流溫度60~80°C下回流I~3小時；
[0016](2-3)將(2-2)中回流後的固液混合物，在轉速為3000~5000r/min、溫度為10~30°C的條件下，離心5~15分鐘；
[0017](2-4)將(2-3)中離心後的固液混合物減壓過濾，將濾液轉移至容量瓶中，用高純水定容，製備成為樣品溶液，按樣品溶液與福林酚試劑體積比1: 0.5~10向樣品溶液中加入福林酚試劑，5分鐘後向加入福林酚試劑後的樣品溶液中按福林酚試劑與Na2CO3溶液體積比1: 0.25~8加入Na2CO3溶液，靜置5~30分鐘後用高純水定容，在顯色溫度為10~45°C的條件下，靜置顯色25~250分鐘配製缺苞箭竹樣品待測溶液，待用；
[0018](3)缺苞箭竹樣品中多酚類物質含量的測定:
[0019]用繪製標準曲線時使用的紫外-可見分光光度計測定(2-4)中製備的缺苞箭竹樣品待測溶液的吸光度值，該吸光度值在標準曲線上所對應的濃度值即為缺苞箭竹樣品待測溶液中多酚類物質的濃度，即Cww,再通過下式換算出缺苞箭竹中多酚類物質的含量，即C
原樣品，
[0020]C原樣品=C稀釋液X V稀釋液/V原樣品
[0021]其中，
[0022]Cww是指(2-4)中製備的缺苞箭竹樣品待測溶液中多酚類物質的濃度；
[0023]Vw?是指(2-4)中製備的缺苞箭竹樣品待測溶液的體積；
[0024]是指(2-4)中製備的樣品溶液中多酚類物質的濃度；
[0025]Vbw品是指(2-4)中製備的樣品溶液的體積。
[0026]第二方面，本發明提供上述缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，步驟(2-2)中，
[0027]所述缺苞箭竹粉末與乙醇溶液的重量比為1: 15~25;
[0028]所述乙醇溶液的重量分數為65~75% ；
[0029]所述回流溫度為65~75°C ；
[0030]所述回流時間為1.5~2.5小時。
[0031]第三方面，本發明提供上述缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，步驟(2-2)中，
[0032]所述缺苞箭竹粉末與乙醇溶液的重量比為1: 20;
[0033]所述乙醇溶液的重量分數為70%。[0034]第四方面，本發明提供上述測缺苞箭竹中多酚類物質含量的方法，其特徵在於，步驟(2-3)中，
[0035]所述的轉速為4000r/min ；
[0036]溫度為25°C ；
[0037]離心時間為8?12分鐘。
[0038]第五方面，本發明提供上述測缺苞箭竹中多酚類物質含量的方法，其特徵在於，所述Na2CO3溶液的重量分數為8?12%。
[0039]第六方面，本發明提供上述測缺苞箭竹中多酚類物質含量的方法，其特徵在於，所述福林酚試劑與Na2CO3溶液的體積比為1: 4?6。
[0040]第七方面，本發明提供上述缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，所述試樣溶液與福林酚試劑的體積比為1: 2?6。
[0041]第八方面，本發明提供上述缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，所述多酚類物質含量的檢測條件中顯色溫度為20?40°C。
[0042]第九方面，本發明提供上述缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，所述多酚類物質含量的檢測條件中顯色時間為60?150分鐘。
[0043]第十方面，本發明提供上述缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，步驟(I)中所述檢測波長為650?800nm。
[0044]本發明提供的缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，具有如下有益效果:
[0045](I)本發明提供的方法，從缺苞箭竹中提取多酚類物質的步驟中所用的多酚類物質提取溶劑容易獲得，提取方法簡便，成本低；
[0046](2)本發明提供的缺苞箭竹中多酚類物質的檢測方法，均能實現良好的準確度和重現性；
[0047](3)本發明提供的方法中所繪製的多酚類物質的標準曲線，具有穩定性和普適性，可使用該曲線進行多個樣本的含量檢測，有效的避免了重複性勞動，節約了時間和人工成本；
[0048](4)本發明提供的方法，檢測限低，靈敏度高，能有效檢測樣品中較低濃度的多酚類物質的含量；
[0049](5)本發明提供的方法，精密度高，穩定性好，對缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定準確。
【具體實施方式】
[0050]以下通過【具體實施方式】進一步解釋或說明本
【發明內容】
，但實施例不應被理解為對本發明保護範圍的限制。
[0051]多酚類物質為酚類物質的一個重要類群，其特殊的化學結構導致其具有獨特的生理活性和生態學意義，尤其在天然植物中，多酚類物質作為自我保護性次生代謝產物，對動物的攝食量具有重要意義。
[0052]植物中多酚類物質可與口腔內蛋白質以氫鍵或疏水鍵相結合，當口腔中多酚類物質含量較高時，口腔上皮細胞受到刺激而產生收縮、折皺等一系列複雜的變化，使其在被食用時產生不良的味覺，即澀味，降低食物的適口性；同時，多酚類物質能夠降低動物的消化速率，並與動物腸道的外層細胞發生結合，降低腸壁的可透性，使動物大腦將其理解為「飽覺」，從而抑制動物對其的攝食量。
[0053]此外，多酚類物質能夠與食物中的蛋白質相結合，形成不易消化的化合物，使蛋白質不容易被胃酸分解吸收，從而降低動物對蛋白質的利用率；同時，多酚類物質能夠與動物消化道內的相應的消化酶，如纖維素酶，相結合，抑制酶活性從而阻礙動物對纖維素、澱粉和脂肪等的消化，進而導致動物的營養不良。
[0054]通常，在動物中不會發生多酚類物質中毒的情況，只會因為食物的口感差和厭食效應而減少對多酚類物質含量較高的食物的攝食量，但當動物食性較為單一，而其食物中多酚類物質含量過高時，就有產生中毒的可能，嚴重時可導致動物死亡。而「活化石」 一熊貓，我國國家一級保護動物，其食性就較為單一，其主食竹為缺苞箭竹，因此缺苞箭竹中多酚類物質的含量對熊貓的生存質量顯得尤為重要，因此本發明建立了一種採用福林酚法測定缺苞箭竹中多酚類物質含量的方法。
[0055]多酚類物質的分子上含有多個極易被氧化的羥基，福林酚試劑中的鎢鑰酸可以將多酚類物質上的羥基定量氧化，而其自身則被還原，在鹼性條件下生成藍色化合物，而且其顏色的深淺程度與原多酚類物質的含量呈正相關，並在一定條件下遵從Lambert-Beer定律，即，被測組分對紫外光或可見光具有吸收，且吸收強度與組分濃度成正比，由此可以通過福林酚法測定缺苞箭竹中多酚類物質的總量。
[0056]沒食子酸，是典型的多酚類物質，其結構如下所示，具有3個酚羥基，是一種結構簡單的多酚類物質，其結構穩定，以沒食子酸為標準品所做的標準曲線線性良好，相關係數R2 > 0.99，而且其線性範圍在適宜缺苞箭竹中多酚類物質的含量檢測，同時，沒食子酸價廉易得，因此在本發明中選用沒食子酸作為檢測缺苞箭竹中多酚類物質的標準品。
[0057]
【權利要求】
1.缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，包括: (1)以沒食子酸為多酚類物質標準品繪製標準曲線: 配製濃度為80~120 μ g/mL的沒食子酸標準溶液，以梯度體積量取上述沒食子酸標準溶液，分別移至容量瓶內，配製成沒食子酸系列標準溶液，按沒食子酸系列標準溶液與福林酚試劑體積比1: 0.5~10向沒食子酸系列標準溶液中分別加入等量的福林酚試劑，5分鐘後向加入福林酚試劑後的沒食子酸系列標準溶液中按福林酚試劑與N%C03溶液體積比I: 0.25~8分別加入等量的Na2CO3溶液，靜置5~30分鐘後用高純水定容，配製成為標準曲線溶液，在顯色溫度為10~45°C的條件下，靜置顯色25~250分鐘；用紫外-可見分光光度計在檢測波長410~900nm測定標準曲線溶液的吸光度，並將測得的吸光度值繪製成為標準曲線，使其回歸方程為一次函數，並且相關係數R2 > 0.99 ； 其中， 所述Na2CO3溶液的重量分數為5~15% ； 所述高純水為去離子水或二次蒸餾水； (2)缺苞箭竹中多酚類物質的樣品溶液製備，包括以下子步驟: (2-1)將缺苞箭竹粉碎，過60~80目的篩子篩分，得到缺苞箭竹粉末； (2-2)稱取(2-1)中製得的缺苞箭竹粉末，置於提取容器中，按重量比1: 10~30的比例加入重量分數為60~80%乙醇溶液，在回流溫度60~80°C下回流1~3小時； (2-3)將(2-2)中回流後的固液混合物，在轉速為3000~5000r/min、溫度為10~30°C的條件下，離心5~15分鐘； (2-4)將(2-3)中離心後的固液混合物減壓過濾，將濾液轉移至容量瓶中，用高純水定容，製備成為樣品溶液，按樣品溶液與福林酚試劑體積比1: 0.5~10向樣品溶液中加入福林酚試劑，5分鐘後向加入福林酚試劑後的樣品溶液中按福林酚試劑與Na2CO3溶液體積比1: 0.25~8加入Na2CO3溶液，靜置5~30分鐘後用高純水定容，在顯色溫度為10~45°C的條件下，靜置顯色25~250分鐘配製缺苞箭竹樣品待測溶液，待用； (3)缺苞箭竹樣品中多酚類物質含量的測定: 用繪製標準曲線時使用的紫外-可見分光光度計測定(2-4)中製備的缺苞箭竹樣品待測溶液的吸光度值，該吸光度值在標準曲線上所對應的濃度值即為缺苞箭竹樣品待測溶液中多酚類物質的濃度，即C_?，再通過下式換算出缺苞箭竹中多酚類物質的含量，即Csti品， C原樣品=C稀釋液X V稀釋液/V原樣品； 其中， Cwfa是指(2-4)中製備的缺苞箭竹樣品待測溶液中多酚類物質的濃度； Vwfa是指(2-4)中製備的缺苞箭竹樣品待測溶液的體積； Cs#s是指(2-4)中製備的樣品溶液中多酚類物質的濃度； V是指(2-4)中製備的樣品溶液的體積。
2.根據權利要求1所述的缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，步驟(2-2)中， 所述缺苞箭竹粉末與乙醇溶液的重量比為1: 15~25; 所述乙醇溶液的重量分數為65~75% ；所述回流溫度為65~75°C ； 所述回流時間為1.5~2.5小時。
3.根據權利要求1所述的缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，步驟(2-2)中， 所述缺苞箭竹粉末與乙醇溶液的重量比為1: 20; 所述乙醇溶液的重量分數為70%。
4.根據權利要求1所述的缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，步驟(2-3)中， 所述的轉速為4000r/min ； 溫度為25°C ； 離心時間為8~12分鐘。
5.根據權利要求1所述的缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，所述Na2CO3溶液的重量分數為 8~12%。
6.根據權利要求1所述的缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，所述福林酚試劑與Na2CO3溶液的體積比為1: 4~6。
7.根據權利要求1所述的缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，步驟(I)中所述沒食子酸系列標準溶液福林酚試劑的體積比為1: 2~6; 步驟(2-4)中所述樣品溶液與福林酚試劑體積比為1: 2~6。
8.根據權利要求1所述的缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，所述顯色溫度為20~40°C。
9.根據權利要求1所述的缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，所述顯色時間為60~150分鐘。
10.根據權利要求1所述的缺苞箭竹中多酚類物質含量的測定方法，其特徵在於，步驟(!)中所述檢測波長為650~800nm。
【文檔編號】G01N21/78GK103558214SQ201310538431
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月4日 優先權日:2013年11月4日
【發明者】趙莘, 段麗娟, 高健, 李潔, 李俊清 申請人:北京林業大學