GSK－3β的調節及治療增殖性病變的方法

2023-06-09 02:39:26

專利名稱：GSK－3β的調節及治療增殖性病變的方法
技術領域：
本發明主要涉及治療增殖性病變(包括癌症)的方法，尤其是促進增殖細胞中細胞凋亡的方法。
背景技術：
通常，細胞具有控制生長和增殖的機制，使得細胞僅在特定的環境下有控制地進行分化和生長。當控制細胞生長和增殖的正常調節機制被破壞時，細胞還具有誘導細胞死亡或細胞凋亡的機制。但是，在有的情況下，這種增殖控制和細胞凋亡機制出現故障，使得細胞無抑制地增殖，有可能引發生物體內的增殖性病變或疾病。這類增殖性病變包括癌症及其它細胞過多的病變，如牛皮癬、疣和瘢痕瘤。
細胞蛋白p53突變和失調常見於各種細胞增殖性病變(包括多種癌症)中。在正常、健康的細胞中，p53通路可通過廣泛的傷害性刺激被激活，造成細胞周期停滯或細胞凋亡。這一過程需要p53蛋白的積聚，然後通過靶基因轉錄激活引起其生理學效應(Burns，T.F.and E1-Deiry，W.S.，J CellPhysiol，181231-239，1999；Gottlieb，T.M.and Oren，M.，Semin Cancer Biol，8359-368，1998；Levine，A.J.，Cell，88323-331，1997；Vousden，K.H.and Lu，X.，Nat Rev Cancer，2594-604，2002)。目前的證據表明細胞通過周期素依賴性蛋白激酶抑制因子p21的轉錄激活產生細胞周期停滯(Deng，C，et al.Cell，82675-684，1995；Chan，T.A.，et al.Genes Dev，141584-1588，2000；Brugarolas，J.，et al.Nature，377552-557，1995；el-Deiry，W.S.，et al.Cell，75817-825，1993；Bates，S.，et al.Oncogene，171691-1703，1998)或通過促細胞凋亡基因(如Puma，Noxa和Bax)的誘導產生細胞凋亡(Vousden，K.H.and Lu，X.，Nat Rev Cancer，2594-604，2002；Fridman，J.S.and Lowe，Oncogene，229030-9040，2003；Kho，P.S.，et al.J Biol Chem，27921183-21192，2004)。人們對控制細胞對p53應答的命運的精密機制仍所知甚少，不過有人提出p53應答最終依賴於傾向生長停滯與傾向細胞凋亡的p53靶基因之間的轉錄平衡。大多數化療藥物通過激活p53通路誘導細胞死亡。因此，p53基因的突變造成細胞凋亡通路逃避，引起更激進的表型及對化療的抗性。
基於p53的藥理學的目的是為了將對p53生物學的理解轉換為有效的治療方案，從而促進功能異常增殖細胞(包括癌細胞)中的細胞凋亡。操控p53靶基因(Seoane，J.，et al.Nature，419729-734，2002)或p53轉錄輔因子(Iyer，N.G.，et al.Proc Natl Acad Sci U S A，1017386-7391，2004)水平的遺傳學方法已被用於不同系統中調節p53靶基因表達水平之間的精確平衡，最終促進p53-依賴性細胞凋亡。這些試驗對理解p53-誘導細胞命運的細胞控制很重要，治療結果還有待於對這些試驗的觀察。
近期研究表明p53可直接在線粒體處誘導細胞凋亡。p53已被證實能直接激活促細胞凋亡Bcl-2家族成員Bax或Bak(Seoane，J.，et al.Nature，419729-734，2002；Chipuk，J.E.，et al.Science，3031010-1014，2004；Mihara，M.，et al.MoI Cell，ll577-590，2003)並與抗細胞凋亡bcl-XL和Bcl-2蛋白形成抑制性複合物(Mihara，M.，et al.MoI Cell，11577-590，2003)。這些相互作用最終造成線粒體透化和細胞色素c釋放。這種選擇性p53死亡通路與細胞凋亡早期階段相互關聯，後者不依賴於p53轉錄活動獨立發生(Erster，S.，etal.MoI Cell Biol，246728-6741，2004)，並可通過p53的直接藥理學激活進行調節(Erster，S.，et al.MoI Cell Biol，246728-6741，2004；Chipuk，J.E.，etal.Cancer Cell，4371-381，2003)。目前，人們對該通路的調節還所知甚少。但是，這種p53依賴性而非轉錄依賴性的細胞凋亡通路的藥理學激活也許能提供一種可行的治療增殖性病變(包括癌症)的方法。
發明概要大多數化療藥物通過激活p53腫瘤抑制基因起作用來誘導癌細胞發生細胞死亡。但是，p53在癌細胞中的細胞凋亡功能常常因為p53突變或p53通路中其它成分的變更而喪失，造成含有這類突變或變更的癌細胞對化療的抵抗。由於p53細胞凋亡功能受抑制，化療藥物在這些癌細胞中只能得到有限應答。此處描述了糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)在調節增殖細胞(如癌細胞，包括人結腸直腸癌細胞)中p53功能的一種獨特作用。如此處所述，GSK-3β的藥理學調節能恢復正經受化療的細胞的p53的細胞凋亡功能，從而促進這類癌細胞(包括正經受化療的人結腸直腸癌細胞)發生細胞凋亡，並進一步使得癌細胞(包括人結腸直腸癌細胞)對化療作出有效應答。
因此，本發明一方面提供治療細胞增殖性病變的方法，包括給有需要並正經受化療的對象施用治療有效量的調節糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)活性的藥劑。
另一方面，本發明提供治療細胞增殖性病變的方法，包括給有需要的對象施用治療有效量的調節GSK-3β活性的藥劑，所述藥劑與化療藥物相組合。
又一方面，本發明提供誘導正經受化療的細胞發生細胞死亡的方法，包括調節細胞中糖原合酶激酶-3β的活性。
在又一方面，本發明提供誘導細胞發生細胞死亡的方法，包括調節細胞中的糖原合酶激酶-3β活性，並將細胞與化療藥物相接觸。
在更多方面，本發明提供了治療有效量的調節糖原合酶激酶-3β活性的藥劑在治療正經受化療的對象的細胞增殖性病變中的應用，包括在製備用於治療所述病變的藥物中的應用。
本發明還提供了治療有效量的調節糖原GSK-3β活性的藥劑與化療藥物相組合在治療對象的細胞增殖性病變中的應用，包括在製備用於治療所述病變的藥物中的應用。
在更多方面，本發明提供了調節GSK-3β活性的藥劑在誘導正經受化療的細胞發生細胞死亡中的應用，包括在製備用於治療所述病變的藥物中的應用。
本發明還提供了調節GSK-3β活性的藥劑與化療藥物相組合在誘導細胞發生細胞死亡中的應用，包括在製備用於治療所述病變的藥物中的應用。
在另一方面，本發明提供鑑別能用於治療細胞增殖性病變的化合物的方法，包括將糖原合酶激酶-3β與測試化合物相接觸，並測定在存在測試化合物的情況下該糖原合酶激酶-3β的活性是否被調節。
在另一方面，本發明還提供通過上述方法鑑別出的化合物。
在閱讀了以下對本發明具體實施方式
的描述及附圖之後，具有本領域普通技術人員將對本發明的其它方面和特徵有清楚的認識。
圖形簡述以下圖示通過舉例的形式，對本發明的實施方式進行了說明。


圖1A描繪了顯示經LY2119301(5μm)或ADR(1μm)或二者共處理24小時後的HCT116和HCT116 p53-/-細胞的細胞周期分布的流式細胞術圖示。細胞凋亡(sub-G1)分數如圖所示；圖1B顯示了在具有野生型或無p53表達的HCT116結腸直腸細胞中觀察到的細胞凋亡比例；圖2描繪了按圖1A處理的，並進行活化抗caspase-3染色的HCT116細胞的流式細胞術圖示。對活化caspase-3呈陽性的細胞比例如圖所示；圖3描繪了顯示經依託泊甙(10μm)或喜樹鹼(CPT，100nM)(使用或不使用LY2119301)處理24小時後的HCT116和HCT116 p53-/-細胞的細胞周期分布的流式細胞術圖示。細胞凋亡(subG1)分數如圖所示；
圖4描繪了顯示經阿黴素或依託泊甙(使用或不使用LY2119301)或單獨使用LY2119301處理的RKO細胞的細胞周期分布的流式細胞術圖示。細胞凋亡(subG1)分數如圖所示；圖5描繪了在使用或不使用LY2119301的情況下，HCTI16細胞對不同5-FU濃度的劑量應答。細胞凋亡分數通過流式細胞術確定；圖6描繪了對表達p53 shRNA或所示對照載體(左面板)的HCTI16細胞中的p53水平的分析。所示細胞經過LY2119301和ADR(1μm)或5-FU(100μm)24小時處理，並進行了流式細胞術分析。細胞凋亡(sub-G1)分數如圖所示；圖7描繪了按圖1A處理的RKO和RKO/E6細胞的流式細胞術圖示。細胞凋亡(sub-G1)分數如圖所示；圖8描繪了LY2119301、SB-216763和SB-415286三種GSK-3抑制劑的化學結構。
圖9描繪了經鋰和DNA損傷處理的HCT116細胞的流式細胞術圖示。細胞凋亡(sub-G1)分數如圖所示；圖10描繪了顯示經ADR與SB-216763或SB-415286處理的HCT116細胞的細胞周期分布的流式細胞術圖示。細胞凋亡(sub-G1)分數如圖所示；圖11描繪了顯示經LY21 19301、SB-216763和SB-415286(使用或不使用ADR)處理的細胞中p53、p21、PARP和β-肌動蛋白相對水平的免疫印跡分析。
圖12描繪了對經鋰、LY2119301、SB-216763或SB-415286處理的HCT116細胞中的phosphor-ser9/21-GSK-3α/β、phosphor-tyr216/279-GSK-3α/β和總GSK-3α/β的免疫印跡分析；圖13描繪了在使用10μM依託泊甙進行24小時處理前，使用GSK-3β或GSK-3α特異性siRNA和陰性對照siRNA(NC siRNA)對HCT116細胞進行轉染。GSK-3α/β和PARP裂解的水平通過免疫印跡進行了分析；圖14描繪了對經LY2119301、SB-216763或SB-415286(使用或不使用ADR)處理的細胞中的細胞核和細胞質部分的phosphor-ser9/21-GSK-3α/β、phosphor-tyr216/279-GSK-3α/β和總GSK-3α/β的免疫印跡分析；圖15描繪了對以規定時間和劑量經ADR{上面板}、依託泊甙{中面板}、5-FU{底面板}(使用或不使用LY2119301)處理的HCTI16細胞中的p53、p21、puma、bax和PARP的免疫印跡分析，β-肌動蛋白被作為上樣對照；圖16描繪了對按圖15處理的RKO細胞中的p53、p21、puma、bax和PARP的免疫印跡分析；圖17描繪了對以所示藥物(使用或不使用鋰){左面板}處理，以及使用LY119301、SB-216673或SB-415286{右面板}的情況下經ADR處理的HCTI16細胞中的p53、p21、puma、Bax和PARP的免疫印跡分析；圖18描繪了顯示經ADR單獨處理或經ADR和LY2119301處理的HCT116細胞中的p53應答基因的微陣列分析。使用簇狀和樹狀觀察器聚集12種所選的之前已被鑑定為HCT116細胞中的靶基因的基因；圖19描繪了將p53-誘導DLD1細胞在含(tet off)或不含(tet on)20ng/ml強力黴素的培養基中培養24小時。左面板在使用或不使用LY2119301情況下的流式細胞術圖示。右面板顯示p53、p21和PARP水平的蛋白質印跡測定。
圖20描繪了使用LY2119301或DMSO對受Ad-p53或Ad-lacZ感染的HCT116細胞進行24小時處理。對細胞進行流式細胞術分析{左面板}和針對p53、p21和PARP的免疫印跡分析{右面板}。NS-上樣對照；圖21描繪了顯示經ADR或依託泊甙24小時處理(使用或不使用LY2119301)的HCTI16 Bax-/-細胞的細胞周期分布的流式細胞術圖示。細胞凋亡(sub-G1)分數如圖所示；圖22描述了按圖21處理的HCT116 Puma-/-細胞的流式細胞術圖示；圖23描述了對按所示處理的HCT116 Bax-/-細胞中的p53、p21和PARP的免疫印跡分析；
圖24描述了對按所示處理的HCT116 Puma-/-細胞中的p53、p21和PARP的免疫印跡分析；圖25描述了顯示經所示藥物24小時處理{上面板}的HCT116細胞中的Bax激活的蛋白質印跡測定。胞質部分的蛋白質印跡測定顯示了經LY2119301和ADR或依託泊甙{下面板}共處理的HCT116細胞中的細胞色素c釋放及caspase-9的蛋白水解作用。
圖26描繪了顯示經LY2119301處理，具p53誘導的DLD1細胞{左面板}和具p53過表達的HCT116細胞{右面板}中Bax激活的IP-蛋白質印跡測定；圖27描述了顯示JC-1染色作為HCT116及HCT116 Bax-/-細胞中線粒體膜電勢指示的流式細胞術圖示。ψm喪失的細胞的百分比如圖所示；和圖28描述了在經依託泊甙和5-FU處理(上面板)後胞質和線粒體中p53積聚的時間過程分析。P53積聚出現在依託泊甙24小時處理後(使用或不使用LY2119301)。P53和線粒體標記CoxIV的水平通過蛋白質印跡分析確定。
發明詳述此處所描述的方法涉及通過調節GSK-3β的活性(或將其與化療藥物相組合)來促進、誘導或增強增殖細胞(包括正經受化療的細胞)中的細胞凋亡應答。
糖原合酶-3激酶(GSK-3)是一種組成型表達的絲氨酸-酪氨酸激酶。它具有兩種同種型(α和β)，並與多種信號通路相關(Cohen，P.and Frame，S.，Nat Rev MoI Cell Biol，2769-776，2001)。最初被描述為糖原代謝涉及的主要酶的GSK-3β現在被發現具有調整多種細胞功能的作用，包括在神經元和其它組織中起著前一細胞凋亡的作用(Watcharasit，P.，et al.，J Biol Chem，27848872-48879，2003；Herman，M.，et al.，J Neurosci，202567-2574，2000；Bijur，G.N.，et al.，J Biol Chem，2757583-7590，2000)。
本發明中的方法基於此處所述的發現，即GSK-3β的藥理學調節顯著損害了靶基因(包括p21和Puma)的p53-依賴轉活，但促進了Bax的p53-依賴性構象激活，造成細胞色素c釋放、線粒體膜電勢喪失及caspase-9加工。這些觀察結果表明p53-介導的損害應答可被從細胞周期阻滯轉換為細胞凋亡，尤其是在被暴露於多種化療藥物之後。人們發現這種效應似乎與GSK-3β的抑制性絲氨酸9磷酸化的調節有關，但與激活性酪氨酸磷酸化無關。人們還進一步發現細胞凋亡的誘導似乎通過需要Bax而不是Puma的直接線粒體通路發生。
在此處描述的發現中，GSK-3β被發現參與了調節細胞核和線粒體中的p53活動。與說明GSK-3β的促凋亡作用的其它研究不同，本方法基於GSK-3β的藥理學調節極大地促進了正經受化療的增殖細胞(包括癌細胞，如結腸直腸癌細胞)中的p53-誘導的細胞凋亡這一發現。即使同時出現p53轉錄活性的損害，細胞凋亡也會發生，並且似乎通過直接線粒體p53活性(似乎需要Bax而不需要Puma)介導。不受任何具體理論的束縛，組成型表達的細胞激酶GSK-3β在調節p53通路方面似乎具有雙重但不同的作用促進細胞核中的p53轉錄活性但抑制線粒體中p53的直接細胞凋亡活性。
因此，本方法涉及調節正經受化療的不受控制的增殖細胞中的GSK-3β活性。這種調節將促進、誘導或增強這類細胞中的細胞凋亡應答，以治療增殖性病變。
在一實施方式中，提供誘導細胞死亡的方法，包括調節細胞中的糖原合酶激酶-3β活性。
此處使用的糖原合酶激酶-3β(″GSK-3β″)指的是糖原合酶激酶-3的β同種型，它在細胞凋亡應答中起著作用，包括哺乳動物GSK-3β(包括人類GSK-3β)。該術語包括GSK-3β的同系物、片段、衍生物或具有GSK-3β的細胞凋亡調節作用的GSK-3β變體，可通過調節這種活性來誘導增殖細胞中的細胞凋亡應答。
如果兩種序列在特定部位具實質相同性並且序列保留了功能活性，那麼一種多核苷酸序列或多肽序列是另一種序列的「同系物」、或與另一種序列「同源」(此處使用的術語「同源」不指進化親緣關係)。當最佳排列(允許存在缺口)時，如果兩種多聚核苷酸序列或多肽序列具有至少約50％的序列相同性，或序列具有特定的功能性基序，這兩種序列被視為具有實質相同性。在選擇實施方式中，如果在特定部位具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的相同性，最佳排列的序列可被視為是實質上相同的(即，具有實質相同性)。「無關」或「非同源」序列與本發明的多肽或多核苷酸在特定同源性部位的相同性低於40％，並可能低於約35％、30％或25％。術語「相同性」和「相同」指的是兩種肽或兩種多核苷酸分子之間的序列相似性。相同性可通過比較排列序列中的各個位置進行確定。胺基酸序列之間的相同性的程度是序列所佔位置(即，特定部位)的相同或匹配胺基酸數目的函數。用於比較相同性的序列的最佳排列可使用多種算法進行，如已知文獻中包括的ClustalW程序(參見http://clustalw.genome.ad.jp，the local hornology algorithm of Smith andWaterman，1981，Adv.Appl.Math 2482，the homology alignment algorithm ofNeedleman and Wunsch，1970，J MoI.Biol.48443，the search for similaritymethod of Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.ScL USA 852444，andthe computerised implementations of these algorithms(such as GAP，BESTFIT，FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package.GeneticsComputer Group，Madison，WI，U.S.A.))。序列相同性還可通過BLAST算法進行確定(參見Altschul et ah，1990，J.MoI.Biol.215403-10(使用公開預設設置))。進行BLAST分析的軟體可從國家生物技術信息中心獲得(通過網址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。此處所用的「同源胺基酸序列」包括任何具有全部或部分在低於臨界解鏈溫度(Tm)的25-35℃下雜交的核酸序列編碼，和任何含有哺乳動物GSK-3β(包括人GSK-3β)核酸序列編碼的多肽。
GSK-3β變體或衍生物指的是GSK-3β蛋白質或保留有GSK-3β細胞凋亡調節活性的片段，或在一個或多個胺基酸發生突變(包括點突變、插入或缺失突變)，但仍保留有GSK-3β細胞凋亡調節活性的GSK-3β。變體或衍生物因此包括缺失(包括截斷和片段)；插入和添加(例如保守置換、定點突變和等位基因變體)；以及修飾(包括具有一種或多種與肽共價連接的非-氨基醯基(q.v.，糖、類脂等)的類肽)和翻譯後修飾。此處所用的術語「保守胺基酸置換」或「保守置換」指的是在肽指定位置一種胺基酸對另一種的置換，其中的置換可在不實質喪失相關功能的情況下進行。在進行這類改變時，對相似胺基酸殘基的置換可基於側鏈置換基的相對相似性進行，例如，它們的大小、電荷、疏水性、親水性等等，並且可通過常規測試對這類置換對肽功能的影響進行測定。
GSK-3β的「細胞凋亡調節活性」或「細胞凋亡活性」指的是GSK-3β與p53細胞凋亡通路(包括細胞核中的p53轉錄激活通路和線粒體中的p53誘導細胞凋亡的直接效應)的相互作用或影響能力。GSK-3β的細胞凋亡調節活性至少部分受到GSK-3β抑制性絲氨酸磷酸化的影響。例如，人GSK-3β中Ser9磷酸化增加將造成直接線粒體p53細胞凋亡通路的細胞凋亡應答增加。GSK-3β的細胞凋亡調節活性還可包括GSK-3β促進p53-激活的轉錄的能力。
誘導細胞死亡指的是引發細胞死亡或細胞凋亡或增強細胞遭受細胞死亡或細胞凋亡的能力或趨勢，或增強細胞對可能引發細胞死亡或細胞凋亡的事件的敏感性，此處所用的誘導細胞死亡指的是作為對GSK-3β活性進行調節的直接或間接結果。細胞死亡或凋亡可通過標準凋亡測定法或通過檢測已知凋亡標記(例如，細胞色素c釋放、線粒體膜電勢喪失、caspase-3激活、caspase-9加工、PARP裂解或細胞培養或細胞群中亞-GI數增加，本領域人員都知道)進行測量。誘導細胞死亡可在體外或體內進行。
當說到將被誘導細胞死亡的細胞，或增殖細胞(包括增殖性病變中涉及的細胞)時，除非另有說明，術語「細胞」指的是單個細胞、多個細胞或細胞群。細胞可以是任何需要在其中抑制增殖或分化的細胞，或在其中需誘導細胞死亡的細胞(包括喪失了經受細胞周期停滯或凋亡能力的細胞)。細胞可以是培養中的細胞，也可是病人體內的細胞。此處所使用的細胞增殖指的是DNA複製、生長和分化的過程，這將引起細胞總數的增加。細胞可以來自任何表達GSK-3β同系物的生物體，在具體實施方式
中為哺乳動物細胞，包括小鼠細胞、大鼠細胞、兔細胞或人細胞。
細胞可以是正在經受化療的細胞，即細胞正在被進行化療方案處理，包括與調節GSK-3β活性同時、與之重疊或與之順序處理，條件是化療的作用或效果與調節在細胞內伴隨進行。因此，「正經受化療」包括時間長於或短於調節GSK-3β活性時間的化療。化療和化療藥物在文獻中已知，並在此處進行了進一步描述。
細胞內的細胞死亡通過調節該細胞中GSK-3β的活性誘導。「調節GSK-3β的細胞凋亡調節活性」或「對GSK-3β的細胞凋亡調節活性進行調節」指的是任何上調、下調、刺激、激活、增加、破壞、中斷、減少、限制、阻斷或防止GSK-3β行使其生物功能或活性(包括調節、誘導、實現p53-依賴性細胞凋亡通路或與之相互作用，因而造成誘導細胞死亡)的能力。調節包括增強或誘導p53-依賴性細胞凋亡、或抑制或下調p53-激活的轉錄的效應。調節包括GSK-3β的物理變更，例如通過翻譯後修飾、必需翻譯後轉錄的喪失或缺乏、胺基酸序列突變(包括缺失、插入和置換突變)或蛋白質消化。調節還包括穩定、誘導、對抗、抑制或與GSK-3β和細胞凋亡因子之間的相互作用相競爭，細胞凋亡因子是GSK-3β的靶子，GSK-3β通常與之相互作用來影響細胞周期前進或抑制細胞死亡。這類翻譯後修飾包括抑制性磷酸化，例如，可降低GSK-3β激酶活性的絲氨酸磷酸化，以及對激活磷酸化的抑制或下降調節，例如降低GSK-3β的酪氨酸磷酸化的水平。調節進一步還包括藥理學調節，例如使用GSK-3β抑制劑(如小分子抑制劑或蛋白質或肽抑制劑)進行對抗、競爭性或非競爭性抑制。
因此，細胞完成了為對細胞中GSK-3β的活性進行調節的處理。調節可通過使用調節GSK-3β活性的藥劑對細胞進行處理來完成。藥劑可以是GSK-3β活性抑制劑，例如，抑制、幹擾、競爭或中斷GSK-3β細胞凋亡調節活性的化合物，包括造成、刺激或增強GSK-3β抑制性絲氨酸磷酸化的分子或抑制或下調GSK-3β的激活性酪氨酸磷酸化的分子。
藥劑可以是小分子、肽、蛋白質、抗體或其功能性片段，酶或激素。藥劑可以是競爭性ATP抑制劑、Mg2+的競爭性抑制劑或蛋白激酶抑制劑。
在一
具體實施例方式
中，藥劑為小分子LY2119301或其衍生物或類似物，其化學結構在圖8中進行了描繪。在另一實施方式中，藥劑為鋰，包括氯化鋰。
藥劑可能能通過體內途徑運送至細胞，如通過主動或被動運輸進入細胞內，或通過擴散進入細胞內。例如，如果藥劑為小分子，它可被溶於細胞膜並能穿透細胞。藥劑也可經過修飾生成運輸標記物促進其向細胞內運輸。可使用特定的運輸標記物以指引藥劑被特定靶細胞吸收。例如，藥劑可經過修飾生成半乳糖殘基增加肝細胞對藥劑的吸收，如美國專利US6,844,319所描述那樣，該專利在此被全文引入作為參考。如果藥劑為肽，加入例如膜轉位序列這樣允許其所在的肽被運送入細胞內的序列(如從果蠅控制觸角基因同源結構域蛋白穿透序列)可促進細胞對藥劑的吸收。或者，藥劑可被包含入能增加或誘導細胞對藥劑的吸收的生物材料中，例如，將藥劑裝入膠囊製成脂質體製劑。肽和蛋白質向細胞內的脂質體運輸在文獻中已知，並在例如美國專利US 6,372,720及US 20030108597有描述，以上專利在此被引入作為參考。
因此，對GSK-3β細胞凋亡調節活性動的調節可通過將細胞暴露於藥劑下，使細胞吸收藥劑，藥劑與GSK-3β、GSK-3β的靶基因、或與p-53依賴細胞凋亡通路相互作用以調節GSK-3β的活性來完成。
調節還可進一步與化療藥物相組合而實現。與化療藥物「相組合」意味著調節發生在化療藥物與細胞相接觸或被施用於細胞的時間段中。GSK-3β的調節及化療藥物的給入可同時或順序進行，各自的時間段可連續或重疊。調節和施用可通過一次或多次分別治療完成或在要求的給定時間段內持續進行以達到想要的結果。
根據化療藥物的性質，還可按與上述使用調節GSK-3β活性進行治療類似的方式使用化療藥物對細胞進行進一步處理。使用化療藥物處理細胞可在使用藥劑調節GSK-3β活性之前、之後或同時進行。
化療藥物可以是通常被給予細胞，具有細胞毒性或抑制細胞效應的化合物。化療藥物可以是，即使在無調節GSK-3β活性的藥劑的情況下，可誘導異常增殖細胞中的細胞凋亡(如p53-依賴性細胞凋亡)或誘導細胞周期停滯(包括p53-依賴性細胞周期停滯)的藥劑。化療藥物還可以是可激活異常增殖細胞中的p53或p21，但由於異常增殖細胞的特性(如p53或p53通路中的更改或突變)不誘導細胞凋亡的藥劑。使用化療藥物接合調節GSK-3β活性的藥劑對細胞進行治療可誘導細胞死亡或增加對細胞死亡的敏感性，敏感性水平高於在未使用調節GSK-3β活性的藥劑時觀察到的結果。
化療藥物可以是可激活增殖細胞中p53-依賴性細胞凋亡或p53-依賴性細胞周期停滯的DNA損傷劑或具基因毒性的藥劑。化療藥物可以是，不受限制地，小分子、肽或蛋白質、蒽環類抗生素、烷化劑、烷基磺酸鹽、氮丙啶、乙烯亞胺、methylmelamine、氮芥、亞硝脲、抗生素、抗代謝劑、葉酸類似物、嘌呤類似物、嘧啶類似物、酶、鬼臼毒素、含鉑藥劑或細胞因子。化療藥物優選已知對特定細胞增殖性病變和細胞類型具有治療作用的藥劑。在有的實施方式中，化療藥物為阿黴素(ADR)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、依託泊甙或喜樹鹼或其衍生物或類似物。
GSK-3β活性調節在體外和體內都有用，並可被用於治療或抑制與異常增殖細胞相關的疾病或病變，起到誘導細胞死亡的作用。
因此，在一實施方式中，提供治療細胞增殖性病變的方法，包括調節GSK-3β活性。該方法通過給予對象治療有效量的調節GSK-3β活性的藥劑來完成。
「增殖性病變」是一種病人體內細胞異常增殖、造成細胞無控制地生長和分化的疾病或病變。在健康個體中細胞的生長和分化無增生或以一種有控制的方式增生。增殖性病變可以惡性或非惡性細胞群增生為特徵。這種病變包括癌症(包括結腸直腸癌、膀胱癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、宮頸癌、皮膚癌、白血病)；增生性皮膚病損(包括生殖器疣、牛皮癬及瘢痕瘤)；缺血性心臟病；獲得性免疫缺陷症候群；血管炎；類風溼性關節炎；動脈粥樣硬化症；腎小球腎炎導致的腎小球硬化症；慢性間質性腎炎導致的纖維變性；肺炎導致的纖維變性。增殖性病變包括還可能發生於正常創傷癒合過程中，潛在引起過度瘢痕化或瘢痕瘤形成的異常增殖，以及可能發生於任何炎症狀況下引起組織損害(其中宿主免疫細胞觸發成纖維細胞增殖並加工細胞外基質部分造成纖維化)的異常增殖。後者的例子包括對腦梗塞(中風)、心肌梗塞(心臟病發作)及急性局部缺血腎小管損害(暫時性腎衰竭)的宿主免疫應答。在具體實施方式
中增殖性病變為結腸直腸癌。
如果細胞的異常增殖造成了病人體內病變，或如果病變以這種細胞的增殖為特徵，則該細胞與增殖性病變有關。
術語對增殖性病變的「治療」指的是一種獲得有益或想要結果(包括臨床結果)的方法。有益或想要的臨床結果可包括但不局限於減輕或改善一種或多種症狀或狀況、減小病變範圍、穩定病情、防止疾病的發展、防止疾病擴散、延遲或減緩疾病進展、延遲或減緩疾病發作、改善或緩和疾病狀況、以及緩和(無論局部或全部)。「治療」也可意味著延長病人在不進行治療的情況下預期的存活時間。「治療」還可意味著抑制疾病的發展，暫時減緩疾病的發展，儘管更優選地是永久地停止病情的發展。
對象為任何需要進行增殖性病變治療的動物，包括哺乳動物，包括人，包括正經受化療的對象。
治療效果通過給予病人調節GSK-3β活性的藥劑(包括調節GSK-3β細胞凋亡調節活性的分子)獲得。調節GSK-3β活性的藥劑可為任何上述可被用於影響細胞中調節的藥劑，包括增加、增強或促進GSK-3β抑制絲氨酸磷酸化的藥劑。
給予病人治療有效量的調節GSK-3β活性的藥劑。此處使用的術語「有效量」指的達到想要的結果(如治療特定增殖性病變)所需劑量和時間的有效量。
使用已知標準技術對病人進行施用。藥劑可全身性的、或直接在與增殖性病變相關的增殖細胞存在的部位定點給予病人。定點給藥方式包括局部給藥、點注射或手術植入，如在癌症部位。
給予病人的調節GSK-3β活性的藥劑的濃度和量根據待治療的增殖性病變、與增殖性病變相關的細胞類型、給予病人的分子類型、給藥方式以及病人的年齡和健康狀況而改變。
調節GSK-3β活性的藥劑可按以上所述與化療藥物組合給予病人。調節GSK-3β活性的藥劑與化療藥物的「組合」可按相同劑型配製在一起或按單獨劑型配置，單獨劑型可為同一形式或不同形式，按同樣的方式或不同給藥方式給予病人。並且，當兩種藥劑不是按相同劑型一起給予時，給予調節GSK-3β活性的藥劑與化療藥物的結合意味著調節GSK-3β活性的藥劑和化療藥物被同時給予對象，並可同時給予或按任何次序順序給予或在不同時間給予對象。因此，調節GSK-3β活性的藥劑與化療藥物可分開給藥但給藥時間應足夠近以獲得想要的治療效果。
調節GSK-3β活性的藥劑，或這種藥劑與化療藥物的結合，可作為單獨治療給予病人或與其它療法(包括放射療法或其它抗病毒療法)相結合給予病人。例如，調節GSK-3β活性的藥劑，或該藥劑與化療藥物的結合，可在手術切除早期腫瘤之前或之後給予病人或在進行治療(如放射性治療)之前、同時或之後給予病人。
為有助於施用，調節GSK-3β活性的藥劑可被作為一種成分配製在藥物組合物，任選地加入治療藥物，包括上述化療藥物。因此，在一進一步的實施方式中，提供含有調節GSK-3β活性的藥劑和藥用可接受的稀釋劑的藥物組合物。因此本發明一方面還包括了這種用於治療增殖性病變的藥物組合物。該組合物可常規含有藥用可接受的濃度的鹽、緩衝劑、防腐劑和各種合適的載體。對於所有形式的給藥，調節GSK-3β活性的藥劑可被製成生理鹽水溶液。當調節GSK-3β活性的藥劑為肽或蛋白質時，由於肽在給藥時可能不穩定，可能需要將肽或蛋白質裝在脂質體或其它生物材料中以保護和/或保存肽或蛋白質直至其被輸送至靶細胞為止。
藥物組合物還可含有其它對治療特定增殖性病變有用的治療藥劑，如細胞毒素劑，如化療藥物。
藥用可接受的稀釋劑的比例及性質通過所選的給藥途徑、與活細胞的兼容性以及標準藥學實踐確定。通常，藥物組合物將使用對調節GSK-3β活性的藥劑的生物特性無顯著損害的成分配製而成。
藥物組合物可通過已知的製備適於對病人進行給藥的藥用可接受的組合物的方法製備，以使有效量的調節GSK-3β活性的藥劑及任何額外的有效成分或物質通過藥用可接受的賦形物結合為混合物。合適的賦形物在文獻中已有描述，如，在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，USA 1985)中。在此基礎上，藥物組合物包括(不是排他性的)調節GSK-3β活性的藥劑溶液，與一種或多種藥用可接受的賦形劑或稀釋劑相結合，並包含於具合適pH值並與生理溶液等滲的緩衝液中。
藥物組合物可根據選擇的給藥途徑，以多種形式給予病人，本領域人員將明白如何進行選擇。本發明中的組合物可通過局部給藥、手術給藥或通過注射至所需部位進行給藥。
調節GSK-3β活性的藥劑溶液可被製備為生理學上合適的緩衝液。在一般儲存及使用條件下，這些製劑含有防止微生物生長的防腐劑，可使藥劑保持調節GSK-3β活性的功能。本領域人員知道如何製備合適的製劑。選擇及製備合適的製劑的常規程序和原料在文獻中已有描述，如在Remington′sPharmaceutical Sciences and in The United States PharmacopeiaThe NationalFormulary(USP 24 NF 19)published in 1999中。
在不同實施方式中，藥物組合物通過局部或在所需部位(病人體內不受控制的增殖細胞存在的地方)直接進行注射(皮下、靜脈內、肌肉內，等等)給予病人。
將要使用的藥物組合物的劑量取決於治療的特定情況、情況的嚴重性、病人的個體參數(包括年齡、身體健康狀況、身高及體重)、治療持續時間、同步療法的性質(如有)、特定的給藥途徑及其它醫生知識及技能範圍內的類似因素。這些因素為本領域人員所熟知，使用時可將例行試驗減至最少。
按與上述方法一致的方式，目前還可預期使用調節GSK-3β活性來誘導細胞發生細胞死亡或使用調節GSK-3β活性的藥劑(或其與化療藥物相組合)來生產誘導細胞(包括正經受化療細胞)中細胞死亡的藥物。進一步還預期治療有效量的調節糖原GSK-3β活性的藥劑在治療對象體內的細胞增殖性病變中的應用或治療有效量的調節糖原GSK-3β活性的藥劑(或其與化療藥物相組合)在生產治療對象(包括正經受化療的對象)體內細胞增殖性病變的藥物中的應用。
本發明還提供了鑑別或篩選能調節GSK-3β活性以及能被用於治療細胞增殖性病變的藥劑或化合物(包括小分子或肽調整基因)的方法。將測試分子暴露於或與GSK-3β相接觸或暴露於生化通路，包括受GSK-3β調節或與其相互作用的生化通路，包括具有GSK-3β表達的細胞，包括正經受化療或與化療藥物相結合的細胞。一旦測試化合物與GSK-3β相接觸，測量GSK-3β的活性，包括GSK-3β調節細胞內細胞凋亡的能力。GSK-3β的活性可使用已知測定進行測量，包括激酶測定、細胞凋亡測定，以及檢查GSK-3β內抑制性絲氨酸磷酸化部位的磷酸化狀況和磷酸化水平。
篩選能用於治療細胞增殖性病變的藥劑和化合物的方法也適用於篩選化合物組合文庫。因此，上述方法和測定可被用於單個測試化合物或多種測試化合物。在後一種情況中，還應確定並描述化合物組合所產生的協同效應。在有的實施方式中，本發明中的篩選/測試方法的一個或多個步驟可為自動化。這種測定系統可含有多種方法以實現並使有用的測定條件最佳化。這類方法包括但不局限於合適的緩衝液，如，用於控制pH值和離子強度以及用於提供任何GSK-3β活性及穩定性所需的成分(如蛋白酶抑制劑)、使GSK-3β活性和/或穩定性最佳化的溫度控制方法、以及檢測GSK-3β活性的檢測方法。有多種這類檢測方法可使用，包括但不局限於以下一種或多種方法的組合放射性標記(如32P)、抗體檢測、螢光法、化學發光法、光譜法(例如，生成具有改變光譜特性的產物)、不同報告酶或蛋白質(如辣根過氧化酶、綠色螢光蛋白)、特定結合試劑(如生物素/鏈黴抗生物素)，等等。
目前考慮的還有通過此處所述方法確定的能調節GSK-3β活性的分子，包括小分子或GSK-3β肽調整基因。上述化合物可被用於調節GSK-3β活性，用於誘導細胞內的細胞死亡或用於治療對象體內的細胞增殖性病變，或用於生產具任何上述用途的藥物。
所有此處提到的文件均被全文引入作為參考。
儘管此處公開了本發明中的不同實施方式，不過本領域人員根據本領域的常識在發明範圍內對實施方式進行多種調整和修改。這類修改包括將本發明任何方面的已知等同物進行替換以按實質相同的方式獲得同樣的結果。除另有說明，此處使用的所有技術及科學術語具有在本發明所屬領域中具普通專業知識的人員所理解的一樣的意思。
實施例實施例1材料及方法細胞培養及藥物治療人結腸癌細胞株HCT116及其衍生同源p53-/-、Puma-/-，Bax-/-和p53-誘導型DLD細胞株，由Dr.Bert Vogelstein(JohnsHopkins University，MD)提供。RKO和RKO/E6細胞，由ATCC提供。將細胞在含有10％FBS的DMEM中進行培育。所有培養試劑及培養基，由Invitrogen提供。5-氟尿嘧啶、阿黴素、依託泊甙吉氯化鋰，購自Sigma。GSK-3β特異性小分子抑制劑，由Eli Lilly(Indianapolis)贈送。以及SB-216763，SB-415283，由BIOMOL提供。
免疫印跡法、免疫沉澱作用及微陣列分析按先前所述刮擦、收集並溶解細胞(Yu，Q.，et al.Cancer Res，625743-5748，2002)。簡單地說，使用細胞溶解緩衝液(0.3％NP40，1mM EDTA，50mM Tris-HCl(pH7.4)，2mMEGTA，1％Triton X-100，150niM NaCl，25mM NaF，1mM Na3VO4，2mMAEBSF，5μg/ml aprotinin，1μg/ml leupeptin)在冰上溶解細胞30分鐘，在4℃，12,000X g，進行15分鐘離心分離對溶胞產物進行澄清。量化蛋白濃縮物(Bio-Rad，Hercules，CA)，通過SDS/PAGE分離蛋白質樣品(50μg)並將其轉移至ImmobilonTM膜(Millipore，Bedford，MA)。使用抗以下蛋白的抗體p53(DO-I)、p21、PARP、GSK-α/β、α-微管蛋白和β-肌動蛋白(Santa CruzBiotechnology)、Puma(Ab-I，Oncogene)、Bax(Sigma)、phosphor-(Ser9/21)-GSK-3α/β和caspase-9(Cell Signaling Technologies)、phosphor-(Tyr216/279)-GSK-3α/β(Upstate Biotechnologies)、細胞色素c(BDPharMingen)。為檢測Bax的構象變化，將細胞溶於1％Chaps緩衝液中，並使用抗-Bax單克隆抗體(6A7，BD，PharMingen)對可溶性分數進行免疫沉澱，然後使用抗-Bax多克隆抗體進行免疫印跡測定。按描述進行微陣列分析(Kho，P.S.，et al.J Biol Chem，27921183-21192，2004)。
DNA含量FACS分析及caspase-3活性採集細胞並固定在70％的酒精中。在經過RNase(100μg/ml)處理後使用碘化丙啶(50μg/ml)對固定細胞染色。在FACS管TM(Becton Dickinson Instrument，San Jose，CA)中通過螢光激活細胞分選術(FACS)對染色細胞進行DNA含量分析。使用CellQuestTM軟體(Becton Dickinson)對細胞周期分數進行量化。為檢測caspase-3活性，按照指導使用Cytofix/CytopermTM溶液(BD PharMingen)對細胞進行固定，然後使用FITC-結合兔抗-活性caspase-3單克隆抗體(BD PharMingen)對細胞染色。通過流式細胞術量化caspase-3呈陽性的細胞。
RNA幹擾為產生p53敲除載體(knockdown vectors)，使用以下19-核苷酸序列gactccagtggtaatctac[SEQ ID NO1]。按照生產商的說明，將寡聚核苷酸對克隆入逆轉錄病毒表達載體pSIREN-RetroQTM(BD Bioscienses)中。簡單地說，使用p53 shRNA構造對293細胞進行48小時轉染以產生病毒顆粒。為建立p53 shRNA穩定轉染克隆，在使用5μg/ml聚凝胺(polybrene)的情況下使用逆轉錄病毒株對感染HCT116細胞。將感染細胞暴露於嘌呤黴素選擇中(2μg/ml)中。通過對p53表達的蛋白印跡分析進一步擴大和篩選穩定克隆。SMARTpoolGSK-3β、GSK-3αsiRNAs和陰性對照siRNA購自Dharmacon，Inc。
腺病毒感染腺病毒Ad-LacZ和Ad-p53由Dr.Shibin Zhou(JohnsHopkins University，MD)提供。使細胞生長至50％融合併按描述使用重組腺病毒對其進行感染(Yu，J.，et al.Proc Natl Acad Sd U S A，9614517-14522，1999)。感染24小時後，使用藥物對細胞進行指定時間的治療。
亞細胞分級使用Dounce勻質器將細胞溶於線粒體溶解緩衝液(210mM Mannitol，70mM Sucrose，10mM Hepes(pH，7.4)，ImM EDTA，proteaseinhibitor cocktail)中，並進行1000X g的離心分離除去細胞核。對去核上清液進行10,000X g離心分離除去富含線粒體的重膜成分，對所得上清液進行進一步離心分離獲取胞質成分。對來自胞質或線粒體成分的總蛋白(30μg)進行免疫印跡分析。
測量線粒體透過轉變在4℃以300X g離心分離5分鐘採集細胞。按照生產商的說明使用JC-1(BD PharMingen)對細胞染色，確定線粒體的透過轉變。通過對紅螢光減小(即，線粒體表現出較低的膜電勢(Δψm)的細胞的流式細胞計量測定量化線粒體的透過轉變。數據以具有低Δψm的細胞比例的形式給出。
結果小分子GSK-3β抑制劑以p-53依賴的方式促進了人結腸直腸癌細胞中的基因毒性藥劑誘導細胞凋亡在人結腸直腸癌HCT116細胞中，DNA損傷劑阿黴素(ADR)和DNA類似物5-氟尿嘧啶(5-FU)引起的p53激活分別造成了細胞周期停滯和細胞凋亡(Bunz，F.，et al.J Clin Invest，104263-269，1999)。為調查調節p53應答的細胞因子，我們對一系列蛋白激酶抑制劑進行了篩選並檢查了其對於DNA損傷應答的影響。我們發現一種特定的GSK-3β小分子抑制劑(L Y2119301)有效地將ADR-誘導p53應答從生長停滯轉化為了細胞死亡。圖1A和1B顯示經過ADR24小時處理後的HCT116細胞出現了細胞周期停滯(在G1和G2/M階段都出現了停滯)，無明顯的對細胞死亡的誘導。與單獨使用ADR或LY2119301處理細胞相比，同時使用ADR和LY2119301對細胞進行處理造成細胞死亡明顯增加，前一種情況的亞-G1數為～3-5％，後者為～59％。相反，在同樣的條件下，在p53敲除HCT116細胞(圖1A和1B)中未見對細胞死亡的協同誘導，說明細胞死亡為p53-依賴。由於使用caspase-3活性測定(圖2)得出了類似結果，細胞死亡被歸因於細胞凋亡。LY2119301在其它DNA損傷劑(包括依託泊甙和喜樹鹼)的作用下還觸發了p53-依賴性細胞凋亡(圖3)。在另一種p53野生型結腸癌細胞株(RKO)中也觀察到了類似結果，但在p53突變腫瘤(如SW420和HT29)中未觀察到(圖4和未顯示的數據)。另外，LY2119301以嚴格p53-依賴的方式極大地增強了5-FU-誘導細胞凋亡的敏感性(圖5)，在無p53的HCT116細胞中未觀察到細胞凋亡增加。值得注意的是，劑量效果試驗顯示LY2119301使得5-FU(最常用的治療結腸直腸癌的化療藥物)誘導的細胞凋亡增加了10-倍。因此，GSK-3β的藥理學抑制不僅將p53-介導損害應答從生長停滯轉化為了細胞凋亡，還進一步增強了p53-依賴性細胞凋亡應答的敏感性。在兩種情況中，GSK-3β的失活引發了需要p53的細胞凋亡過程，或使其敏感化。
為證實觀察到的細胞凋亡的增加確實是p53-依賴性的，而不是作為HCT116 p53-/-細胞延長培育的結果，由表型特徵引起，我們生成了一種穩定的、其中p53的表達被p53 shRNA極大弱化的HCT116細胞株(圖6，左面板)。與表達對照載體的細胞相比，這些細胞中的p53敲除顯著降低了經LY2119301和ADR或5FU共處理所誘導的細胞凋亡(圖6，右面板)。在另一野生結腸直腸癌細胞株RKO中也觀察到了LY2119301對p53應答的細胞凋亡效應，但在其p53-激活相似物RKO/E6細胞中未發現(圖7)。類似地，在其它p53突變結腸癌細胞株SW480和HT29中也未誘導細胞凋亡(數據未顯示)。這些發現表明GSK-3β抑制劑LY2119301以嚴格需要完整p53的方式促進了細胞凋亡。
GSK-3β(而不是GSK-3α)的藥理學調節促進了p53-依賴性細胞凋亡為證實GSK-3β調節是上述觀察結果的原因，我們檢查了三種其它在結構上不相關的小分子GSK-3抑制劑SB-216763、SB-415286和氯化鋰(LiCl)的影響(圖8)。前兩種化合物為對GSK-3具選擇性的競爭性ATP抑制劑(Coghlan，M.P.，et al.Chem Biol，7793-803，2000)，而氯化鋰通過充當Mg2+的競爭性抑制劑抑制GSK-3β，對其它蛋白激酶無抑制效果(Watcharasit，P.，et al.，JBiol Chern，27848872-48879，2003；Ryves，W.J.and Harwood，A.J.，BiochemBiophys Res Common，280720-725，2001；Klein，P.S.and Melton，D.A.，ProcNatl Acad Sci U S A，938455-8459，1996)。與LY2119301類似，鋰處理以p53-依賴的方式，誘導了暴露於化療藥物的HCT116細胞中強烈的細胞凋亡(圖9)。令人吃驚的是，即使在高達20μM的濃度，SB-126763和SB-415286對經ADR-處理的細胞也無任何影響(圖10)。這與LY2119301剛好相反，後者在低至250nM的濃度也能誘導經ADR-處理的細胞中的細胞凋亡(圖10)。為檢查SB-216763和SB-415286是否因DNA損傷阻斷了p53通路，我們進行了免疫印跡分析並發現這兩種抑制劑對p53穩定性或由DNA損害誘導的p53-介導p21無影響(圖11)。因此，LY2119301誘導應激細胞中細胞凋亡的能力似乎與其抑制p53-p21通路的能力密切相關。在DNA損傷後，我們的結果表明LY2119301防止了p53穩定和p21誘導，而其它抑制劑對p53活動無影響。
為調查這些化合物是否對GSK-3具差別影響，我們進行了免疫印跡分析。GSK-3含兩種同種型(α和β)，並且它們的活性可通過Tyr216/Tyr279上的激活性磷酸化或通過Ser21/Ser9上的抑制性磷酸化進行調節(Cohen，P.and Frame，S.，Nat Rev MoI Cell Biol，2769-776，2001)。特定的GSK-3抑制劑可抑制激活性酪氨酸磷酸化或誘導抑制性絲氨酸的自磷酸化作用(Cohen，P.and Frame，S.，Nat Rev MoI Cell Biol，2769-776，2001；Cohen，P. andGoedert，M.，Nat Rev Drug Discov，3479-487，2004；Zhang，F.，et al.，J BiolChem，27833067-33077，2003；Cole，A.，et al.，Biochem J，311249-255，2004)。這樣，這些特定殘基的磷酸化狀況被用來作為GSK-3α/β活性的代理標記。使用LY2119301和鋰對HCT116細胞進行處理造成GSK-3β上的抑制性絲氨酸磷酸化的相同增加，而在GSK-3α上的影響很小(圖12，2和5道)。相反，SB-126763和SB-415286僅誘導了GSK-3α上的絲氨酸21磷酸化，甚至輕微地降低了GSK-3β上的絲氨酸9磷酸化(圖12，3和4道)。並且，LY2119301幾乎完全阻斷了GSK-3α和GSK-3β上的有效絲氨酸磷酸化，而SB-126763和SB-415286僅降低了GSK-3α上的絲氨酸磷酸化(圖12，3和4道)。這些發現表明LY2119301和鋰抑制了GSK-3α和GSK-3β，但主要作用於GSK-3β，而儘管在前面使用肽-基體外蛋白酶測定中顯示出了對GSK-3α和GSK-3β同樣的抑制性，SB-126763和SB-415286僅對HCT116細胞中的GSK-3α具抑制作用(Coghlan，M.P.，et al.，Chem Biol，7793-803，2000)。因此，GSK-3抑制劑的細胞凋亡作用似乎與特定的GSK-3β而不是GSK-3α的失活相關。重要的是，鋰，與LY2119301相反，未阻斷GSK-3α/β的激活絲氨酸磷酸化(圖12，5道)，但仍能誘導細胞凋亡表型。因此，GSK-3β抑制劑的凋亡效果不要求對激活絲氨酸磷酸化的抑制。相反，GSK-3β抑制性絲氨酸9磷酸化的誘導是LY2119301和鋰的共同特徵並似乎與其凋亡作用相關。由於鋰能通過GSK-3自身直接抑制(可能是通過GSK-3-依賴磷酸酯酶1的抑制)增加絲氨酸磷酸化，LY2119301和鋰對GSK-3β絲氨酸9磷酸化的誘導不像是激活其它上升激酶(如AKT)的結果。(Klein，P.S.andMelton，D.A.，Proc Natl Acad Sd USA，938455-8459，1996)。並且，使用抑制AKT的LY294002對細胞進行處理未阻斷由LY2119301和鋰觸發的絲氨酸9磷酸化(數據未顯示)。
為測試RNA幹擾引起的GSK-3β敲除是否也會使DNA損傷-誘導細胞凋亡敏感化，使用GSK-3β、GSK-3α或陰性對照siRNA(NC siRNA))對HCT116細胞進行48小時轉染，並隨後進行依託泊甙處理。圖13顯示RNA幹擾有效、明確地分別敲除了GSK-3α和GSK-3β表達。但是，GSK-3β或GSK-3α敲除未由於依託泊甙造成更多的細胞死亡，未觀察到明顯的PARP裂解。
因此，僅降低GSK-3β水平不足以觸發DNA損傷造成的細胞死亡。這個觀察結果與GSK-3β抑制性絲氨酸9磷酸化的誘導可能對有效誘導結腸直腸癌細胞中由於DNA損傷的造成細胞凋亡很重要這一觀點一致。GSK-3βsiRNA不能誘導絲氨酸9磷酸化，不能模仿GSK-3β抑制劑的細胞凋亡作用。
我們接下來檢查了造成GSK抑制劑對細胞凋亡和p53功能不同影響的機制。由於GSK-3在胞質和細胞核中都存在，GSK-3α/β受Ser-21(α)或Ser-9(β)磷酸化的抑制而受Tyr-279(α)or Tyr-216(β)磷酸化激活，我們在經過GSK抑制劑和DNA損傷處理後尋找GSK-3磷酸化狀態的變化。在經過依託泊甙處理後，通過特定抗-Ser-9/21或抗-Tyr-216抗體評估發現，GSK-3α和GSK-3β的胞質和細胞核水平和磷酸化狀態均無變化(圖14)。有趣的是，LY2119301在細胞質和細胞核中均觸發了GSK-3β的絲氨酸磷酸化，並阻斷了α和β同種型的絲氨酸磷酸化。通過對比，其它兩種抑制劑觸發了細胞質，但未觸發細胞核中的GSK-3α絲氨酸磷酸化，並且對GSK-3β上的絲氨酸磷酸化無影響。一致的是，SB-126763和SB-415286未阻斷細胞核中GSK-3β的有效絲氨酸磷酸化。這些數據表明LY2119301對GSK-3β具高度選擇性，而其它兩種抑制劑儘管在體外測定中對GSK-3β顯示出了與對GSK-3α一樣的抑制，它們主要對胞質的GSK-3α起作用(Coghlan et al.，2000)。數據表明細胞核GSK-3β而不是GSK-3α在受到DNA損害後對p53功能起著調節作用，這與其調節細胞核對於DNA損害應答的穩定性高度相關。很明顯，細胞核GSK-3β的抑制足以降低p53數量的基礎水平，表明GSK-3β調節著正常和應激細胞中的p53積聚。
GSK-3β的藥理學調節損害了基因毒性應激引起的p53累積和p53靶基因的轉活為確定GSK-3β抑制劑對p53應答的影響，我們進行了p53和p53靶基因的免疫印跡測定。在使用或不使用LY2119301的情況下，使用ADR、依託泊甙和5-FU對HCT116(圖15)和RKO(圖16)細胞進行處理。經過化療藥物處理的細胞表現出了p53遞增積聚和其靶基因(如p21和Puma)激活，分別引起細胞生長停滯和凋亡。在使用LY2119301的情況下，化療藥物誘導的p53積聚受到顯著的、連續的損害，如p21和Puma誘導。因此，LY2119301損害了基因毒性應激引發的p53積聚並降低了其轉錄活性。重要的是，Bax(一種被認為對結腸癌細胞中的線粒體介導細胞凋亡很重要的p53靶基因)的表達(Zhang，L，et al.，Science，290989-992，2000)在p53激活後未被誘導。這與之前稱Bax不是結腸癌細胞中p53的強有力的靶基因的報導相符(Yu，J.，et al.，Proc Natl Acad Sd U S A，96145 17-14522，1999；Kokontis，J.M.，et al.，Oncogene，20659-668，2001)。因此，LY2119301處理對Bax水平無影響(圖15和16)。類似的，使用對GSK-3β具抑制作用的鋰進行處理也同樣損害了ADR、依託泊甙和5-FU誘導的p53積聚，降低了p53靶基因p21的誘導(圖17，左面板)。與細胞凋亡表型一致，在使用LY2119301或鋰的情況下，PARP的裂解在經過基因毒性藥劑處理後顯著增加。相反，僅對這些細胞中的GSK-3α具抑制作用的SB-126763和SB-415286對p53積聚和p21誘導無影響，並且不會誘導PARP裂解。(圖17，右面板)。
為將這些觀察擴展至其它p53靶基因，我們使用微陣列分析進行了球面表達剖析。我們之前已確定了HCT116細胞中p53應答基因亞群(Kho，P.S.，et al.，J Biol Chem，27921183-21192，2004)。使用ADR和LY2119301同時治療一致減弱了這些基因的誘導(圖18)，表明GSK-3β在p53-依賴轉活中起著重要的作用。GSK-3β失活促進了p53-介導細胞凋亡，而取消了p53靶基因(包括Puma)這一看似矛盾的發現提出了一個誘人的可能性即GSK-3β抑制劑通過不依賴p53-介導轉錄的機制促進p53-依賴性細胞凋亡。
GSK-3β抑制劑LY2119301促進了外源性p53誘導的細胞凋亡我們接下來調查了GSK-3β失活是否也促進了p53外源性過表達誘導的細胞凋亡。我們使用了兩種p53表達系統具有結腸癌DLD1細胞株表達的四環素-誘導p53(Yu，J.，et al.，Proc Natl Acad Sd USA，9614517-14522，1999)和感染了腺病毒表達p53的HCT116細胞。在兩種情況中，強迫p53表達誘導的細胞凋亡在使用了LY2119301的情況下顯著增加(圖19和20)。在這些情況下，可能是由於對p53的非生理調節，LY2119301對異位表達p53蛋白水平或p21的p53依賴轉錄無影響(圖19和20，右面板)。因此，既然已有報導稱p21和p53促細胞凋亡靶基因(如Puma)之間平衡的改變可將p53應答從細胞生長停滯轉化為細胞凋亡，這種細胞凋亡誘導不像是由於p21表達降低引起的，(Seoane，J.，et al.，Nature，419729-734，2002；Iyer，N.G.，et al.，ProcNatl Acad Sd USA，1017386-7391，2004)。
GSK-3β抑制劑促進的細胞凋亡需要Bax而不是Puma促細胞凋亡Bcl2家族成員Bax和Puma在p53-介導細胞凋亡中已出現(Yu，J.，et al.，MoI Cell，7673-682，2001；Yu，J.，et al.，Proc Natl Acad Sd USA，1001931-1936，2003)。為進一步評估在GSK-3β失活後Bax和Puma在p53-依賴性細胞凋亡中的作用，我們使用了經過同源重組刪除了其中一種基因的HCT116細胞(Zhang，L.，et al.，Science，290989-992，2000；Yu，J.，et al.，Proc Natl AcadSd USA，1001931-1936，2003)。當使用LY2119301和ADR或依託泊甙共處理時，Bax-/-細胞完全抗拒細胞凋亡(圖21)。相反，Puma-/-細胞仍能進行明顯的細胞凋亡，與親代HCT116細胞一樣(圖22)。一致的，在Bax-/-細胞中未觀察到PARP裂解(圖23)，但在Puma-/-細胞中很明顯(圖24)，儘管在這兩種細胞株中，經ADR或依託泊甙處理後的p53積聚和p21誘導都類似地被LY2119301降低(圖23和24)。這些結果表明GSK-3β抑制劑促發的依賴p53但不依賴轉錄的細胞凋亡通過需要Bax而不需要Puma的通路進行。支持這一觀點，結腸癌LoVo細胞對LY2119301受DNA損害而誘導的細胞凋亡具抵抗性(數據未顯示)。LoVo細胞為p53野生型，但由於Bax基因移碼突變不具備Bax蛋白質表達(Ionov，Y.，et al.，Proc Nail Acad Sd USA，9710872-10877，2000)。
GSK-3β抑制促進了Bax的p53-依賴構象激活並誘導了線粒體細胞死亡Bax在細胞凋亡中被認為發生了構象變化(Wolter，K.G.，et al.，J Cell Biol，1391281-1292，1997)。我們接下來檢查了GSK-3β抑制劑在DNA損傷後是否誘導了Bax的構象激活。使用LY2119301和基因毒性藥劑ADR、依託泊甙和5-FU同時對HCT116細胞進行處理，極大地增加了構象激活Bax的水平(圖25)，這可通過特定的抗-Bax單克隆抗體6A7檢測出，如前所述(Suzuki，M.，et al.，Cell，103645-654，2000；Nechushtan，A.，et al.，Embo J，182330-2341，1999)。Bax激活似乎為p53-依賴，因為未發現處於同樣情況下的HCT116 p53-/-細胞中的Bax構象有任何變化(圖25)。一致地，在使用LY2119301的情況下，DNA損傷後細胞色素c釋放和caspase-9加工的增加都很明顯(圖25，低面板)。在使用LY2119301的情況下，在具有合併p53過度表現的DLD1細胞和HCT116細胞中也見到了類似的Bax激活(圖26)。並且，通過JC-1染色和FACS測定，發現使用LY2119301和其它基因毒性共處理過的Bax+/+細胞中線粒體膜電勢顯著降低，而在同樣情況下的Bax-/-細胞中未見降低(圖27)。總的來說，這些發現說明GSK-3β抑制劑通過Bax-介導線粒體通路促進了p53-依賴性細胞凋亡。
以上結果提出了一個可能性，即GSK-3β抑制劑可能能使p53在線粒體中積聚，因而造成了DNA損害後觀察到的細胞凋亡。為說明這個觀點，我們首先對經過依託泊甙和5-FU處理後不同時間點的胞質和線粒體中p53的積聚進行了監控。我們發現線粒體中的p53在經依託泊甙和5-FU處理後2小時就開始積聚，而胞質中的p53直到藥物處理後6小時還未積聚(圖28)。這與近期一個顯示DNA損傷觸發了小鼠胸腺內快速p53線粒體積聚，觸發了第一輪細胞死亡的報告一致(Erster，S.，et al.，MoI Cell Biol，246728-6741，2004)。但是，依託泊甙-誘導的HCT116細胞線粒體中的p53積聚未能誘導細胞凋亡。這說明線粒體中的p53積聚從本質上不足以激活HCT116細胞中的細胞凋亡。並且，在使用LY2119301的情況下，依託泊甙-誘導的p53積聚在胞質和線粒體中出現了類似下降(圖28)，儘管這些情況下誘導了強大的細胞凋亡。因此，我們得出結論，結腸直腸癌細胞中線粒體p53水平似乎與結腸直腸癌細胞中的細胞凋亡誘導無關，而GSK-3β抑制劑對p53應答的細胞凋亡效應不像是由於p53向線粒體異位增加引起的。
本領域人員可以理解，許多對此處所述的例證性實施方式的修改都是可能的。而本發明在於包括所有本發明範圍內的類似修改，如權利要求書中所規定那樣。
序列表110新加坡科技研究局120GSK-3β的調節及治療增殖性病變的方法13093231-109150US 60/586,2961512004-07-091601170PatentIn version 3.3210121119212DNA213artificial220
223synthetic oligonucleotide4001gactccagtg gtaatctac 19
權利要求
1.一種治療細胞增殖性病變的方法，該方法包括給有需要並正經受化療的對象施用治療有效量的調節糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)活性的藥劑。
2.一種治療細胞增殖性病變的方法，該方法包括給有需要的對象施用治療有效量的調節GSK-3β活性的藥劑，所述藥劑與化療藥物相組合。
3.權利要求1和2的方法，其中細胞增殖性病變為癌症。
4.權利要求3的方法，其中癌症選自結腸直腸癌、膀胱癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、宮頸癌、皮膚癌和白血病。
5.權利要求4的方法，其中癌症選自結腸直腸癌。
6.權利要求1至5中任一項的方法，其中對象為人。
7.誘導正經受化療的細胞發生細胞死亡的方法，該方法包括調節細胞中的糖原合酶激酶-3β活性。
8.誘導細胞發生細胞死亡的方法，該方法包括調節細胞中的糖原合酶激酶-3β活性並將細胞與化療藥物接觸。
9.權利要求7或權利要求8的方法，其中所述調節誘導p53-依賴性細胞凋亡。
10.權利要求7或權利要求8的方法，其中所述調節抑制p53-激活的轉錄。
11.權利要求7至10中任一項的方法，其中所述調節包括將細胞與調節GSK-3β活性的藥劑相接觸。
12.權利要求1或7的方法，其中化療誘導p53-依賴性細胞凋亡。
13.權利要求1或7的方法，其中化療誘導p53-依賴性細胞周期停滯。
14.權利要求1或7的方法，其中化療涉及阿黴素、5-氟尿嘧啶或依託泊甙。
15.權利要求2或8的方法，其中化療藥物誘導p53-依賴性細胞凋亡。
16.權利要求2或8的方法，其中化療藥物誘導p53-依賴性細胞周期停滯。
17.權利要求2或8的方法，其中化療藥物為阿黴素、5-氟尿嘧啶或依託泊甙。
18.權利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中所述調節GSK-3β活性的藥劑引起GSK-3β發生抑制性絲氨酸磷酸化。
19.權利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中所述調節GSK-3β活性的藥劑為競爭性ATP抑制劑。
20.權利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中所述調節GSK-3β活性的藥劑為Mg2+的競爭性抑制劑。
21.權利要求1至6和11至17的方法，其中所述調節GSK-3β活性的藥劑為蛋白激酶抑制劑。
22.權利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中所述調節GSK-3β活性的藥劑抑制GSK-3β發生激活性酪氨酸磷酸化。
23.權利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中所述調節GSK-3β活性的藥劑為含鋰化合物。
24.權利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中所述調節GSK-3β活性的藥劑為LY2119301、或其功能類似物、或氯化鋰。
25.權利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中調節GSK-3β活性誘導p53-依賴性細胞凋亡。
26.權利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中調節GSK-3β活性抑制p53-激活的轉錄。
27.治療有效量的調節糖原GSK-3β活性的藥劑在治療正經受化療的對象的細胞增殖性病變中的應用。
28.治療有效量的調節糖原GSK-3β活性的藥劑與化療藥物相組合在治療對象中的細胞增殖性病變中的應用。
29.治療有效量的調節糖原GSK-3β活性的藥劑在生產用於治療正經受化療的對象的細胞增殖性病變的藥物中的應用。
30.治療有效量的調節糖原GSK-3β活性的藥劑與化療藥物相組合在生產用於治療對象的細胞增殖性病變的藥物中的應用。
31.權利要求27至30中任一項的應用，其中細胞增殖性病變為癌症。
32.權利要求31的應用，其中癌症選自結腸直腸癌、膀胱癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、宮頸癌、皮膚癌和白血病。
33.權利要求32的應用，其中癌症選自結腸直腸癌。
34.權利要求27至33中任一項的應用，其中對象為人。
35.調節GSK-3β活性的藥劑在誘導正經受化療的細胞發生細胞死亡中的應用。
36.調節GSK-3β活性的藥劑與化療藥物相組合在誘導細胞發生細胞死亡中的應用。
37.調節GSK-3β活性的藥劑在生產用於誘導正經受化療的細胞發生細胞死亡的藥物中的應用。
38.調節GSK-3β活性的藥劑與化療藥物相組合在生產用於誘導細胞發生細胞死亡的藥物中的應用。
39.權利要求27、29、35和37中任一項的應用，其中化療誘導p53-依賴性細胞凋亡。
40.權利要求27、29、35和37中任一項的應用，其中化療誘導p53-依賴性細胞周期停滯。
41.權利要求27、29、35和37中任一項的應用，其中化療涉及施用阿黴素、5-氟尿嘧啶或依託泊甙。
42.權利要求28、30、36和38中任一項的應用，其中化療藥物誘導p53-依賴性細胞凋亡。
43.權利要求28、30、36和38中任一項的應用，其中化療藥物誘導p53-依賴性細胞周期停滯。
44.權利要求28、30、36和38中任一項的應用，其中化療藥物為阿黴素、5-氟尿嘧啶或依託泊甙。
45.權利要求27至44中任一項的應用，其中所述調節GSK-3β活性的藥劑引起GSK-3β發生抑制性絲氨酸磷酸化。
46.權利要求27至44中任一項的應用，其中所述調節GSK-3β活性的藥劑為競爭性ATP抑制劑。
47.權利要求27至44中任一項的應用，其中所述調節GSK-3β活性的藥劑為Mg2+的競爭性抑制劑。
48.權利要求27至44中任一項的應用，其中所述調節GSK-3β活性的藥劑為蛋白激酶抑制劑。
49.權利要求27至44中任一項的應用，其中所述調節GSK-3β活性的藥劑抑制GSK-3β發生激活性酪氨酸磷酸化。
50.權利要求27至44中任一項的應用，其中所述調節GSK-3β活性的藥劑為含鋰化合物。
51.權利要求27至44中任一項的應用，其中所述調節GSK-3β活性的藥劑為LY2119301或其功能類似物或氯化鋰。
52.權利要求27至44中任一項的應用，其中所述應用誘導p53-依賴性細胞凋亡。
53.權利要求27至44中任一項的應用，其中所述應用抑制p53-激活的轉錄。
54.一種鑑別可用於治療細胞增殖性病變的化合物的方法，包括(a)將糖原合酶激酶-3β與測試化合物相接觸；並(b)測定在存在所述測試化合物的情況下所述糖原合酶激酶-3β的活性是否被調節。
55.權利要求54的方法，其中步驟(a)包括將表達所述糖原合酶激酶-3β的細胞與所述測試化合物相接觸。
56.通過權利要求54或權利要求55的方法所鑑別的化合物。
全文摘要
本發明提供了促進細胞死亡的方法和應用，當其與化療藥物相結合時，可促進異常增殖的細胞發生細胞死亡，並提供用於治療對象的細胞增殖性病變的方法和應用，所述方法和應用涉及將細胞與一種藥劑相接觸或者給對象施用所述藥劑，所述藥劑是調節正經受化療藥物治療的細胞的糖原合酶激酶－3β活性的藥劑。
文檔編號A61K31/7105GK1980681SQ200580022976
公開日2007年6月13日 申請日期2005年7月8日 優先權日2004年7月9日
發明者於強 申請人:新加坡科技研究局