用於在植物和植物細胞中表達α-半乳糖苷酶的核酸構建體的製作方法

2023-05-27 03:59:06 2

用於在植物和植物細胞中表達α-半乳糖苷酶的核酸構建體的製作方法
【專利摘要】本發明提供了核酸表達構建體，更具體地，提供了用於在植物細胞中表達人α-半乳糖苷酶的核酸構建體及其應用，所述細胞表達核酸構建體以產生人α-半乳糖苷酶。
【專利說明】用於在植物和植物細胞中表達α-半乳糖苷酶的核酸構建體
【技術領域】
[0001]本發明在其一些實施方式中涉及核酸表達構建體，並且更具體但不排它地，涉及用於表達植物細胞中α -半乳糖苷酶的核酸構建體及其應用，所述細胞表達核酸構建體和人α-半乳糖苷酶。
【背景技術】
[0002]法布裡病(Fabry disease)是一種由溶酶體酶α -半乳糖苷酶A ( a-Gal Α)的活性缺陷引起的伴X溶酶體貯積病。患有典型法布裡病的患者通常具有的a-Gal A活性小於1%，並且通常表現出很多種症狀，包括四肢劇痛(肢端感覺異常)、少汗、角膜和晶狀體改變、皮膚損傷(血管角質瘤)、腎衰竭、心血管病、肺衰竭、神經症狀、以及中風。在非典型的法布裡病中，帶有殘餘酶活性的個體在生命後期表現出症狀，並且這些症狀通常限於一個或幾個器官。由於X染色體的隨機失活，女性攜帶者的臨床表現差異很大。儘管攜帶者通常保持整個生命期間無症狀，然而許多攜帶者表現出與男性患者相同的可變性和嚴重性。DeDuve首次提出用外源生物活性酶代替缺失的溶酶體酶可能是治療溶酶體貯積病的可行方法[Fed Proc.23:1045(1964)]。
[0003]用於酶替代療法的重組α-半乳糖苷酶A已經在昆蟲(sf9)細胞(參見US7，011，831)、人成纖維細胞(參見US 6，395，884)、以及植物細胞(參見US 6，846，968和WO2008/132743)中產生。已經用重組 a-Gal A (半乳糖苷酶 β [Fabrazyme ? ]):GenzymeCorporation, Cambridge, Mass ;半乳糖苷酶 a [Replagal ⑩]:Shire Human GeneticTherapies Corporation, Cambridge, Mass)進行了臨床試驗，並且兩種藥物已經批准用於臨床應用。自2009年起，多於2000例患者已經用這兩種可用的製劑中的任一種治療，總體而言，已經證明了這兩種製劑的`安全性和有效性(Hoffmann, Orphanet J Rare Dis.Dis.2009;4:21)。
[0004]臨床經驗已經表明:考慮到患者的耐受性、免疫原性、給藥方案、以及臨床療效，可用的重組酶組合物有所不同(Hoffmann, Orphanet J Rare Dis.Dis.2009，4:21)。與現有重組酶相關的另一個缺點是它們的費用，這一缺點可以對健康管理系統造成沉重的經濟負擔。當在哺乳動物細胞培養物、生物反應器、或昆蟲細胞中生產重組酶時，複雜的純化、修飾方案和現有治療所需的相當大量的治療導致了這些重組酶的高成本。因此，迫切需要降低α -半乳糖苷酶的成本，使得這種挽救生命的治療可以更低廉地向所有需要這種治療的患者提供。
[0005]可以在轉基因植物中生產人溶酶體酶以解決安全性、病毒感染、免疫反應、產物產率和成本的問題。US 2002/0088024教導了使用水稻-澱粉酶ER靶向信號肽以及在C端部分截短的人α-半乳糖苷酶編碼序列在植物細胞中表達重組人α-半乳糖苷酶，所述人α-半乳糖苷酶編碼序列用於有效表達和分泌到細胞內液。
[0006]WO 97/10353教導了使用創傷誘導(wound-1nduced) MeGA啟動子和用於恢復的FLAG標籤在植物中生產溶酶體酶，尤其是IDUA和葡糖腦苷酯酶。WO 97/10353沒有提供用於表達重組人α-半乳糖苷酶特定構建體的指導。
[0007]Cramer 等(Curr.Topics Trans.1999 Plants95_118)以與 WO 97/10353 類似的方式重複了在植物細胞中，即在菸葉的內膜(IF)中葡糖腦苷酯酶和IDUA表達的方法，並且大體上描述了植物表達，但是沒有提供用於人重組α -半乳糖苷酶的指導。
[0008]US2006-0204487教導了用於在植物細胞中表達人溶酶體酶的方法，針對用於有效糖基化和聚糖重建(remodel)的靶向重組多肽(尤其是葡糖腦苷酯酶)，所述方法使用了多種策略。沒有披露由特異性構建體克隆與表達重組人α-半乳糖苷酶。
[0009]W02007/010533教導了表達重組生物活性分子的植物細胞的施用，所述生物活性分子如溶酶體酶(如人葡糖腦苷酯酶和人α-半乳糖苷酶)。沒有披露重組人α-半乳糖苷酶的克隆與表達。
[0010]WO 2008/132743描述了將人α -半乳糖苷酶編碼序列克隆在植物表達載體中，並描述了其在菸草細胞中的表達，產生了具有生物活性的全長糖基化α-半乳糖苷酶，證明了所述α-半乳糖苷酶在成纖維細胞中的吸收。然而，需要在臨床條件下進一步提高具有改善的藥代動力學(pharmacokinetics)的重組人α -半乳糖苷酶蛋白的表達和生產效率的更先進的α-半乳糖苷酶表達載體。

【發明內容】

[0011]根據本發明的一些實施方式的一方面，提供了一種核酸表達構建體，所述構建體包括編碼人α-半乳糖苷酶蛋白的核酸序列，其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在N端被翻譯融合至擬南芥ABPI內質網靶向信號`肽，並且其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻譯融合至內質網滯留(retention)信號肽。
[0012]根據本發明的一些實施方式的一方面，提供了具有N端甘氨酸殘基的人α-半乳糖苷酶蛋白，其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻譯融合至內質網滯留信號肽。
[0013]根據本發明的一些實施方式，核酸序列包括SEQ ID Ν0:22ο
[0014]根據本發明的一些實施方式，擬南芥ABPI內質網靶向信號肽如SEQ ID Ν0:4中所
/Jn ο
[0015]根據本發明的一些實施方式，核酸構建體包括如SEQ ID Ν0:5中所示的編碼內質網靶向信號肽的核酸序列。
[0016]根據本發明的一些實施方式，內質網滯留信號肽如SEQ ID Ν0:6中所示。
[0017]根據本發明的一些實施方式，核酸構建體包括如SEQ ID Ν0:19中所示的編碼內質網滯留肽的核酸序列。
[0018]根據本發明的一些實施方式，核酸序列具有如SEQ ID Ν0:2中所示的序列。
[0019]根據本發明的一些實施方式，人α-半乳糖苷酶蛋白具有如SEQ ID Ν0:1中所示的胺基酸序列。
[0020]根據本發明的一些實施方式，核酸序列的密碼子使用是針對菸草(Nicotiniatabaccum)優化的。
[0021 ] 根據本發明的一些實施方式的一些方面，提供了包括本發明的核酸構建體的分離細胞。[0022]根據本發明的一些實施方式，細胞重組產生人α-半乳糖苷酶。
[0023]根據本發明的一些實施方式，人α-半乳糖苷酶包括N端甘氨酸殘基。
[0024]根據本發明的一些實施方式，細胞是植物細胞。
[0025]根據本發明的一些實施方式，植物細胞是菸草細胞。
[0026]根據本發明的一些實施方式，菸草細胞是ΒΥ-2細胞。
[0027]根據本發明的一些實施方式，人α-半乳糖苷酶蛋白重組產生，以具有至少一個
暴露的甘露糖殘基。
[0028]根據本發明的一些實施方式，人α-半乳糖苷酶蛋白重組產生，以具有至少一個核β_(1，2)木糖、或至少一個核α-(1，3)巖藻糖、或者至少一個核β_(1，2)木糖和至少一個核α-(1，3)巖藻糖。
[0029]根據本發明的一些實施方式，核酸構建體穩定整合在細胞的基因組中。
[0030]根據本發明的一些實施方式，細胞是根癌土壤桿菌(農桿菌，(Agrobacteriumtumefaciens)細胞。
[0031]根據本發明一些實施方式的一方面，提供了生產重組人α-半乳糖苷酶蛋白的方法，所述方法包括:提供根據本發明的細胞，然後培養所述細胞以產生所述重組人α -半乳糖苷酶蛋白，以及從所述細胞中分離所述重組人α -半乳糖苷酶蛋白。
[0032]根據本發明的一些實施方式，所述細胞是在細胞培養基中培養的分離細胞。
[0033]根據本發明的一些實施方式，所述培養是在一次性生物反應器中進行的。
[0034]根據本發明的一些實施方式，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有如在SEQ ID NO: 16中所示的胺基酸序列。
[0035]根據本發明一些實施方式的一方面，提供了藥物組合物，所述藥物組合物包括作為活性成分的本發明的人α-半乳糖苷酶蛋白和藥用載體。
[0036]根據本發明一些實施方式的一方面，提供了藥物組合物，所述藥物組合物包括作為活性成分的本發明的細胞和藥用載體。
[0037]根據本發明一些實施方式的一方面，提供了藥物組合物，所述藥物組合物包括作為活性成分的本發明的人α-半乳糖苷酶蛋白的群體以及藥用載體，其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白的群體的主要聚糖結構是甘露糖4- β-(I, 2)木糖(Μ4Χ)、甘露糖3- β-(I, 2)木糖-α-(1，3)巖藻糖[Fe (3) Μ3Χ]、以及甘露糖8 (Μ8)。
[0038]根據本發明的一些實施方式的一方面，提供了在需要其的受試者中治療法布裡病的方法，所述方法包括給予受試者本發明的藥物組合物。
[0039]根據本發明的一些實施方式的一方面，提供了藥物組合物，所述藥物組合物包括本發明的人α-半乳糖苷酶蛋白以及藥用載體，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有包括9個甘露糖殘基並且其中3個是暴露的甘露糖殘基的聚糖結構。具有包括9個甘露糖殘基並且其中3個是暴露的甘露糖殘基的聚糖結構的人α -半乳糖苷酶蛋白可以組成0.5%、0.8%、1.0%、1.3%、2%以上的人α -半乳糖苷酶蛋白的群體。
[0040]根據本發明的一些實施方式的一方面，提供了在需要其受試者中治療法布裡病的方法，所述方法包括給予受試者包括本發明的細胞的藥物組合物。
[0041]根據本發明的一些實施方式的一方面，提供了本發明的人α-半乳糖苷酶蛋白在製備用於在需要其的受試者中治療法布裡病的藥物中的應用。[0042]除非另外定義，本文中使用的所有技術和/或科學術語與本發明所屬領域的任何普通技術人員通常理解的具有相同的意義。雖然類似於或等價於本文中描述的那些的方法和材料可以用於本發明的實施方式的實施或試驗，但是如下描述了示例性的方法和/或材料。在矛盾的情況下，專利說明書包括定義將用於對照。此外，材料、方法、以及實施例僅是示例性的，並非旨在必要的限制。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]參照附圖，僅通過實施例在本文中描述了本發明的一些實施方式。現在具體參照詳細的附圖，強調了通過實例的方式示出細節，並且這些細節是為了示例性地討論本發明的實施方式。在這點上，利用附圖進行的描述使得可以如何實施本發明的實施方式對本領域技術人員而言是顯而易見的。
[0044]在附圖中:
[0045]圖1是由本發明的核酸編碼的α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO: 1，下面序列)與包括天然信號前導肽(SEQ ID Ν0:3，以紅色突出顯示)的天然人α-半乳糖苷酶蛋白(基因庫:Χ05790，上面的序列)的胺基酸序列的排列。擬南芥ABPI內質網靶向信號肽(SEQ ID Ν0:4)以綠色突出顯示。SEKDEL內質網滯留信號肽(SEQ ID NO:6)位於植物表達蛋白的C端。成熟的天然α-半乳糖苷酶蛋白序列(SEQ ID NO: 7)以黃色突出顯示。
[0046]圖2是示出植物細胞中不同人α -半乳糖苷酶構建體表達水平的SDS-PAGE凝膠掃描。用不同的人ct -半乳糖苷酶構建體浸潤(infiltrate)的本氏煙(N.benthamaina)植物葉片的提取物在12%的SDS-PAGE還原凝膠上分離，並且使用用於蛋白可視化的考馬斯藍染色。泳道(Iane)I=編碼具有蘋果果膠酶內質網靶向信號肽(蘋果果膠酶信號肽=SEQ IDN0:9)的α-半乳糖苷酶構建體(SEQ ID NO: 8)的表達產物。泳道2=編碼具有ABPI內質網靶向信號肽(ΑΒΡΙ信號.肽=SEQ ID NO: 4)的α-半乳糖苷酶的SEQ ID NO:2的表達產物。泳道3=編碼具有蘋果果膠酶內質網靶向信號肽(SEQ ID Ν0:9)的SEQ ID Ν0:12的SEQ IDΝ0:11的表達產物。泳道4=陰性(沒有α-半乳糖苷酶編碼序列)對照。泳道2中的突出帶(箭頭)對應成熟重組α-半乳糖苷酶單體的大小(SEQ ID Ν0:21)。考馬斯染色帶顯示豐富的α-半乳糖苷酶蛋白；
[0047]圖3是示出表達不同人α-半乳糖苷酶構建體的植物提取物中催化活性水平的柱狀圖。本氏煙植物的葉片用如下的不同人α -半乳糖苷酶構建體浸潤:A=SEQ ID Ν0:8，其編碼具有蘋果果膠酶內質網靶向信號肽(蘋果果膠酶信號肽=SEQ ID Ν0:9)的α-半乳糖苷酶蛋白。B=SEQ ID NO:2，其編碼具有ABPI內質網靶向信號肽(ΑΒΡΙ信號肽=SEQ ID Ν0:4)的α-半乳糖苷酶蛋白。C=SEQ ID NO: 13，其編碼具有內切殼多糖酶B內質網靶向信號肽(內切殼多糖酶信號蛋白=SEQ ID Ν0:14)的α -半乳糖苷酶蛋白。D=SEQ ID Ν0:11，其編碼具有蘋果果膠酶內質網靶向信號肽(蘋果果膠酶信號序列=SEQ ID Ν0:9)的α-半乳糖苷酶蛋白(SEQ ID NO: 12)。在活性檢測緩衝液中提取各植物的葉片，使用對硝基苯基-a-D-批喃半乳糖苷(pNP-α -D-Gal, GBB1290, IRIS Biotech, Germany)作為水解基質(substrate)測定催化活性。在405nm下監測對硝基苯酚酯/鹽生色團的生成。
[0048]圖4是通過殘基的催化活性測定的人血漿(37°C)中兩種植物重組人α-半乳糖苷酶穩定性的比較圖。用SEQ ID NO: 11轉化的本氏煙植物葉片中的α-半乳糖苷酶，所述SEQ ID NO: 11編碼具有蘋果果膠酶內質網靶向信號肽(空心方形)的SEQ ID N0:12;以及用SEQ ID N0:2轉化的本氏煙植物葉片中的α-半乳糖苷酶，所述SEQ ID Ν0:2編碼具有ABPI內質網靶向信號肽(實心方形)的α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:1 )，通過植物破碎、鹽析、以及層析純化，並在37°C下的人血漿中溫育至多達I小時以模擬體內藥代動力學。在指定的時間間隔內，通過PNP-G檢測測定樣品的α-半乳糖苷酶的催化活性。記錄表達SEQ IDNO:1 (實心方形)的本氏煙植物葉片中α-半乳糖苷酶的較大的穩定性。
[0049]圖5是植物細胞中表達的α -半乳糖苷酶(實心方形)與人細胞培養物中表達的商用人重組α-半乳糖苷酶(R印Iagal㊣，空心三角形)催化活性穩定性的比較圖。表達SEQID NO:2的ΒΥ2細胞的未純化提取物，所述SEQ ID Ν0:2編碼具有ABPI內質網靶向信號肽(實心方形)的α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:1);以及在哺乳動物細胞培養物(R印Iagal⑩，空心三角形)中表達的人重組α-半乳糖苷酶在37°C的血漿中溫育至多達I小時以模擬體內藥代動力學。在指定的時間間隔內，通過PNP-G檢測測定樣品的α-半乳糖苷酶的催化活性。記錄植物細胞表達酶和人細胞表達酶的相似穩定性。
[0050]圖6是植物細胞中表達的α -半乳糖苷酶(實心方形)與人細胞培養(Replagal ?，空心三角形)中表達的商用人重組α-半乳糖苷酶的催化活性的穩定性比較圖。表達SEQID NO:2的ΒΥ2細胞的未純化提取物，所述SEQ ID Ν0:2編碼具有ABPI內質網靶向信號肽
(實心方形)的α-半乳糖苷酶(seq ID NO:1);以及在哺乳動物細胞培養物(Replagalx,空
心三角形)中表達的人重組α-半乳糖苷酶在37°c下的模擬溶酶體環境[酸性(PH4.6)]的條件下溫育11天。當溫育時，在指定的時間間隔內，通過PNP-G檢測測定樣品的α-半乳糖苷酶的催化活性。記錄植物表達酶和哺乳動物表達酶至多達9天的相似穩定性。
[0051]圖7是示出植物細胞表達的α -半乳糖苷酶的糖基酶消化產物中聚糖結構分布的彩圖。還原、烷基化、並在SDS-PAGE上分離表達SEQ ID NO:2的ΒΥ2細胞提取物樣品，所述SEQ ID Ν0:2編碼具有ABPI內質網靶向信號肽的α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:1)。通過胰蛋白酶消化，隨後用PNG ase A (肽N-糖苷酶Α)和PNGase F (肽N-糖苷酶F)消化，採用蛋白帶進行聚糖分析。萃取、純化、用螢光試劑鄰氨基苯甲醯胺(2ΑΒ)標記、使用TSK凝膠醯胺80正相HPLC分離、並使用螢光檢測器檢測生成的自由聚糖。記錄在5.9⑶和8.9⑶(84.55分鐘和108.05分鐘)處的主鋒，以及在112.35處的次峰(minor peak)M9 ；
[0052]圖8是示出植物細胞表達α -半乳糖苷酶的聚糖分布(profile)的表格,所述聚糖分布表示為圖7的彩圖中表示的單個聚糖的百分比面積。記錄各次單獨分析(A和B)的相同分布。
【具體實施方式】
[0053]在本發明的一些實施方式中涉及用於在植物細胞中重組表達人α-半乳糖苷酶的表達載體、用於在植物細胞中表達人α-半乳糖苷酶的方法、以及由此產生的人α-半乳糖苷酶。
[0054]應當理解，本發明並非將其應用必要地限於如下描述中所給出的或由實施例舉例說明的細節。本發明可以是其它實施方式，或能夠以各種方式實施或進行。
[0055]本發明人已構建了用於在植物細胞中重組表達人α-半乳糖苷酶的表達載體，用載體轉化的菸草植物和植物細胞，並且從植物和細胞培養物中催化分離了活性人α -半乳糖苷酶。表達的重組人α-半乳糖苷酶在模擬通常體內施用所存在的條件下保持良好的催化活性，這表明與其它源於植物的重組人α-半乳糖苷酶相比，其具有改善的模擬藥代動力學，並且與那些哺乳動物表達的重組人α -半乳糖苷酶(Replaga廣)相似。
[0056]因此，根據本發明的一方面，提供了核酸表達構建體，所述構建體包括編碼人α -半乳糖苷酶蛋白的核酸序列，其中所述人α -半乳糖苷酶蛋白在N端被翻譯融合至擬南芥ABPI內質網靶向信號肽，並且其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻譯融合至內質網滯留信號肽。
[0057]如在本文中使用的，術語「人α-半乳糖蛋白」是指人α -半乳糖苷酶Α( a-D-半乳糖苷半乳糖水解酶；EC3.2.1.22 ；α -Gal Α)多肽。根據本發明的一些實施方式，人α -半乳糖苷酶蛋白是具有如SEQ ID NO:7 (成熟人Α-Gal)所示的胺基酸序列的成熟人α -半乳糖苷酶蛋白。將理解，人α-半乳糖苷酶蛋白可以是改變的人α-半乳糖苷酶蛋白，具有不同於SEQ ID Ν0:7的胺基酸序列。由本發明的表達載體編碼的改變的人α-半乳糖苷酶蛋白的一個非限制性實例是SEQ ID NO: 16 (G-A-Gal)0在另一個非限制性實例中，由表達載體編碼的人α-半乳糖苷酶可以是包括具有N端甘氨酸殘基(G)如SEQ ID Ν0:16或SEQ IDNO: 21，以及不具有N端甘氨酸殘基如，但不限於，SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 20的α-半乳糖苷酶蛋白的人α-半乳糖苷酶蛋白混合物。
[0058]根據本發明的另一方面，人α -半乳糖苷酶蛋白在N端被翻譯融合在擬南芥ABPI內質網靶向信號肽，並且人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻譯融合在內質網滯留信號肽。
[0059]如在本文中使用的，術語「在N端翻譯融合」或「在C端翻譯融合」指的是指定的肽通過肽鍵共價連接至成 熟人α-半乳糖苷酶蛋白的N端胺基酸或C端胺基酸，作為重組表達的結果。
[0060]如在本文中使用的，術語「擬南芥ABPI內質網靶向信號肽」是指擬南芥(Arabidopsis thaliana)生長素結合蛋白的前導肽序列(Un1-Prot登記號:P33487),所述前導肽序列能夠直接表達在植物細胞內的內質網中。在一個實施方式中，擬南芥ABPI內質網靶向信號肽是如SEQ ID NO:4所示的33個胺基酸的多肽。
[0061]如在本文中使用的，術語「內質網滯留信號肽」是指當存在於多肽的N端或C端時引起多肽從高爾基體中返回(retrieve),並保留在內質網中的多肽序列(參見Rayon等，Journal of Experimental Botany, Vol.49, N0.326, pp.1463-1472，1998 ；以及 Neumann 等Annals of Botany, 2003; 92:167-180)。在一個實施方式中，內質網滯留信號肽是KDEL(SEQID NO: 17)或SEKDEL (SEQ ID N0:6)。本領域已知其它合適的植物內質網信號(參見Pagny等，Journal of Experimental Botany, Vol.50，pp.157-64)。
[0062]因此，根據本發明的一個實施方式，在N端被翻譯融合至擬南芥ABPI內質網靶向信號肽的人α-半乳糖苷酶蛋白，並且在C端被翻譯融合至內質網滯留信號肽的人α-半乳糖苷酶蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列。
[0063]如在本文中使用的，術語「核酸序列」是指能夠分離和以RNA序列、互補多核苷酸序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或複合多核苷酸序列(例如，以上序列的組合)形式提供的單鏈核酸序列或雙鏈核酸序列。
[0064]如在本文中使用的短語「互補多核苷酸序列」是指使用反轉錄酶或任何其它RNA依賴性DNA聚合酶由信使RNA的反轉錄得到的序列。這種序列隨後可以使用DNA依賴性DNA聚合酶在體內或體外擴增。
[0065]如在本文中使用的短語「基因組多核苷酸序列」是指源於(分離自)染色體的序列，從而它代表染色體的連續部分。
[0066]如在本文中使用的短語「複合多核苷酸序列」是指其為至少部分互補的並且至少部分基因組的序列。複合序列可以包括一些編碼本發明的多肽需要的外顯子序列，以及插入在其中的一些內含子序列。內含子序列可以是包括其它基因的任何來源，並且通常將包括保守剪接信號序列。這種內含子序列還可以包括順式作用表達調控元件。
[0067]根據本發明的一些實施方式，編碼本發明多肽的核酸序列是用於表達的最佳序列。這種序列改變的實例包括，但不限於，改變G/C含量以更接近通常在關注的植物中確定的含量，以及去除在植物中發現的非典型密碼子，通常被稱為密碼子優化。在一個實施方式中，編碼人α-半乳糖苷酶蛋白的核酸序列的密碼子使用是用於菸草或本氏煙的優化密碼子，所述人α-半乳糖苷酶在N端被翻譯融合至擬南芥ABPI內質網靶向信號肽，並且所述人α-半乳糖苷酶在C端被翻譯融合至內質網滯留信號肽。
[0068]短語「密碼子優化」是指選擇適當的DNA核苷酸用於結構基因或其片段內，其接近在關注的植物內的密碼子使用。因此，優化的基因或核酸序列是指其中已將原始或天然存在的基因改變以在植物中利用統計學優選的或統計學有利的密碼子的基因。通常在DNA水平以及用於在植物中表達的優化編碼區檢查核苷酸序列，使用任何合適的程序測定，例如在Sardana等(1996, Plant Cell Reportsl5:677_681)中描述的。在該方法中，首先可以通過找到相對於高度表達的植物基因，天然基因的每個密碼子的使用的比例方差，隨後計算平均方差來計算密碼子使用的標準偏差(一種密碼子使用偏性的測度)。使用的公式是:I SDCU=n=l N[ (Xn-Yn)/Yn] 2/N，其中Xn是指在高表達的植物基因中密碼子η的使用頻率，Yn是指在關注的基因中的密碼子η的使用頻率，並且N是指關注的基因中的密碼子的總數。來自雙子葉植物的高表達基因中的密碼子使用的表格是利用Murray等(1989，Nuc AcidsRes.17:477-498)的數據編譯的`。
[0069]根據用於特定植物細胞類型的優選密碼子使用的核酸序列優化的一個方法基於直接使用密碼子優化表，如通過日本的NIAS (National Institute of AgrobiologicalSciences) DNA 庫(Hypertext Transfer Protocol Hypertext Transfer ProtocolHypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot)kazusa(dot)or(dot)jp/codon/)在密碼子使用資料庫(Codon Usage Database)在線提供的那些,而沒有進行任何額外的統計計算。密碼子使用資料庫包括用於許多不同物種的密碼子使用表，每個密碼子使用表已經基於存在於基因庫中的數據進行統計學測定。
[0070]通過利用上述表格以測定針對在特定物種(例如，水稻)中的每種胺基酸的最優選或最有利的密碼子，編碼關注的蛋白的天然存在的核苷酸序列可以是針對特定植物品種的優化密碼子。這是通過取代那些可能在具有相應密碼子的特定物種的基因組中具有低統計學發生率的密碼子實現的，就胺基酸而言，那些是統計學更有利的。然而，可以選擇一種或多種不太有利的密碼子以刪除現有的限制性位點，從而在潛在有用的連接(5'和3'端以增加信號肽或終止盒，可能用於切斷和剪接區段以產生正確的全長序列的內部位點)處創建新的連接，或者除去可能對mRNA穩定性或表達產生負面影響的核苷酸序列。
[0071]在任何改變之前，期望的編碼核苷酸序列可以已經包含相應於在特定植物品種中統計學有利的密碼子的許多密碼子。因此，天然核苷酸序列的密碼子優化可以包括:在期望的核苷酸序列內確定對於特定植物而言統計學不利的密碼子，以及根據特定植物的密碼子使用表改變這些密碼子以產生密碼子優化衍生物。改變的核苷酸序列可以針對植物密碼子使用完全或部分優化，條件是由改變的核苷酸序列編碼的蛋白以比由相應天然產生或原始基因編碼的蛋白更高的水平產生。通過改變密碼子使用構建的合成基因描述於，例如，PCT專利申請93/07278中。
[0072]根據本發明的一些實施方式，通過如SEQ ID NO: 18所示的核酸序列編碼人α-半乳糖苷酶蛋白。根據本發明的進一步的實施方式，通過如SEQ ID Ν0:5所示的核酸序列編碼擬南芥ABPI內質網靶向信號肽。根據本發明的還進一步的實施方式，通過如SEQ ID NO: 19所示的核酸序列編碼內質網滯留信號肽。因此，根據本發明的又進一步的實施方式，通過如SEQ ID Ν0:2所示的核酸序列編碼在N端被翻譯融合在擬南芥ABPI內質網靶向信號肽的人α-半乳糖苷酶蛋白，並且在C端被翻譯融合在內質網滯留信號肽的人α-半乳糖苷酶蛋白。
[0073]如在本文中使用的，術語「核酸表達構建體」是指包括本發明的一些實施方式的核酸(例如，SEQ ID Ν0:2)和至少一種用於在宿主植物細胞中直接轉錄核酸的啟動子的核酸構建體。在下文中進一步詳細地提供了合適的轉化方法。
[0074]根據本發明的一些實施方式，提供了包括本發明的核酸序列以及用於在植物宿主細胞中直接轉錄核酸序列的核酸構建體。
[0075]根據本發明的一些實施方式，核酸可操作地連接至啟動子序列。
[0076]如果調節序列能夠在連接至其上的編碼序列發揮調節作用，編碼核酸序列是「可操作地連接」至調節序列(例如，啟動子)。
[0077]本發明的核酸構建體可以使用任何合適的啟動子序列。優選地，啟動子是組成型啟動子、組織特異性啟動子、或誘導型啟動子。
[0078]如在本文中使用的，短語「植物可表達」是指包括加入其中或包含在其中的任何另外的調控元件的啟動子序列是至少能夠誘導、賦予、激活、或增強植物細胞、組織、器官，優選單子葉植物或雙子葉植物細胞、組織、或器官中的表達。這種啟動子可以是組成型，即在多種組織中能夠直接高水平基因表達；組織特異性的，即在特定的一種或多種組織中能夠直接基因表達；可誘導的，即在刺激下能夠直接基因表達；或嵌合的，即由至少兩種不同的啟動子部分形成。
[0079]可用於本發明的一些實施方式中的方法的優選啟動子的實例顯不在表1、表I1、表II1、和表IV中。
[0080]表I
[0081]用於進行本發明的一些實施方式的示例性組成型啟動子
【權利要求】
1.一種核酸表達構建體，所述構建體包括編碼人α-半乳糖苷酶蛋白的核酸序列，其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在N端被翻譯融合至擬南芥ABPI內質網靶向信號肽，並且其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻譯融合在內質網滯留信號肽。
2.根據權利要求1所述的核酸構建體,其中，所述核酸序列包括SEQID NO:22。
3.根據權利要求1所述的核酸構建體，其中，所述擬南芥ABPI內質網靶向信號肽如SEQID NO:4 所示。
4.根據權利要求1所述的核酸構建體，包括編碼所述內質網靶向信號肽的核酸序列，所述核酸序列如SEQ ID Ν0:5所示。
5.根據權利要求1所述的核酸構建體，其中，所述內質網滯留信號肽如SEQID Ν0:6所/Jn ο
6.根據權利要求1所述的核酸構建體，包括編碼所述內質網滯留信號肽的核酸序列，所述核酸序列如SEQ ID NO: 19所示。
7.根據權利要求1所述的核酸構建體,其中,所述核酸序列具有如SEQID NO: 2所示的序列。
8.根據權利要求1所述的核酸構建體，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有如SEQIDNO:1所示的胺基酸序列。
9.根據權利要求`1所述的核酸，其中，所述核酸序列的密碼子使用是針對菸草(Nicotinia tabaccum)優化的。
10.一種包括權利要求1所述的核酸構建體的分離細胞。
11.根據權利要求10所述的細胞，重組產生所述人a-半乳糖苷酶。
12.根據權利要求11所述的細胞，其中，所述人a-半乳糖苷酶包括N-端甘氨酸殘基。
13.根據權利要求10至12中任一項所述的細胞，其中，所述細胞是植物細胞。
14.根據權利要求13所述的細胞，其中，所述植物細胞是菸草細胞。
15.根據權利要求14所述的細胞，其中，所述菸草細胞是BY-2細胞。
16.根據權利要求11至15中任一項所述的細胞，其中，所述人a-半乳糖苷酶蛋白是重組產生的，以具有至少一個暴露的甘露糖殘基。
17.根據權利要求11至16中任一項所述的細胞，其中，所述人a-半乳糖苷酶蛋白是重組產生的，以具有至少一個核β_(1，2)木糖。
18.根據權利要求11至16中任一項所述的細胞，其中，所述人a-半乳糖苷酶蛋白是重組產生的，以具有至少一個核a-(l，3)巖藻糖。
19.根據權利要求11至16中任一項所述的細胞，其中，所述人a-半乳糖苷酶蛋白是重組產生的，以具有至少一個核β_(1，2)木糖和至少一個核α-(1，3)巖藻糖。
20.根據權利要求10至19中任一項所述的細胞，其中，所述核酸構建體穩定整合在所述細胞的基因組中。
21.根據權利要求10所述的細胞,其中，所述細胞是根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)細胞。
22.—種產生重組人α-半乳糖苷酶蛋白的方法，包括: 提供根據權利要求11至20中任一項所述的細胞；以及 培養所述細胞以產生所述重組人α-半乳糖苷酶蛋白；以及從所述細胞中分離所述重組人α-半乳糖苷酶蛋白。
23.根據權利要求22所述的方法，其中，所述細胞是在細胞培養基中培養的分離細胞。
24.根據權利要求23所述的方法，其中，所述培養是在一次性生物反應器中進行的。
25.一種具有N端甘氨酸殘基的人α-半乳糖苷酶蛋白，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻譯融合至內質網滯留信號肽。
26.根據權利要求25所述的人α-半乳糖苷酶蛋白，具有如SEQID Ν0:16所示的胺基酸序列。
27.一種藥物組合物，包括作為活性成分的根據權利要求25或26所述的人α-半乳糖苷酶蛋白和藥用載體。
28.一種藥物組合物，包括根據權利要求25或26、或者根據權利要求25和26所述的人α-半乳糖苷酶蛋白以及藥用載體，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有包括9個甘露糖殘基並且其中3個是暴露的甘露糖殘基的聚糖結構。
29.一種藥物組合物，包括作為活性成分的根據權利要求25或26、或者根據權利要求25和26所述的人α -半乳糖苷酶蛋白的群體，其中，至少0.5%的所述群體具有包括9個甘露糖殘基並且其中3個是暴露的甘露糖殘基的聚糖結構。
30.一種藥物組 合物，包括作為活性成分的根據權利要求25或26、或者根據權利要求25和26所述的人α -半乳糖苷酶蛋白的群體以及藥用載體，其中，所述人α _半乳糖苷酶蛋白的群體的主要聚糖結構是甘露糖4-β-(1，2)木糖(Μ4Χ)、甘露糖3-β-(1，2)木糖-α-(1，3)巖藻糖[Fc(3)M3X]、和甘露糖 8 (M8)。
31.根據權利要求30所述的藥物組合物，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白的群體進一步包括以下聚糖結構，所述聚糖結構包括9個甘露糖殘基(Μ9)並且其中3個是暴露的甘露糖殘基。
32.—種藥物組合物，包括作為活性成分的根據權利要求10至20中任一項所述的活性成分以及藥用載體。
33.一種在需要其的受試者中治療法布裡病的方法，包括給予所述受試者根據權利要求27所述的藥物組合物。
34.一種在需要其的受試者中治療法布裡病的方法，包括給予所述受試者根據權利要求30所述的藥物組合物。
35.一種在需要其的受試者中治療法布裡病的方法，包括給予所述受試者根據權利要求32所述的藥物組合物。
36.根據權利要求25或26中任一項所述的人α_半乳糖苷酶蛋白在製備在需要其的受試者中用於治療法布裡病的藥物中的用途。
【文檔編號】A61P3/00GK103443270SQ201180069560
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2011年9月7日 優先權日:2011年1月20日
【發明者】阿維多爾·舒爾曼, 尤裡·阿納尼亞, 塔利·基日涅爾, 約瑟夫·沙爾提埃爾 申請人:普羅塔裡克斯有限公司