一種磷脂酶a的製作方法

2023-09-21 22:28:40

專利名稱：一種磷脂酶a的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的夸特羅黴素(quartromicin)、其衍生物及其可藥用鹽、以及產生酶抑制和抗病毒活性的方法。
更具體地說，本發明包括一種新的磷酸酶A2(PLA2)抑制劑A87689，該抑制劑可以從Amycolatopsis mediterranei的發酵培養物中以基本純淨的形式分離出來。本發明還包括治療還原病毒感染，特別是HIV(以及治療由該病毒所致的獲得性免疫缺陷綜合症(愛滋病))和致癌病毒如人T細胞白血病毒等感染的方法。本發明還涉及含有A87689化合物的藥物製劑，以及單獨使用或與其他試劑組合使用本發明化合物以抑制PLA2和控制還原病毒感染的方法。
炎症在致衰疾病中佔很大的比例。許多炎症如關節炎、牛皮癬、哮喘，可能還有動脈粥樣硬化，起因於關節、皮膚和血管的炎性反應。人們普遍認為，在炎性反應中起核心作用的是稱為類二十烷的磷脂代謝物的生成。類二十烷是一類重要的介體，如白三烯、前列腺素、脂氧素(lipoxins)、羥基二十碳四酸、凝血噁烷。據信類二十烷的生成依賴於花生四烯酸的可得性，而花生四烯酸是由磷脂酶A2(PLA2)作用於磷脂而釋放出來的。
PLA2是磷脂2-醯基水解酶的俗名，該酶催化磷酸甘油酯的sn-2-醯基酯鍵的水解，生成等摩爾量的溶血磷脂和游離脂肪酸(Dennis，E.A.，The Enzymes第16卷，Academic Press，New York，1983)。PLA2酶存在於所有生物中，形成一個多樣化的酶家族。已對四十多種PLA2酶進行了結構鑑定，這些酶顯示出高度的順序同源性(J.Chang，J.H.Musser和H.McGregor，「磷脂酶A2功能和藥理調節作用」，Biochem，Pharm，36∶2429-2436，1987)。
鑑定得最詳細的幾種PLA2酶為分泌形式，它們釋放到細胞外環境中而有助於消化生物物質。分泌形式的分子量約為12-15，000(Chang等，同上)。相反，細胞質PLA2少量存在於細胞內，在形成血小板激活因子和類二十烷的生物合成途徑中起關鍵作用(Mobilio，D和Marshall，L.A.，「磷脂酶A2抑制劑設計和評價的最新進展」，Ann，Reports in Med.Chem.，24∶157-166，1989)。細胞質PLA2的分子量大致為85，000(Clark，J.D.，Lin，L.L.，Kriz，W.，Ramesha，C.S.，Sultzman，Lin，A.Y.，Merlona，N.，Knots，J.L.，Cell65∶1043-1051，1991)。游離的花生四烯酸是生成類二十烷的限速前體，而且是通過細胞質PLA2的作用而從其膜磷脂庫中釋放出來的(Dennis，E.A.，「磷脂酶A2作用機制抑制作用及在花生四烯酸釋放中的作用」，Drug，Dev，Res，10∶205-220，1987)。該酶促步驟還生成溶血磷脂，這些溶血磷脂可以發生轉化而形成血小板激活因子。因此，相信細胞質PLA2對炎症的強效脂介體生物合成途徑的調節起核心作用。
由於細胞質PLA2在發炎過程中起核心作用，所以希望能對該酶的新抑制劑進行鑑定和表徵。這類抑制劑可能會給關節炎、哮喘、動脈粥樣硬化、以及皮膚炎症(如牛皮癬)和腸炎(如應激性腸道綜合症)的治療帶來新療法。這些特異性PLA2抑制劑的鑑定可能有助於使醫學界達到控制炎症的目標。
自從1980年分離出第一個人還原病毒即人T細胞白血病毒(HTLV，現定為HTLV-1)後，已積累了大量的知識。現已把還原病毒與許多疾病聯繫起來，這些疾病包括速發性惡性腫瘤和長潛伏期惡性腫瘤、消耗性疾病、神經病、免疫缺陷、以及無任何明顯症狀的終身病毒血症(參見例如FundamentalVirology，Fields，B.N.等編，1991)。分類為還原病毒科的病毒在分類學上又細分為三個不同的亞科，即致癌病毒亞科、慢病毒亞科和發泡病毒亞科。致癌病毒亞科中最引人注目的是人T細胞白血病毒。發泡病毒亞科包括許多人和靈長類分離物(如猿發泡病毒)，但一般被認為是良性的。還原病毒科的第三個亞科即慢病毒亞科，包括人免疫缺陷病毒(HIV)。
更具體地說，HIV(也稱為愛滋病毒)以前被稱為LAV、HTLV-Ⅲ或ARV，現在定名為HIV-1。與HIV-1密切相關的其他變異體包括HIV-2和SIV(猿免疫缺陷病毒)。本說明書通篇所使用的術語「HIV」包括HIV-1和HIV-2，除非另外指出。
獲得性免疫缺陷綜合症(愛滋病)這種綜合性疾病包括免疫系統的進行性破壞以及中樞和外周神經系統的退化。HIV似乎優先侵襲輔助T細胞(T淋巴細胞或攜帶OKT4的T細胞)及人體的其他細胞，如大腦內的某些細胞。輔助T細胞受到病毒的侵入，使該T細胞變為HIV病毒生產者。輔助T細胞迅速遭到破壞，在人體內的數量減少，其減少的程度使體內的B細胞及在正常情況下受輔助T細胞刺激的其他T細胞，不再正常行使功能或產生足以破壞入侵病毒或其他入侵微生物的淋巴細胞活素和抗體。
HIV本身雖然並不一定引起死亡，但它卻使人的免疫系統受到嚴重抑制，以致使人易發各種其他疾病，如皰疹、巨細胞病毒、卡波濟肉瘤、EB病毒相關淋巴瘤等。這些繼發性感染分別用其他常規療法來治療。在緊接感染後的時期內，HIV攜帶者看上去並沒有什麼症狀，但有持續的感染。在發病後期，患者患有輕度的免疫系統抑制，並伴有體重減輕、不適、發熱和淋巴結腫脹等各種症狀。以這些症狀鑑定的綜合症稱為持續全身性淋巴結病綜合症(PGL)和愛滋病相關綜合症(ARC)。在所有情況下，人們都認為愛滋病毒感染者對他人有永久的感染性。另外，愛滋病和愛滋病相關綜合症在一段時間後是致命的。
R.Yarchoan和S.Broder的一篇文章對病毒感染其宿主的機理作了描述(「獲得性免疫缺陷綜合症和相關疾病的抗還原病毒療法的進展」，NewEnglandJouranlofMedicine，316∶557-564，1987)。
在通過抑制HIV複製所需的HIV反轉錄酶來控制HIV方面正在做大量的工作(V.Merluzzi等，「用非核苷類反轉錄酶抑制劑抑制HIV-1複製」，Science，25∶1411，1990)。例如，目前使用的一種有治療作用的化合物即AZT(美國專利4，724，232)，是一種病毒反轉錄酶抑制劑。遺憾的是，許多已知化合物都有毒性問題、生物利用率差、產生病毒抗性、體內半壽期短，或同時有幾種問題。
所以，本發明提供對用於治療由未抑制PLA2引起的臨床適應症的藥用化合物庫的改進，此外還提供這些化合物在預防和治療哺乳動物的還原病毒感染中的應用。具體地說，這些改進包括新的A87689化合物、其衍生物及其可藥用鹽、生產這些化合物的方法、這些化合物的上述多種用途、可用於抑制PLA2和控制哺乳動物的還原病毒感染的治療製劑。
本領域專業人員將會從以下的描述和權利要求書中看出其他目的、特徵和優點。
A87689及其示例性鹽和衍生物的紅外吸收光譜(KBr片)示於如下的

圖1-5圖1A87689鈣鹽。
圖2A87689游離酸。
圖3A87689四乙酸鈣鹽。
圖4A87689四甲基醚鈣鹽。
圖5A87689五鈉鹽。
圖6是根據脂肪酸分布用計算機畫出的樹狀圖。
本發明涉及一種已被定名為「A87689」的新發酵產物。主要用作抑制劑的A87689，一般是以鹼土金屬鹽如鈣鹽的形式從培養基中純化出來的。本發明的另一些方面是通過培養微生物A.mediterranei的新菌株而生產A87689的方法，以及能產生A87689的A.mediterranei菌株的生物純培養物，所述新菌株選自NRRL18815和NRRL18851或其A87689生產變異株。發酵領域的專業人員將會認識到，雖然該化合物一般是以鹼土金屬鹽的形式從微生物中分離出來的，但也可在分離後通過在實驗室中進行衍生化而生成其他形式的化合物，如下所述。
應該注意的是，A87689生產微生物的名稱於1986年作了變動，當時從諾卡氏菌型放線菌中分出了兩個新屬。Lechevalier等人在當時鑑定出了新屬Amycolata和Amycolatopsis(M.P.Le-chevalier，H.Prauser，D.P.Labeda，J.Ruan，「諾卡氏菌型放線菌的兩個新屬Amycolata新屬和Amycolatopsis新屬」，Int，J.Syst.Bacteriol.，36∶29-37，1986)。
在實用性的討論中，化合物的給藥形式將稱作諸如「A87689的鈣鹽」或「A87689的游離酸」等;如果所討論的是一種或一種以上的衍生物，則可能統稱為「A87689化合物」。
A87689的鈣鹽為白色結晶物，具有下列特性分子量1222.418經驗式C66H70O20CaFAB-MS(M+1)實測值1223.4175計算值1223.4254溶解性在pH7的水中溶解度甚微(1mg/ml);在pH12.0或更高的水溶液中相當易溶;易溶於DMSO(4mg/ml);微溶於甲醇;不溶於有機溶劑，如乙酸乙酯、丙酮、乙醚、烴類、氯仿、高級醇類。
A87689鈣鹽的紅外光譜(KBr片)示於附圖1。最有意義的最大吸收出現在下列頻率(cm-1)3402，1711，1609，1534，1449，1078，1006，792。
A87689能夠成鹽，並至少有四個羥基能夠酯化或形成醚衍生物。因此，C1-6烷醯基酯和C1-6烷基醚衍生物，以及A87689和這些衍生物的鹽(A87689化合物)，也是本發明的一部分，例如四乙酸鹽和四甲基醚衍生物，包括其游離酸和鹽。A87689化合物可作為減輕炎症的藥劑使用。可藥用的鹽類特別有用。
鹼加成鹽包括由無機鹼衍生的鹼加成鹽，所述無機鹼的例子有氫氧化銨、鹼金屬或鹼土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽等。因此，這類可用於製備本發明鹽類的鹼包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氫氧化鈣、碳酸鈣等。特別優選鉀鹽、鈣鹽和鈉鹽形式。
術語「C1-6烷醯基」指1-6個碳原子的直鏈或支鏈單價脂肪族醯基，包括例如甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、α-甲基丙醯基、戊醯基、α-甲基丁醯基、β-甲基丁醯基、新戊醯基等。
術語「C1-6烷基」指1-6個碳原子的直鏈或支鏈脂族鏈，包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、異己基、3-甲基戊基、2，3-二甲基丁基等。
術語「酯」和「醚」保留其本領域已知的定義。
為便於進行分類學討論，A.mediterranei培養物NRRL18815和NRRL18851將分別稱為A87689和A87689.1。培養物A87689.1是從一種土壤混合物中分離出來的(稀釋法)。衍生菌株A87689.1是用化學誘變法產生的。由A87689和A87689.1培養物製備的新化合物將稱為「A87689」。
所以，本發明還涉及選自NRRL18815或NRRL18851的微生物A.mediterranei的生物純培養物，或其A87689生產突變株。這些微生物因其產生PLA2抑制劑或具有抗還原病毒作用的A87689化合物而具有使用價值。
培養物A87689和A87689.1已按照《布達佩斯條約》保藏在美國農業部農業研究服務局中西部北方地區研究中心的原種培養物保藏中心(1815NorthUuiversityStreet，Peoria，Illinois，61604)，並成為該保藏機構的一部分，該保藏機構給這兩個培養物指定的登記號分別為NRRL18815和NRRL18851。
培養物A87689和A87689.1的分類學研究由利利研究實驗室的FrederickP.Mertz進行。基於這些研究，把微生物A87689和A87689.1分類為A.mediterranei的新成員。這一分類依據的是直接的實驗室觀察和對已發表的出版物中對類似物種的描述所作的考察。
所用的方法所採用的分類方法為國際鏈黴菌項目(ISP)所推薦的鑑定鏈黴菌的方法(Shirling，E.B.和Gottlieb，D.，「鑑定鏈黴菌的方法」，Int.J.Syst.Bacteriol.16∶313-340，1966)及所推薦的鑑定諾卡氏菌的方法(Gordon，R.E.，Barnett，D.A.，Handerhan，J.E.，Pang，C.H.，「空腔諾卡氏菌、自養諾卡氏菌及諾卡氏菌素菌株」，Int，J.Syst，Bacteriol.24(1)∶54-63，1974)。用ISCC-NBS矩心色圖第2106號標準樣品來判定背面和氣生菌絲的顏色名稱(美國商業部國家標準局，1958)。
用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡(SEM)進行形態學研究。用Becker等人(Becker，B.，Lechevalier，M.P.，Gordon，R.E.和Lechevalier，H.E.，「用全細胞水解液紙色譜法快速鑑別諾卡氏菌和鏈黴菌」，Appl.Microbiol.12∶421-423，1964)及Lechevalier和Lechevalier(Lechevalier，M.P.和Lechevalier，H.，AUniversityLaboratoryApproach,Dietz和Thayer編，SocietyforIndustr-ialMicrobiologySpecialPublicationNO.6，Arlington，VA，第227-233頁)的色譜法確定全細胞水解液中的二氨基庚二酸(DAP)異構體和碳水化合物。
用Lechevalier等人的方法測定磷脂(Lechevalier，M.P.，Stern，A.E.和Lechevalier，H.A.，「放線菌分類學中的磷脂」，Actinomycetes，Schaal和Pulverer編，Zbl.Bakt，Suppl.11GustavFischerVerlag，1981)。
按照R.M.Kroppenstedt(ChemicalMethodsinBacterialSystematics，M.Goodfellow和D.E.Min-nikin編，1985，第173-196頁)和M.D.Collins(同上，第267-285頁)的方法測定甲基萘醌組成。用Miller和Ber-ger的HP5898A微生物鑑定系統進行脂肪酸分析(Miller，L.和Berger，T.，「用全細胞脂肪酸氣相色譜法進行細菌鑑定」，Hewlett-PackardApplicationNote228-41，8pp，1985)。
由在同樣條件下培養的冷凍乾燥全細胞製備脂肪酸甲酯。用Minnikin提出的方法測定黴菌酸(Minnikin，D.E.，Hutch-inson，I.G.和Caldicott，A.B.，「含黴菌酸細菌的甲醇解產物的薄層色譜」，J.Chromatography188∶221-233，1980)。
培養特徵培養物A87689在複合培養基和合成培養基上生長良好。培養物A87689除了在ISP4號培養基上產生微量的白色氣生菌絲外，不產生氣生菌絲。背面有特殊的橙色色素沉積。在ISP2號培養上產生不明顯的淺棕色可溶性色素釋放到培養基內。表1概括了這些培養特徵。
表1 A87689的培養特徵1培養基生長情況背面顏色氣生體可溶性色素ISP 2號培養基旺盛50.s.O無淺棕色ISP 3號培養基不生長無ISP 4號培養基2旺盛 50.s.O 微量無ISP 5號培養基不生長無ISP 7號培養基差90.gy.Y無無ATCC 172號良好50.s.O無無貝內特尚好53.m.O無無蘋果酸鈣旺盛48.V.O無無蔡氏旺盛50.s.O無無TPO3旺盛 71.m.OY 無無(1)在30℃下培養28天。
(2)菌絲體顏色263.白色。
(3)馬鈴薯糊燕麥粉瓊脂。
形態特徵培養物A87689未顯示出斷裂現象。菌絲分隔成若干分生孢子子實體長鏈，這些分生孢子子實體排列成非鏈黴菌放線菌所特有的典型蛛網狀形態。分生孢子子實體為圓柱形，表面光滑，平均為1.4×0.4mm。不存在孢子囊或遊動細胞。
生理特徵培養物A87689由下列碳水化合物產酸阿東糖醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、纖維二糖、D-半乳糖、D-果糖、D-葡萄糖、甘油、糖原、肌肌醇、菊粉、乳糖、D-麥芽糖、甘露糖醇、D-甘露糖、蜜二糖、棉子糖、L-鼠李糖、D-核糖、蔗糖、海藻糖、D-木糖。
A87689不從下列物質產酸纖維素、糊精、半乳糖醇、乙醇、肌赤癬糖醇、D-松三糖、甲基-D-葡糖苷、水楊苷、山梨糖醇、L-山梨糖、木糖醇。
培養物A87689在用ISP 9號培養基作基礎培養基時利用下列碳水化合物L-阿拉伯糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、肌醇、D-甘露糖醇、D-棉子糖、L-鼠李糖、水楊苷、蔗糖、D-木糖。培養物A87689利用下列有機酸的鈉鹽(作為供其能量和生長的唯一碳源)乙酸、丁酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、蘋果酸、粘酸、草酸、丙酸、丙酮酸、琥珀酸。培養物A87689不能利用苯甲酸和酒石酸。A87689分解酪蛋白、次黃嘌呤和L-酪氨酸。它不能水解腺嘌呤和黃嘌呤。A87689產生七葉苷酶、明膠酶、H2S、磷酸酯酶和脲酶。它不產生類黑素色素。A87689在15℃和42℃之間生長。A87689耐受最高達4%的NaCl。該培養物對溶菌酶敏感。
細胞壁分析經過水解的全細胞含有內消旋二氨基庚二酸(DAP)。全細胞提取物中的特徵糖類為阿拉伯糖和半乳糖。所存在的磷脂有磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯肌醇(PI)、二磷脂醯甘油(DPG)。A87689的細胞壁組成為IV型，全細胞糖分布為A型(Lechevalier，M.P.和Lechevalier，H.，「化學組成作為好氣放線菌的分類原則」，Int.J.Syst.Bacteriol.20∶435-443)，磷脂分布為PⅡ型(Lechevalier，M.P.，Stern，A.E.，Lechevalier.H.A.，「放線菌分類學中的磷脂」，Actinomycetes，Schaal和Pulverer編，Zbl.Bakt.Suppl.Ⅱ Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，New York)。全細胞水解液中不存在黴菌酸。檢測到的主要甲基萘醌為MK-9(H4)，加上少量的MK-8(H4)、MK-9(H6)和MK-10(H4)。
A87689的本性培養物A87689是一個非鏈黴菌菌株，其細胞壁為IV型，全細胞糖分布為A型，磷脂分布為PⅡ型，無黴菌酸。這些化學分類特徵加上其培養和形態特性，使A87689被歸入Amycolatopsis屬。該屬中有6個種和1個亞種A.azurea、A.fastidiosa、A.mediterranei、A.orientalis、A.orientalislurida亞種、A.rugosa、A.sulphurea。和這些現存的菌株比較，培養物A87689與A.mediterranei最為相近，在培養特徵上幾乎是相同的。由於沒有氣生菌絲，所以其形態特徵很少，但其初期生長情況與A.mediterranei相同。A87689和A.mediterranei的生化特徵也幾乎相同。表2列出了A87689和A.mediterranei之間的差別。
表2A87689和A.mediterranei的區別特徵特徵A87689A.mediterranei分解L-酪氨酸+-耐受4%NaCl+-在42℃下生長+-產酸:
阿東糖醇+-菊粉+-對A87689和現有的所有Amycolatopsis菌株進行了脂肪酸分析。表3列出了脂肪酸百分含量的比較。根據脂肪酸分布用計算機製作的樹狀圖示於圖6。該樹狀圖表明了用歐氏距離量度的A87689與其他Amycolatopsis屬物種的關係。相關性在10.00以下的培養物被視為同義，也就是說，為同一物種。A87689與A.mediterranei的相關性水平為12.00。
主分量分析是多變量統計學的一個分支，它研究的是一組變量的內部關係。在這一分析中，原始數據或試驗結果內的最大差異以主分量表示(Alderson，G.「非分級法在細菌分類學中的應用和相關性」，Computer-Assistedbacterialsystematics，Goodf-ellow，M.，Jones，D.，Priest，F.G.編，AcademicPress，NewYork，1985)。這樣便可製做出一條表示散布和變異性的曲線。這樣便可通過考察這一差異來評價相關關係，並可以鑑定微生物種群。根據脂肪酸製做一條二維主分量曲線，該曲線表明培養物A87689與A.mediterranei分在一組。雖然A87689和A.mediterranei之間有差異，但這種差異是菌株的差異而非種的差異。所以，培養物A87689被分類為A.mediterranei的一個菌株(Lechevalier，M.P.，Hauser，H.，Labeda，D.P.，Ruan，J.S.，「諾卡氏菌型放線菌的兩個新屬Amycolata新屬和Amycolatopsis新屬」，Int.J.Syst.Bacteriol.，36∶21-37)。
衍生菌株的比較A87689.1菌株與A87689菌株在宏觀上的相似足以使其被分類為A.mediterranei的一個菌株。這兩個菌株的不同之處在於A87689的產量不同。A87689.1菌株的A87689化合物產量大致比A87689菌株的產量多兩倍。
A87689的生產方法是，在合適的培養基中，在深層通氣條件下培養A.mediterranei的A87689生產菌株，直到產生可回收量的A87689。可以用本領域所了解的各種分離純化方法回收A87689。
用於培養A.mediterranei培養物的培養基可以是多種培養基中的任何一種。但就生產上的經濟、達到最佳產率及便於產物的分離而言，優選某些培養基。例如，在大規模發酵中優選的碳源是葡萄糖和麥芽糖，但也可以使用核糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘露糖醇、可溶性澱粉、馬鈴薯糊精、油酸甲酯、油類如豆油等。
優選的氮源為棉子粉、凝塊乳和消化大豆粉，但也可以使用魚粉、玉米浸液、酵母提取物、酶解酪蛋白、牛肉膏等。
可加入到培養基中的營養無機鹽有，能夠生成鋅、鈉、鎂、鈣、銨、氯、碳酸根、硫酸根、硝酸根等離子的常見可溶性鹽。
培養基中還應含有生物體生長發育所需的必需微量元素。這些微量元素一般是作為雜質存在於培養基的其他組成成分中，但其量足以滿足生物體的生長要求。
為優化A87689的大量生產，優選在攪拌生物反應器中進行深層通氣發酵。少量的A87689可用搖瓶培養法製取。由於用孢子形式的生物體接種大型生物反應器一般會造成生產上的時滯，所以優選使用營養接種物。營養接種物的製備方法是，用孢子形式的生物體或該生物體的菌絲體碎片接種少量培養基，得到新鮮的、旺盛生長的生物體培養物。然後把營養接種物轉移到較大的生物反應器中。營養接種物的培養基可以和較大規模發酵所用的培養基相同，但其他培養基也是適宜的。
在約27℃和約32℃之間的溫度下培養A87689生產菌，即可產生A87689化合物。生產A87689的最佳溫度似乎在30℃左右。
象深層通氣培養方法中所常見的那樣，在用常規渦輪式葉片攪拌培養基的同時，從容器底部向容器內放入無菌空氣。一般來說，通氣速度和攪拌速度應足以維持溶解氧水平至少為45%空氣飽和，容器內壓為5大氣壓。
在發酵過程中，可通過測試培養液提取物中的PLA2活性來跟蹤A87689化合物的生產。下述的蛇毒(Naja naja)PLA2分析體系可用於此目的。
在深層通氣發酵條件下生產出A87689化合物後，可以用本領域所用的方法從發酵培養基中回收之。在A87689生產菌的發酵過程中產生的A87689主要存在於培養液中。
A87689可用多種技術從菌體中回收。一種優選的技術涉及，用助濾劑如硅藻土過濾全發酵液。然後將所得濾液吸附到聚苯乙烯型的多孔高聚物吸附劑上，如DIAION HP-20(日本東京三菱化成工業株式會社)或AMBERLITE XAD-2或AMBERLITE XAD-4(Rohm and Haas，Philadelphia，PA)。將吸附劑用水洗，用有機-水溶液如甲醇-水洗脫。將流出液冰凍乾燥並濃縮。在一種優選的分離方法中，將冰凍乾燥物溶解在二甲亞碸(DMSO)中，在反相矽膠吸附劑(C8或C18)上進行色譜分離。用有機-水緩衝液如乙腈乙酸銨洗脫出各級分。
磷脂酶A2抑制活性本發明的化合物可用於減輕組織的炎症，因為這些化合物能抑制PLA2，而PLA2參與組織炎症的調節。
A87689化合物已在許多特異性檢測PLA2活性的試驗中顯示出抑制活性。更具體地說，在用分離的蛇毒(Naja naja)PLA2進行的體外試驗中，在用純化的人細胞質PLA2進行的體外試驗中，以及在檢測磷脂代謝物(白三烯和凝血噁烷)分泌抑制作用的全細胞體外試驗中，這些化合物都有活性。
具有重要意義的是，要求保護的化合物在5-脂氧化酶試驗中進行測試時無活性，表明這些化合物對PLA2有特異性。
另外，這些化合物還在抗炎活性體外試驗中顯示出活性。具體地說，這些化合物在三種佐劑誘導的關節炎模型中有活性。
在生物試驗中測試了A87689的兩種鹽形式。一種形式既溶於水也溶於DMSO。這種形式是A87689的鈉鹽。另一種形式不溶於水但溶於DMSO。這種形式是A87689的鈣鹽。後一種形式或者以DMSO溶液形式進行測試，或者以在1%羧甲基纖維素(CMC)中的懸浮液形式進行測試。
另外，在其中一種生物試驗即蛇毒(Naja naja)PLA2試驗中，將A87689衍生物和鹽的活性作了比較。
因此，本發明還涉及一種減輕動物炎症的方法，該方法包括，給予動物炎症抑制量的A87689化合物。
本發明的一個優選實施方案是一種減輕患關節炎的動物所出現的腫脹的方法，該方法包括給予動物足以減輕腫脹量的A87689化合物。
在另一個優選實施方案中，本發明涉及一種治療哮喘的方法，該方法包括，給予動物足以減輕哮喘動物出現的呼吸系統炎症量的A87689化合物。
在另一個實施方案中，本發明提供一種治療牛皮癬的方法，該方法包括，給予患牛皮癬的動物能有效減輕牛皮癬損害量的A87689化合物。
還原病毒活性A87689化合物一旦生產並分離出來，在給予哺乳動物時就可用於預防該哺乳動物的還原病毒感染，可用於治療被還原病毒感染的上述哺乳動物，或者兩種用途都有。
由於A87689化合物具有這種抗還原病毒感染活性，所以本說明書通篇所用的還原病毒感染的「控制」這一術語，包括了對由一種或更多種還原病毒引起的初期或再發性感染進行預防，也包括了對已受到初期或再發性還原病毒感染的哺乳動物進行治療。
本發明的另一實施方案包括一種控制哺乳動物體內的致癌病毒亞科的還原病毒，特別是人T細胞白血病毒的方法，該方法包括，給予所述哺乳動物致癌病毒控制量的一種選自A87689化合物的化合物或其可藥用鹽。
本發明的一個特別優選的實施方案包括一種控制人體內HIV的方法，該方法包括，給予所述人體HIV控制量的選自A87689化合物的化合物或其可藥用鹽。
A87689化合物還能控制愛滋病還原病毒。於是，本發明的另一個特別優選的實施方案包括一種控制人體愛滋病的方法，該方法包括，給予所述人體愛滋病控制量的一種選自A87689化合物的化合物或其可藥用鹽。
儘管目前已知的抗HIV藥和抗愛滋病藥被公認具有治療潛力，到目前為止也已作了大量的研究工作，但仍未出現有生命力的單一治療劑。所以，本發明的另一個特別優選的實施方案包括一種控制人體內HIV和愛滋病的方法，該方法包括，給予所述人體HIV或愛滋病控制量的第一組分和有效量的第二組分，第一組分選自A87689化合物或其可藥用鹽，第二組分是一種或更多種抑制HIV和/或愛滋病的化合物或其可藥用鹽。
特別有用的第二組分化合物包括核苷類反轉錄酶抑制劑，如3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧胸苷(AZT;美國專利4，724，232);2′，3′-二脫氧胞苷(DDC)和2′，3′-二脫氧肌苷(DDI;Mitsuya，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，83∶1911-1915，1986)等。其他可用的第二組分化合物包括四氫咪唑並〔4，5，1-jk〕〔1，4〕苯並二氮雜Amycolatopsis mediterranei-2(1H)-酮和硫酮的非核苷衍生物等(TIBO衍生物;Debyser等，Proc.Natl.Acad.Sci.，88∶1451-1455，1991)。但TIBO衍生物只具有抗HIV-1複製活性。另一些可用的第二組分化合物包括HIV蛋白酶抑制劑。例如，EPA 361 341、EPA 346 847、EPA 402 646和EPA 337 714都公開了據說可用作HIV蛋白酶抑制劑的化合物。與作為第一組分化合物給藥的A87689化合物不同的那些第一組分化合物，也可以作為第二組分化合物使用。
在另一個優選實施方案中，本發明涉及一種藥物製劑，該製劑包含有效量的如上所述的第一組分和如上所述的第二組分，以及可藥用的載體、賦形劑或稀釋劑。
以上及本說明書通篇所用的術語「有效量」，是指足以對特定的臨床症狀達到治療效果的活性化合物劑量。
本說明書通篇所使用的術語「活性化合物」，是指選自A87689、其衍生物、或其可藥用鹽的至少一種化合物，以及抗HIV和/或抗愛滋病藥劑或其可藥用鹽。
對治療特定症狀而言，可以原樣給予含或不含第二組分化合物的第一組分化合物，也可將其製成單位劑型的藥物組合物，供腸胃外給藥、經皮給藥、直腸給藥、經鼻給藥或靜脈給藥，優選口服給藥。這些藥物組合物以本領域公知的方式製備，包含至少一種選自A87689化合物的活性化合物，還可以視需要而包含一種或更多種第二組分化合物及藥用載體。在這樣一種組合物中，活性化合物和第二組分化合物(如果有的話)稱為活性成分。製備這些組合物時，通常將活性成分與載體混合，或用載體稀釋，或包在載體內，載體的形式可以是膠囊、香囊、紙或其他容器。載體起稀釋劑作用時，可以是對活性成分起媒介物、賦形劑或介質作用的固體、半固體或液體物質。因此，該組合物的形式可以是片劑、丸劑、粉劑、糖錠劑、香囊劑、扁囊劑、酏劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、混懸劑、軟硬明膠膠囊劑、無菌注射液、無菌包裝粉末。
適宜的載體、賦形劑和稀釋劑的一些例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、黃蓍膠、明膠、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯和丙酯、滑石、硬脂酸鎂、水、礦物油。這些製劑還可以含有潤滑劑、潤溼劑、乳化和懸浮劑、防腐劑、甜味劑或調味劑。這些組合物可以配製得使其在用本領域公知方法給予患者後，能使活性成分快速釋放、持續釋放或延緩釋放。就口服而言，可將化合物(還可能含有第二組分化合物)與載體和稀釋劑混合成型為片劑，也可包在明膠膠囊內。也可將這些混合物溶解在諸如10%葡萄糖水溶液、等滲鹽水、無菌水等液體中，靜脈給予或注射給予。
組合物最好配製成單位劑型，每個劑量含有約1至500mg活性成分，更常見的是約5至300mg活性成分。術語「單位劑型」是指適於作為人類或其他哺乳動物單元劑量的物理上獨立的單位，每個單位含有經計算能產生預期療效的預定量的活性物質，以及所需的可藥用載體。這些組合物可以含有A87689化合物作為活性成分，也可以含有A87689化合物加第二組分化合物作為活性成分。「可藥用」是指載體、稀釋劑或賦形劑必須可與製劑的其他成分配伍，對受藥者無損害。
下列製劑實施例僅是說明性的，決不是要限制發明範圍。術語「活性成分」的含義限定如上。
製劑1用下列成分製備硬明膠膠囊量(mg/膠囊)活性成分250乾燥澱粉200硬脂酸鎂10總計460mg
製劑2用以下成分製備片劑量(mg/片)活性成分250微晶纖維素400烘製二氧化矽10硬脂酸5總計665mg將各組分混合後壓製成片劑，每片重665mg。
製劑3製備含有下列組分的氣霧劑溶液重量活性成分0.25乙醇25.75拋射劑22(-氯二氟甲烷)70.00總計100.00將活性化合物與乙醇混合，將該混合物加到一部分拋射劑22中，冷卻到-30℃，轉移到裝填裝置中。然後將所需量送入不鏽鋼容器中，用剩下的拋射劑稀釋。然後在該容器上裝配閥門裝置。
製劑4如下製備每片含60mg活性成分的片劑活性成分60mg澱粉45mg
微晶纖維素35mg聚乙烯吡咯烷酮(10%水溶液)4mg羧甲基澱粉鈉4.5mg硬脂酸鎂0.5mg滑石1mg總計150mg使活性成分、澱粉和纖維素通過45目美國篩並充分混合。使所得粉末與含有聚乙烯吡咯烷酮的水溶液混合，然後使該混合物通過14目美國篩。將所製成的顆粒在50℃下乾燥，並通過18目美國篩。然後在顆粒中加入已預先通過60目美國篩的羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂和滑石，混合後在壓片機上壓製成每片重150mg的片劑。
製劑5如下製備每膠囊含80mg活性成分的膠囊劑。
活性成分80mg澱粉59mg微晶纖維素59mg硬脂酸鎂2mg總計200mg將活性成分、纖維素、澱粉和硬脂酸鎂混合後通過45目美國篩，再填裝到硬明膠膠囊中，每膠囊裝200mg。
製劑6如下製備每劑含225mg活性成分的栓劑。
活性成分225mg
飽和脂肪酸甘油酯2，000mg總計2，225mg使活性成分通過60目美國篩，並懸浮在預先用所需的最少熱量熔化的飽和脂肪酸甘油酯中。然後將該混合物傾入額定容量為2g的栓劑模中，令其冷卻。
製劑7如下製備每5ml劑量含50mg活性成分的混懸劑。
活性成分50mg羧甲基纖維素鈉50mg糖漿1.25ml苯甲酸溶液0.10ml調味劑適量著色劑適量純化水加至總量為5ml將活性成分通過45目美國篩並與羧甲基纖維素鈉和糖漿混合，形成均勻糊狀物。將苯甲酸溶液、調味劑和著色劑用一部分水稀釋後在攪拌下加入。然後加入足夠的水達到所需體積。
製劑8可如下製備靜脈用製劑活性成分100ml等滲鹽水1，000mlA87689化合物在很寬的劑量範圍內都有效。例如，日劑量通常在每千克體重約0.1至50mg範圍內。對成人進行治療時，優選劑量範圍為約5至25mg/kg(單次或分次劑量)。但應該理解，實際給予的化合物的量將由醫師根據有關條件來確定，有關條件包括疾病的相對嚴重程度、所要給予的化合物的選擇、年齡、體重、患者的個體反應，所選擇的給藥途徑。所以，上述劑量範圍決不是要限制本發明的範圍。第二組分化合物的劑量範圍是本領域所已知的，應遵照使用。
A87689在體外磷脂酶A2模型中體外蛇毒(Najanaja)試驗在該試驗中，通過用膜濾器(截留分子量為10，000，Centr-icon)過濾從培養液中除去微生物產生的內源性磷脂酶。將培養液(100ml)在總體積為0.54ml的反應混合物中於37℃保溫1小時。反應混合物的組成為0.24mM 1-棕櫚醯基-2-〔6-〔〔7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)氨基〕己醯基〕磷脂醯膽鹼(PLA2生色底物，Avanti，Polar-Lipids，Inc.，Alabas-ter，AL)、0.76mM磷脂醯膽鹼、10mM曲拉通X-100(表面活性劑，Sigma)、10mM CaCl2、37mM TRIS-HCl，PH8.5(Sigma)、0.07單位/ml Naja naja PLA2(Sigma)。加入0.2ml 0.25M乙二胺四乙酸(EDTA)停止反應。用高效液相色譜法從底物中分離出產物即〔(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)氨基〕己酸。用C8防護管將試驗混合液(20ml)注入C8柱(0.46×15cm，ZORBAX)上(溶劑∶乙腈∶水∶乙酸(40∶60∶1);流速1.5ml/分;產物檢測453nm紫外;保留時間3.72-3.76分鐘)。表4和表5示出了A87689化合物在本試驗中的作用。
人細胞質PLA2試驗用從人U937成單核細胞中純化出的細胞質PLA2來測試A87689的體外抑制活性。該試驗如Kramer等人所述進行(Kramer，R.M.，Roberts，E.F.Manetta，J.和Putnam，J.E.，「C2+a敏感性細胞質磷脂酶A2是人U937成單核細胞中的100KD蛋白質」，J.Biol.Chem.266(8)∶5268-5272)。簡言之，把試驗化合物溶解在150ml試驗緩衝液中，形成不同微摩爾濃度，向其中加入50ml經過超聲處理的脂質體，脂質體中含有1-棕櫚醯基-2-〔14C〕花生四烯醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼和1，2-二油醯基甘油(摩爾比為2∶1)。上述試驗混合物中含有1mM CaCl2、2mM 2-巰基乙醇、150mM NaCl、50mM N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)PH7.5和1mg/ml牛血清清蛋白(BSA)。在每管中加入酶(5ml，稀釋到能使底物達到10-20%水解)，將該混合物於37℃下保溫15分鐘。用Doles試劑停止反應(Zhang，Y.Y.，Deems，R.A.和Den-nis，E.A.，Methods in Enzymology，第197卷第457頁，Academic Press，New York，1991)。用己烷∶水(1.2∶1)提取游離的花生四烯酸標記物。將上相移至裝有0.1g矽膠的管中，混合後在1500×g下離心，移出上清液進行閃爍計數。對每個藥物濃度計算抑制度並作圖，抑制度以抑制最大反應50%的量(IC50)來表示。A87689在該試驗中的作用示於表4。在該試驗中，A87689化合物的效力比蛇毒或胰PLA2的經典抑制劑(如對溴苯甲醯甲基溴、袂杷克扔或邁諾阿利德(manoalide))要強得多。
全細胞PLA2試驗人前髓白血細胞(HL-60)如在1.5%DMSO存在下進行培養，則被誘導分化成粒細胞樣細胞，這種細胞在對鈣離子載體A23187的刺激作出反應時釋放白三烯B4(LTB4)和凝血噁烷B2(TXB2)。用PLA2抑制劑邁諾阿羅格(manoalogue)((E，E)-2-〔3-(2，5-二氫-2-羥基-5-氧-3-呋喃基)亞丙基〕-6，10-二甲基-5，9-十一碳二烯醛)處理這些細胞，能抑制上述類二十烷的釋放。邁諾阿羅格是分泌形式PLA2(Reyn-olds等，J.American Chemical Society 110∶5172，1988)和細胞內形式PLA2(Dennis等，J.Biol.Chem.264∶8520，1989)的抑制劑。
HL-60細胞試驗的程序如下將得自美國典型培養物保藏中心(ATCC)的HL-60細胞懸浮培養在添加有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基(Gibco)中，培養於37℃下在5%CO2的潮溼氣氛中進行。在1.5%DMSO存在下培養7天，誘導細胞分化成粒細胞樣細胞。於4℃下離心5分鐘收集細胞，在添加有0.1%BSA、1.1mM MgCl2和1mM CaCl2的118mM NaCl、4.6mM KCl、24.9mM NaHCO3、1mM KH2PO4和11.1mM D-葡萄糖、5mM HEPES，PH7.4中洗滌一次。將洗過的細胞重新懸浮至濃度為1×106個細胞/ml，並在開始試驗前預熱至37℃並保溫5分鐘。將細胞與抑制劑一起預保溫5分鐘，然後與鈣離子載體A23187一起保溫5分鐘。離心終止反應。傾出上清液並進行處理，以進行酶免疫測定(EIA)。進行白三烯B4和凝血噁烷B2酶免疫測定時的終體積為150ml，其中含有100mM磷酸鉀緩衝液，PH7.4、0.4M NaCl、1mM EDTA、1.5mM NaN3和0.1% BSA，其中測定LTB4時樣品的體積為5ml，測定TXB2時樣品的體積為50ml。然後在96孔微量滴定板(用每孔5mg的小鼠抗免IgG抗體預塗)中將樣品與抗體和示蹤物一起於室溫下保溫過夜。洗去過量的抗體和示蹤物後，在小孔中加入200ml Ellman試劑(免疫測定試劑盒，Cayman Chemical Company)，將樣品於25℃下保溫4小時。測量405nm處的光密度。將抑制劑、鈣離子載體A23187和試驗化合物溶解在DMSO中作為貯液(10mM)，以10ml的總體積以不同的濃度加到各試驗中。A87689在該試驗中的作用示於表4。
表4 A87689在PLA2體外試驗中的活性IC50試驗鈣鹽游離酸蛇毒(Naja naja)PLA28.0mg/ml 6.3mg/ml純化人細胞質PLA222mg/ml 17.2mg/ml全細胞HL-60細胞試驗無活性*＊游離酸在10mM時有一些活性，但抑制活性穩定在30-40%抑制。
表5A87689化合物在蛇毒(Naja naja)PLA2試驗中的活性化合物 IC50游離酸6.3mg/ml四乙酸鈣鹽9.5mg/ml五鈉鹽6.7mg/ml
A87689在體內關節炎模型中在為測試抗炎活性而設計的三種不同的體內關節炎模型中測試A87689。在其中的每個動物模型中，給大鼠的後爪注射一種能誘發爪關節炎樣狀態的物質，這種狀態的表現是出現腫脹的發炎軟組織和骨損傷。這種狀態是誘發性關節炎的一種形式，具有抗炎活性的藥劑能通過組織炎症的減輕和骨損傷的減輕而得以鑑定。
口服並在腹膜內和皮下注射試驗化合物。優選口服，但A87689在腸胃外給藥時也產生良好的抗炎活性。許多刺激性物質在腹膜內注射時都常常導致腹膜炎。這種腹膜炎與通過軟組織炎症減輕而表現出的抗炎活性相關。另外，皮下注射刺激性物質還會導致非特異性抗炎活性。每個實驗與非特異性刺激物對照(如1%角叉膠或稀乙酸)平行進行，以觀察有多少抗炎活性是非特異性的。
類脂叔胺誘發的關節炎模型類脂叔胺(lipoidalamine)誘發的關節炎試驗，是一種由懸浮在礦物油中的佐劑物質N，N-二(十八烷基)-N′，N′-二(2-羥基乙基)丙二胺(LA)誘發的全身性炎症和關節炎模型。所致的疾病與用弗氏完全佐劑(FCA)處理過的大鼠所發生的疾病很類似(Chang，Y.，Pearson，C.M.和Abe，C.，「佐劑多關節炎IV合成佐劑的誘發作用免疫、組織病理及其他研究」，Arth.Rheum23∶62-71，1980)。許多組織都出現炎症，但脾和關節最顯著。測試化合物在已確立的疾病中調節脾和關節炎症的能力(在第9天開始治療)。
將動物(Lewis/SpragueDawley，雄性，200-220克)分成若干組，每組5隻，圈養在掛起的籠子中，隨時可取食飼料和水。在第0天，在動物尾巴基部皮下注射7.5mgLA。第9天給動物稱重並開始給予化合物。用組織勻漿器將化合物懸浮在1%CMC溶液中。口服篩選劑量為50mg/kg。每天給予化合物一次，共給予5天(第9-13天)，第14天不給藥。第15天給動物再次稱重，用水壓表測量後爪體積。然後將動物麻醉，通過心臟穿刺放血。無痛處死動物後，摘出脾並稱重，在踝關節正上部摘下後爪並稱重。分析各血樣中的纖維蛋白原。然後計算所有這些參數的平均值和標準差，計算出與患病(LA)對照的差異百分比。利用對原始數據進行的DunnetT計算確定統計顯著性。LA關節炎試驗的陽性對照為地塞米松。口服劑量為0.1mg/kg的地塞米松將抑制爪腫脹80-90%，抑制脾重90-100%。對纖維蛋白原的影響較為不定，但通常抑制50-70%。
對那些對爪腫脹或脾重顯示出統計抑制作用的化合物以50mg/kg的劑量再次實驗，如果活性得到驗證，則進行劑量反應實驗。還可以在下邊討論的兩種完全弗氏佐劑誘發的大鼠關節炎模型中測試這些化合物。
如果在本試驗中以14mg/kg(在DMSO中)的劑量皮下給予A87689的鈣鹽，則注射後爪腫脹被抑制46%。
如果在本試驗中將A87689的鈉鹽溶解在水中並以20mg/kg的劑量皮下給予，則抑制爪體積腫脹30%。同樣，如將A87689鈉鹽溶於DMSO並以10mg/kg的劑量腹膜內給予，則抑制爪腫脹15%。但如將該鈉鹽溶於DMSO並以10mg/kg的劑量皮下給予，則抑制爪腫脹65%。
弗氏完全佐劑誘發的多關節炎所用的兩種體內模型是基於從足底向大鼠後爪引入弗氏完全佐劑，並測量所產生的炎症。用三種方法給予A87689化合物腹膜內(IP)、口服(PO)和皮下(SC)。這兩個基於向鼠爪內引入弗氏完全佐劑的模型為「形成試驗」和「確立試驗」。
在形成試驗中，用體重220-240克的雄性Wistar-Lewis大鼠(HarlanSpragueDawleyLaboratories)進行測試。動物在使用前先適應實驗室條件7天。給動物隨時提供PurinaLabChow飼料和水，並進行12小時光照和無光照循環。用礦物油1∶6稀釋PERRIGEN(佐劑，Calbiochem)，使終濃度達到0.083%，製得弗氏完全佐劑。第0天給大鼠右後爪一次足下注射0.1ml弗氏完全佐劑懸浮液。以五隻為一組將動物分組並稱重。在形成試驗中，在第0天開始用試驗化合物進行治療。正常對照和弗氏完全佐劑對照給予無效媒液。用電放大排水儀測量爪體積，每周測三天。第14天把動物再次稱重並對治療劑量作適當調整。第28天停止試驗，然後把動物再次稱重，測量爪體積，製作兩個後爪的射線照片。製作注射爪和未注射爪的體積曲線，計算曲線下的面積。把這些面積與弗氏完全佐劑對照作比較，由弗氏完全佐劑對照計算出抑制百分率。對射線照片進行分析，根據骨膜隆凸、關節腔收縮和鈣沉積情況確定骨損傷評分。
在形成試驗中，當以25mg/kg口服A87689鈣鹽(在1%CMC溶液中)時，抑制爪腫脹59%。當以10mg/kg腹膜內給予A87689鈣鹽(在DMSO中)時，抑制爪腫脹98%。
當以5mg/kg腹膜內給予A87689鈉鹽(在DMSO中)時，抑制爪腫脹108%，但接受這種治療的大鼠出現腹膜炎。同樣條件下但以10mg/kg給藥，A87689鈉鹽抑制爪腫脹101%(該組中有兩隻大鼠死於腹膜炎)。
「確立試驗」是「形成試驗」的一種變式，其中所有條件都相同，只是直到第14或15天才開始用化合物治療，此時大鼠的未注射爪至少腫脹0.5ml，表明已患有確立疾病。
在確立試驗中，A87689鈣鹽在以50mg/kg(在1%CMC中)腹膜內給予時，抑制確立損傷部位爪腫脹58%。
本說明書所描述的用A87689化合物所做的試驗還證實了這些化合物對人T細胞白血病毒和HIV-1的活性。以下描述的是在分析A87689化合物對這些疾病的效果時所用的試驗體系。
莫洛尼氏鼠白血病毒(Mo-MuLV)體外試驗用如Rowe，W.P.等人(Virol.42∶1136-1139，1970)所述的XC試驗體外測試A87689化合物對莫洛尼氏鼠白血病毒(Mo-MuLV，Clone E7，The Salk Institute，La Jolla，California)的活性。一般做法是，將3-5×103個SC-1細胞(CRL-1404;美國典型培養物保藏中心(ATCC)接種在96孔微量滴定板的每個小孔中的最低必需培養基中，培養基中添加有5%胎牛血清、青黴素(150單位/ml)、鏈黴素(150μg/ml)、溴化己二甲銨(2μg/ml)。第二天，每小孔用MO-MuLV感染(感染複數＝10PFU/細胞)。
使病毒與細胞吸附1小時後，向細胞中加入含有連續稀釋的A87689化合物的培養基。未使用半固體培養基。
培養5天後(此時細胞匯合)，將SC-1細胞紫外照射10秒鐘，每孔加入5-8×104個XC細胞(CCL-165，ATCC)。通常需要再培養兩天，以達到充分的病毒誘發的細胞致病作用。A87689化合物在本試驗中的作用與表4重合。
為評價A87689化合物的殺病毒活性，將所要評價的化合物經連續稀釋後與MO-MuLV一起於37℃下預保溫1小時。然後用兩倍稀釋的各種A87689化合物-病毒混合物感染SC-1細胞。在37℃下使病毒與細胞吸附1小時後，用Hank氏平衡鹽溶液(HBSS;GIBCO，GrandIsland，N.Y.)將病毒感染的細胞洗滌三次，用如上所述的XC細胞試驗監測細胞是否出現細胞致病作用。
體外HIV抗病毒試驗在人T淋巴細胞系「H9」中繁殖HIV-1的HTLV-ⅢB株(popovic，M.等，Sience，224∶497-500，1984)。病毒接種物由H9-ⅢB生產培養物的上清液組成。
用MT-2(Harada等，Sience，229∶563-566，1985)和CEM(Nara等，Nature，332∶469-470，1988)細胞系進行常規篩選。在RPMI 1640培養基中培養細胞。為繁殖H9細胞，在RPMI培養基中添加胎牛血清，濃度為20%(V/V)。為在試驗過程中稀釋化合物及保持培養物，用於繁殖MT-2細胞系的培養基中添加10%(V/V)胎牛血清。每個培養基中還含有100單位/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素和25mM HEPES緩衝液。在37℃下，在含有5%CO2的潮溼空氣中，將培養物保持在一次性使用的實驗室組織培養器械中。
試驗前的準備工作還包括配製用於以量熱法評價細胞成活率的XTT-PMS試劑，配製方法是將200μg/ml的XTT(四唑試劑，DiagnosticChemicals，Oxford，CT.)與0.02mMPMS(吩嗪甲基硫酸酯，SigmaChemical，St.Louis，MO)混合。
將A87689化合物以40mg/ml溶於DMSO中，或以2mg/ml溶於無菌去離子水中。特別是將A87689的鈣鹽和游離酸溶於DMSO。溶於DMSO的化合物先在培養基中稀釋至濃度為0.2mg/ml，而溶於水的化合物則先在培養基中稀釋至濃度為0.2mg/ml。隨後進行對數或半對數連續稀釋。
為評價細胞毒性，將每個稀釋液以100μl/孔的量加到微量板中。用感染細胞測試A87689化合物時，每個稀釋液用三個平行小孔進行重複試驗，用未感染細胞測試時，每個稀釋液二個平行小孔。
在準備感染細胞和未感染細胞之前，用臺盼藍對所要使用的細胞進行活細胞計數。
將所需總數的細胞置於50ml錐形離心管(無菌且一次性使用)中，加入病毒使MT-2細胞的感染複數達0.03TCID50/細胞，CEM細胞的感染複數達約0.12 TCID50/細胞。加入新鮮培養基將細胞密度調整到1×105個細胞/ml，在鋪平板前將病毒-細胞懸浮液於37℃下保溫1-2小時。以同樣方式但不加病毒製備未感染細胞。
接著，將感染細胞和未感染細胞以100μl/孔的量加到平板中，使起始細胞數為1×104個細胞/孔。然後在含5%CO2的潮溼空氣中，將以上述方式準備的微量板保溫7天。
為對病毒的細胞致病作用(CPE)進行定量並測定A87689化合物的活性，在每小孔中加入50μl XTT-PMS溶液，將微量板再送回到CO2培養箱中保溫4小時。然後從板上取下蓋，換上粘性密封板。將蓋著密封板的微量板放入VMax平板讀數儀中，於450nm和650nm處讀出讀數。A87689化合物在該試驗中的作用示於表5。
表6A87689化合物在莫洛尼氏鼠白血病毒體外試驗中的活性A87689 IC*50鈣鹽0.4μg/ml游離酸0.4μg/ml五鈉鹽0.5μg/ml四乙酸游離酸0.2μg/ml＊IC50＝抑制CPE 50%所需的A87689化合物濃度。
表7A87689化合物在HIV體外試驗中的活性A87689 IC*50游離酸8.5μg/ml五鈉鹽18.8μg/ml＊IC50＝抑制CPE50%所需的A87689化合物濃度。
下列實施例進一步說明本發明的化合物。這些實施例決不是要限制發明範圍，不應造成誤解。
實施例1A87689的發酵A.搖瓶用培養物A87689即NRRL18815的冰凍乾燥粉或保存在液氮中的懸浮液，接種具有營養培養基A組成的營養培養基營養培養基A成分量(%)葡萄糖1.0馬鈴薯糊精3.0大豆粉2.0棉籽粉＊2.0CaCO30.2自來水加至1升未調節PH＊PROFLO Flour，Traders Protein，P.O.Box 8407，Memphis，TN 38108培養物保存在液氮中時，將營養培養物(30℃培養48小時)懸浮在懸浮培養基中達培養體積，用營養培養物的菌絲體製備安瓿。懸浮培養基中含有乳糖(100g)、甘油(200ml)、去離子水(加至1升)。
用液氮安瓿接種裝在250ml培養瓶中的50ml營養培養基。將培養物置於以250rpm沿二英寸(5.08cm)圓周轉動的搖床上，於30℃下培養48小時。
用營養培養物(2%V/V接種物)接種50ml具有下列組成的生產培養基
生產培養基Ⅰ成分量(%)葡萄糖3.0蛋白腖＊0.75赤糖糊糖蜜0.5CaCO30.2去離子水加至1升未調節PH＊BACTO PEPTONE，Difco Laboratories將接種後的生產培養基置於250ml錐形瓶中，在以250rpm沿二英寸圓周旋轉的搖床上，於30℃下培養5-6天。
B、攪拌生物反應器發酵為提供較大體積的接種物，用15ml如A部分所述製備的經過培養的第一期營養培養物，接種60ml組成與第一期營養培養基相同的第二期營養培養基。將第二期培養物置於2升廣口錐形瓶中，在以250rpm沿二英寸圓周旋轉的搖床上，於30℃下培養約24小時。
用如此製得的經過培養的第二期營養培養物(2.4升)，接種80至115升無菌生產培養基Ⅱ。
生產培養基Ⅱ成分量(%)葡萄糖2.35蛋白腖＊0.75赤糖糊糖蜜1.4CaCO30.2
去離子水加至1升未調節pH，在培養基中加入消沫劑(SAG471)控制起沫＊BACTO PEPTONE使接種後的生產培養基在165升攪拌生物反應器中於30℃下發酵7-8天。用計算機控制攪拌容器中的空氣流量和攪拌器速度，以保持溶解氧濃度為45%空氣飽和。用H2SO4和NaOH控制PH(如果需要)在6.7和7.6之間。在接種25-27小時後，開始以4.5克/升/天的速度送入葡萄糖溶液(0.33克/ml去離子水)。從42-44小時時開始，把速度提高到5.7克/升/天。
實施例2A87689.1的發酵按照實施例1的方法，但使用A87689.1(NRRL18851)培養物來生產化合物A87689。
實施例3A87689的分離和純化將發酵液(88升，如實施例2所述製備)用陶瓷濾器(Memb-ralox Systems，Illinois Water Treatment，Rockf-ord，Illinois)過濾，得到66升含A87689的濾液。將濾液以500ml/分的流速泵送到DIAION HP-20SS(一種聚苯乙烯型樹脂，日本東京三菱化成工業株式會社)(5升)不鏽鋼柱(3×48英寸)上。用20升甲醇∶水(1∶3)洗柱，用甲醇∶水(1∶1)洗脫出活性，收集10個4升的級分。分析各級分的PLA2抑制活性。將含有大部分活性的級分4和5合併並真空濃縮至2500ml，作為併集液1。將級分3、6、7和8合併作為第二個活性併集液。將併集液1中形成的沉澱物離心出來並溶於60ml DMSO中。從該DMSO溶液中取一份10ml樣品，泵送到裝有400ml矽膠C8(150A)樹脂的DYNAMAX HPLC C8柱上(4.1×30cm，Rainin Instruments Co.，Emeryville，CA)。用乙腈∶水∶5%NH4OAc(10∶85∶5)至乙腈∶水∶5%NH4OAc(50∶45∶5)梯度，以25ml/分鐘的流速在70分鐘內將柱展開，以25ml為一級分收集。用Waters481檢測器(Millipo-re Corporation，Milford，MA)在254nm處監測洗脫過程。濾出級分36、37和38中形成的晶體，並真空乾燥。將樣品分離過程再重複5次，得到總收量為1162mg的結晶A87689鹽(在約300℃分解，沒有真實熔點)。
實施例4分離純化A87689的替代方法將如實施例1所述得到的全發酵液(225升)用壓濾器和3%HYFLO SUPERCEL助濾劑(硅藻土，Johns Manville Products Corp.)過濾。用5N HCl將濾液(190升)的PH由7.4調節至7.0，加入DIAION HP-20樹脂(20升)並攪拌2小時。濾除樹脂，用100升蒸餾水洗滌，然後加100升水∶甲醇(3∶1)在容器中攪拌30分鐘進行洗滌。傾出上清液，樹脂加50%甲醇水溶液攪拌，以洗脫A87689活性。濾出含活性的甲醇上清液，樹脂加100升甲醇進行攪拌，以分離出其餘的活性並再生樹脂。用蛇毒(Naja naja)PLA2試驗監測洗脫過程。
將50%甲醇流出液真空濃縮至20升，調PH至7.0，溶液用20升正丁醇提取兩次。廢水層經冰凍乾燥得到56g粗產物(這種物質不能用正丁醇萃取，其純化將在實施例4B中敘述)。將正丁醇提取液合併並真空濃縮至幹。將殘渣溶於100ml水和100ml二噁烷中，經冰凍乾燥得到14.7g粗製A87689。將該粗製A87689在超聲處理下溶於300ml甲醇，在-10℃下放置直至形成沉澱。濾出沉澱物並真空乾燥，得到1.4g部分純化的A87689。
將該物質(100mg)在10ml水中攪拌，用5N NaOH將該懸浮液調至PH12.0，以溶解沉澱。用5N HCl將PH緩慢調至7.0，並將該溶液加到裝有100ml矽膠C8(150A)樹脂的DYNAMAX 150A柱上(Rainin Instrument Co.，Emeryville，CA)。用乙腈∶水∶1%NH4OAc(5∶85∶10)至乙腈∶水∶1%NH4OAc(50∶40∶10)梯度，以8ml/分的流速在50分鐘內將柱展開。用Waters 481檢測器(Millipore Corporation，Milf-ord，MA)在260nm處監測洗脫過程。合併級分2和3，真空濃縮除去乙腈，放置過夜使其結晶。重複這一步驟，合併兩次操作得到的晶體，過濾並真空乾燥，得到29mg結晶A87689鈣鹽(m.p.∶300℃以上分解)。這種鹽形式在水中的溶解度很低，但易溶於DMSO，在實用性的討論中將其稱為「水不溶性鹽」或「鈣鹽」。
實施例4A另一種分離純化A87689的替代方法實施例4的一種替代方法是，將部分純化的A87689乾燥沉澱物重新懸浮於水中，不將PH從12調至7，而是直接把溶液加到柱上。將所得的非結晶鈉鹽冰凍乾燥，該鹽可溶於水。在實用性的討論中，這種形式稱為「水溶性鹽」或「鈉鹽」。
實施例4B不可用正丁醇萃取的製備物的純化取一部分實施例4的不可用正丁醇萃取的物質(200mg)，溶於10ml水中，並加到裝有100ml矽膠C8樹脂的DYNAMAX 150A柱上。用乙腈0.1% NH4OAc(1∶20)至乙腈0.1% NH4OAc(1∶1)梯度，以10ml/分的流速在30分鐘內將柱展開，以8ml為一級分進行收集，在260nm處監測洗脫過程。濾出級分22(活性最強的級分)中形成的晶體，真空乾燥後得到8mg結晶A87689鹽。將濾液冰凍乾燥，又得到19mg無定形A87689鹽。
實施例5由A87689鈣鹽製備A87689游離酸在室溫下，將如實施例4所述得到的純化A87689鈣鹽(0.44g)懸浮在5N HCl(0.05升)中，加入丙酮(0.05升)。10分鐘後觀察到一種黃色溶液，30分鐘後開始沉澱。在室溫下，將該懸浮液在氮氣中攪拌18小時。將反應混合物真空減至1/2體積並過濾，用1N HCl溶液洗滌後得到黃色粉末(0.58g)。將仍然潮溼的粉末溶於CHCl3(0.2升)中，並用水洗兩次。CHCl3層用Na2SO4乾燥。過濾並真空除去溶劑後，得到黃色泡沫狀物(0.306g)，即為A87689的游離酸。最終物質為黃色結晶狀。TLC(Merck SG)用碘蒸氣檢測出單點物質(Rf＝0.5;氯仿∶甲醇∶氨，6∶3∶1)，HPLC表明純度為77.9%。用μBondapak C18SG柱(Waters Chromatography Divis-ion，Millipore Corporation)進行HPLC，以2ml/分的流速用CH3CN∶0.1%NH4OAc(1∶9至7∶3)梯度液洗脫，在254nm處進行紫外檢測，表明該游離酸的HPLC保留時間為6.4分鐘。
A87689的游離酸具有如下特性分子量1184.462經驗式C66H72O20FAB-MS(M+1)實測值1185.4695計算值1185.4680元素分析計算值C，66.88;H，6.12實測值C，66.52;H，5.95。未檢測到氮或硫。
UV(EtOH，1max)，中性304(e＝54805)238(e＝64335)鹼300(e＝56569)237(e＝72695)酸314(e＝59871)236(e＝38628)218(e＝40085)熔點＞200至320℃開始炭化。
滴定表明PKa為3.5(約三個基團)A87689游離酸的紅外光譜(KBr片)示於附圖2。最有意義的最大吸收出現在下列頻率(Cm-1)3439，1758，1688，1636，1568，1395，1002，981和753。
實施例6四乙酸鈣鹽的製備將A87689鈣鹽(100mg)溶於無水吡啶(3ml)中。向該溶液中加入乙酸酐(1ml)。在氮氣下將溶液加熱至40℃120小時。將溶液冷卻至室溫，真空濃縮至幹，得到粘性殘渣。將該殘渣用氯仿∶甲醇(1∶1)研製，過濾並真空乾燥，得到淺黃色粉末(112mg)。A87689四乙酸鈣鹽在實施例5所述的HPLC系統上的保留時間為12.2分鐘。該四乙酸鈣鹽具有下列特徵分子量1390.460經驗式C74H78O24CaFAB-MS(M+1)實測值1391.4659計算值1391。4677UV(EtOH，lmax)中性300(e＝31700)238(e＝32700)鹼295(e＝57900)206(e＝311000)酸306(e＝53900)225(E＝62300)A87689四乙酸鈣鹽的紅外光譜(KBr片)示於附圖3。最有意義的最大吸收出現在下列頻率(Cm-1)3436，1728，1641，1457，1241，1027和1003。
實施例7A87689四甲基醚鈣鹽的製備將A87689鈣鹽(0.1g)溶於含10%NaOH(1.5ml)的DMSO(10ml)中。向該溶液中加入甲基碘(0.5ml)。在氮氣下，將該溶液於40℃下攪拌18小時。冷卻至室溫，用1N HCl調至PH1.5。過濾收集沉澱，用H2O洗兩次，真空乾燥，得到115mg褐色粉末。
在實施例5所述的TLC系統上，A87689四甲基醚鈣鹽的Rf值為0.75。A87689四甲基醚鈣鹽具有下列附加特徵分子量1280經驗式C70H78O20CaA87689四甲基醚鈣鹽的紅外光譜(KBr片)示於附圖4。最有意義的最大吸收出現在下列頻率(cm-1)3434，1718，1637，1465和1089。
實施例8A87689五鈉鹽的製備將A87689游離酸(70mg)溶於甲醇(1ml)中，向其中加入1ml H2O，然後用2N NaOH將PH調至12。在氮氣下，將該溶液室溫攪拌1小時。將該溶液真空濃縮至接近乾燥，得到半固體物，用2ml乙腈∶甲醇(1∶1)研製並過濾，得到白色粉末(52mg)。將這種水溶性粉末用甲醇研製，收集所得固體並乾燥，得到白色固體(38mg)。
A87689五鈉鹽在實施例5所述的TLC系統上的Rf值為0.3，在實施例5所述的HPLC系統上的保留時間為5.25。A87689五鈉鹽具有下列附加特徵分子量1294.371經驗式C66H67O20Na5FAB-MS(M+1)實測值1295.3814計算值1295.3792UV(EtOH，lmax)中性299(e＝40379)237(e＝47771)鹼299(e＝42623)235(e＝30162)酸312(e＝40908)235(e＝30162)221(e＝29110)A87689五鈉鹽的紅外光譜(KBr片)示於附圖5。最有意義的最大吸收出現在下列頻率(cm-1)3430，1710，1623，1436，996，834和701。
實施例9A87689四甲基醚游離酸的製備將A87689鈣鹽(50mg)溶於含有0.8ml 10%NaOH溶液的5ml DMSO中。向其中加入0.25ml甲基碘。在氮氣下，將該反應液於40℃下攪拌18小時。然後將反應液冷卻至室溫，用5N HCl調PH至2。然後將反應混合物真空濃縮至原始體積的0.75倍，並用100ml CHCl3稀釋。CHCl3層用5%Na2S2O3洗2次，接著用水洗2次。移出有機層並真空乾燥，得到68mg乳黃色固體。將該固體用石油醚B研製，然後用乙醚研製。過濾收集固體並真空乾燥，得到33mg黃色細殘渣。
A87689四甲基醚游離酸在實施例5所述的TLC系統上的Rf值為0.7，在實施例5所述的HPLC系統上的保留時間為10.23分鐘。A87689四甲基醚游離酸具有下列附加特徵分子量1240經驗式C70H80O20FAB-MS(M+1)實測值1241.5387計算值1241.5322UV(EtOH，lmax)中性304(e＝47104)239(e＝51704)鹼296(e＝51763)233(e＝71752)212(e＝227629)酸312(e＝50737)233(e＝37297)218(e＝37705)
權利要求
1.一種製備A87689或A87689的C1～6烷基醚或C1～6烷醯基酯衍生物、或其可藥用鹽的方法，該方法包括在深層通氣發酵條件下，在含有可吸收碳源、氮源和無機鹽源的培養基中，培養Amycolatopsis mediterraneiNRRL18815、NRRL18851、或其A87689生產突變株；如果適當可隨後進行成鹽、酯化、醯化或形成其醚衍生物。
2.根據權利要求1的方法，其中所製備的是A87689或其可藥用鹽。
3.根據權利要求1的方法，其中所製備的是A87689的鈣鹽。
4.根據權利要求1的方法，其中所製備的是A87689的游離酸。
5.根據權利要求1的方法，其中所製備的是A87689的五鈉鹽。
6.根據權利要求1的方法，其中所製備的是A87689的四甲基醚衍生物。
7.根據權利要求1的方法，其中所製備的是A87689的四乙酸衍生物。
8.一種Amycolatopsis mediterranei NRRL 18815、NRRL 18851或其A87689生產突變株的生物純培養物。
9.一種製備藥物製劑的方法，該方法包括，將如前所述的A87689、或A87689的C1～6烷基醚或C1～6烷醯基酯衍生物、或其可藥用鹽，與一種或更多種可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合。
全文摘要
由選自NRRL 18815和NRRL 18851的Amycolatopsis mcditcrranci菌株或其A87689生產突變株生產發酵產物A87689。A87689、其C
文檔編號C07K14/41GK1073979SQ92108990
公開日1993年7月7日 申請日期1992年8月1日 優先權日1991年8月1日
發明者D·R·貝裡, A·H·丹齊格, M·迪邦諾, R·L·哈米爾, R·M·莫洛伊, 姚慈晃, J·M·科拉奇諾, J·C·C·唐 申請人:伊萊利利公司