手性單體扁桃酸的獲得方法
2023-05-09 17:17:56
專利名稱：手性單體扁桃酸的獲得方法
技術領域：
本發明屬於生物工程領域，具體的說，是關於手性單體扁桃酸的獲得方法。
背景技術：
扁桃酸(Mandelic acid, ΜΑ)，又名苦杏仁酸、苯羥乙酸、α -羥基苯乙酸。在有機 合成和藥物生產中有著廣泛的用途，是尿路殺菌劑扁桃酸烏洛託品、末稍血管擴張劑環扁 桃酯、滴眼藥羥苄唑及烏託品類解痙劑的重要中間體。扁桃酸為手性分子，有R-扁桃酸和 S-扁桃酸兩種構型，其中結構式如下
權利要求
1.一種S-扁桃酸的製備方法，其特徵在於，所述方法以苯丙酮酸為底物，使用對羥基 扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶催化獲得。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法用於體內或體外製備S-扁桃酸。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述體內製備S-扁桃酸為向產生苯丙酮酸 的菌株或重組菌株內導入表達對羥基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶的序列。
4.如權利要求3所述的重組菌株，其特徵在於，所述對羥基扁桃酸合成酶來源於 Amycolatopsis orientalis 或 Streptomyces coelicolor。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述的產生苯丙酮酸的菌株或重組菌株體 內具有L-苯丙氨酸代謝途徑。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述的L-苯丙氨酸代謝途徑經過人工改造， 不利於苯丙酮酸積累且不影響菌株存活的代謝支路被部分或全部切斷。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述的不利於苯丙酮酸積累且不影響菌株 存活的代謝支路包括L-色氨酸途徑、L-酪氨酸途徑和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸的反應 途徑。
8.如權利要求3或5所述的方法，所述的產生苯丙酮酸的菌株或重組菌株為大腸桿菌。
9.如權利要求8所述的方法，所述的大腸桿菌為tyrBaspC tyrA三突變體菌株或 tyrA, tyrB, aspC, trpE 四突變體菌株。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述的菌株中MoFfto,PheAfbr過表達。
11.如權利要求3-1任一項所述的方法，其特徵在於，所述菌株或重組菌株利用葡萄糖 發酵。
12.一種用於發酵生產S-扁桃酸的重組菌株，其特徵在於，所述重組菌株產生苯丙酮 酸，且所述重組菌株表達對羥基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶。
13.如權利要求12所述的重組菌株，其特徵在於，所述對羥基扁桃酸合成酶來源於 Amycolatopsis orientalis 或 Streptomyces coelicolor。
14.如權利要求12所述的重組菌株，其特徵在於，所述苯丙酮酸通過重組菌株人工改 造的L-苯丙氨酸途徑代謝獲得。
15.如權利要求14所述的重組菌株，其特徵在於，所述人工改造的L-苯丙氨酸代謝途 徑是指不利於苯丙酮酸積累且不影響菌株存活的代謝支路被部分或全部切斷。
16.如權利要求15所述的重組菌株，其特徵在於，所述的不利於苯丙酮酸積累且不影 響菌株存活的代謝支路包括L-色氨酸途徑、L-酪氨酸途徑和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸 的酶反應途徑。
17.如權利要求12-16所述的重組菌株，其特徵在於，所述的重組菌株為大腸桿菌重組 菌株。
18.如權利要求17所述的重組菌株，其特徵在於，所述的大腸桿菌重組菌株為tyrB aspC tyrA三突變體菌株或tyrA，tyrB, aspC, trpE四突變體菌株。
19.如權利要求18所述的重組菌株，其特徵在於，所述重組菌株中MoFfto,PheAfto過表達。
20.一種R-扁桃酸的製備方法，其特徵在於，所述方法以苯丙酮酸為底物，依次使用A)對羥基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶催化苯丙酮酸生成S-扁桃酸；B)對羥基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脫氫酶催化S-扁桃酸生成苯乙酮 酸；和OD-扁桃酸脫氫酶或D-扁桃酸還原酶催化苯乙酮酸生成R-扁桃酸。
21.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述方法用於體內或體外製備R-扁桃酸。
22.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述體內製備R-扁桃酸為向產生苯丙酮 酸的菌株或重組菌株內導入表達A)對羥基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶；B)對羥基扁桃 酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脫氫酶；和C) D-扁桃酸脫氫酶或D-扁桃酸還原酶的序 列。
23.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，所述對羥基扁桃酸合成酶來源於 Amycolatopsis orientalis 或 Streptomyces coelicolor。
24.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，所述對羥基扁桃酸氧化酶來源於 Streptomyces coelicolor 禾口 Amycolatopsis orientalis。
25.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，所述D-扁桃酸脫氫酶來源於Iihodotorula graminis0
26.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，所述的產生苯丙酮酸的菌株或重組菌株 體內具有L-苯丙氨酸代謝途徑。
27.如權利要求沈所述的方法，其特徵在於，所述的L-苯丙氨酸代謝途徑經過人工改 造，不利於苯丙酮酸積累且不影響菌株存活的代謝支路被部分或全部切斷。
28.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述的不利於苯丙酮酸積累且不影響菌 株存活的代謝支路包括L-色氨酸途徑、L-酪氨酸途徑和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸的反 應途徑。
29.如權利要求22或沈所述的方法，所述的產生苯丙酮酸的菌株或重組菌株為大腸杆 菌。
30.如權利要求四所述的方法，所述的大腸桿菌為tyrBaspC tyrA三突變體菌株或 tyrA, tyrB, aspC, trpE 四突變體菌株。
31.如權利要求30所述的方法，其特徵在於，所述的菌株中MoFfto,PheAfbr過表達。
32.如權利要求22、26、四、30、31任一項所述的方法，其特徵在於，所述菌株或重組菌 株利用葡萄糖發酵。
33.一種用於發酵生產R-扁桃酸的重組菌株，其特徵在於，所述重組菌株產生苯丙酮 酸，且所述重組菌株表達A)催化苯丙酮酸轉變為S-扁桃酸的酶；B)催化扁桃酸轉變為苯乙酮酸的酶；和C)催化苯乙酮酸轉變為R-扁桃酸的酶。
34.如權利要33所述的重組菌株，其特徵在於，所述苯丙酮酸通過重組菌株人工改造 的L-苯丙氨酸途徑代謝獲得。
35.如權利要求34所述的重組菌株，其特徵在於，所述人工改造的L-苯丙氨酸代謝途 徑是指不利於苯丙酮酸積累且不影響菌株存活的代謝支路被部分或全部切斷。
36.如權利要求35所述的重組菌株，其特徵在於，所述的不利於苯丙酮酸積累且不影 響菌株存活的的代謝支路包括L-色氨酸途徑、L-酪氨酸途徑和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸的酶反應途徑。
37.如權利要求33-36任一項所述的重組菌株，其特徵在於，所述的重組菌株為大腸桿菌重組菌株。
38.如權利要求37所述的重組菌株，其特徵在於，所述的大腸桿菌重組菌株為tyrB aspC tyrA三突變體菌株或tyrA，tyrB, aspC, trpE四突變體菌株。
39.如權利要求38所述的方法，其特徵在於，所述的菌株中MoFfto,PheAfbr過表達。
40.一種將S-扁桃酸轉化為R-扁桃酸的方法，其特徵在於，所述方法向S-扁桃酸中依 次加入A)對羥基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脫氫酶催化S-扁桃酸生成苯乙酮 酸；和B)D-扁桃酸脫氫酶或D-扁桃酸還原酶催化苯乙酮酸生成R-扁桃酸。
41.如權利要求40所述的方法，其特徵在於，所述對羥基扁桃酸氧化酶來源於 Streptomyces coelicolor 禾口 Amycolatopsis Orientalis0
42.如權利要求40所述的方法，其特徵在於，所述D-扁桃酸脫氫酶來源於Iihodotorula graminis0
43.一種手性拆分對映消旋體扁桃酸的方法，其特徵在於，向對映消旋體扁桃酸中依次 加入A)對羥基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脫氫酶催化S-扁桃酸生成苯乙酮 酸；和B)D-扁桃酸脫氫酶或D-扁桃酸還原酶催化苯乙酮酸生成R-扁桃酸。
44.如權利要求43所述的方法，其特徵在於，所述對羥基扁桃酸氧化酶來源於 Streptomyces coelicolor 禾口 Amycolatopsis Orientalis0
45.如權利要求43所述的方法，其特徵在於，所述D-扁桃酸脫氫酶來源於 Rhodotorula graminis。
全文摘要
本發明提供了製備S-扁桃酸或R-扁桃酸的方法以及將S-扁桃酸轉化為R-扁桃酸的方法。本發明提供的方法，使用對羥基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶催化苯丙酮酸獲得S-扁桃酸，使用對羥基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脫氫酶和D-扁桃酸脫氫酶或D-扁桃酸還原酶催化S-扁桃酸獲得R-扁桃酸。本發明提供的方法可用於體外製備單一構型的S-扁桃酸或R-扁桃酸，同時將這些酶組合過表達可以發酵葡萄糖獲得S-扁桃酸或R-扁桃酸，還可以用於手性拆分混旋扁桃酸生成R-扁桃酸或將S-扁桃酸轉化為R-扁桃酸。用於發酵培養合成S-扁桃酸或R-扁桃酸時，可實現方法的可持續性並能降低成本，並且方法溫和，對環境和人友好。
文檔編號C12R1/19GK102086462SQ20101057088
公開日2011年6月8日 申請日期2010年12月2日 優先權日2009年12月2日
發明者姜衛紅, 孫周通, 楊晟 申請人:中國科學院上海生命科學研究院