含有巖藻多糖或巖藻多糖水解產物和免疫賦活材料的組合物的製作方法

2023-09-19 06:21:20 2

專利名稱：：含有巖藻多糖或巖藻多糖水解產物和免疫賦活材料的組合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及含有巖藻多糖或巖藻多糖水解產物和免疫賦活材料，可用於以增強免疫力、調節免疫功能等為目的的飲食品、醫藥品、健康食品、功能性食品、化妝品等的組合物。
背景技術：
：免疫賦活材料近年來，在健康食品領域具有免疫賦活作用的材料受到關注，已開發出大量含有這些材料的健康食品。用於因增齡、精神緊張、疾病等而降低的免疫力的恢復等。這種材料中含有如乳酸菌(乳酸球菌、乳酸桿菌)、酵母、真菌類的微生物；香菇、灰樹花、靈芝、阿加利格斯菇等蘑菇類；海藻類；中藥等。乳酸菌在上述免疫賦活材料中，乳酸菌的免疫賦活作用受到關注，對於一部分乳酸菌，己報導其具有增強NK(naturalkiller)活性的作用、改善Thl/Th2平衡的作用等。此外，乳酸菌自古以來就用於飲食，眾所周知其安全性高。因此認為，作為使降低的免疫力恢復的手段，優選乳酸菌。為了提高乳酸菌的免疫賦活作用的效果，使飲食品中的乳酸菌的含量增加即可。但是，如果在飲料等中添加大量的乳酸菌就會出現產生沉澱的問題。正因為此，以前使用乳酸菌的飲食品，幾乎都是醃菜類的固體物、不介意有沉澱的飲食品(例如酸奶、乳飲料)。此外，如酸奶那樣通過發酵來增加乳酸菌時，乳酸菌的數量達到一定量後就不再增加，所以增加飲食品中的乳酸菌含量是有限度的。並且，製作發酵食品時，不僅要考慮功能，還需要考慮發酵的程度、發酵後的香味、發酵後乳酸菌的數量等。因此，要使用乳酸菌開發功能性飲食品、特別是以免疫功能調節為目的的功能性發酵飲食品，必須使用發酵特性良好且免疫功能調節作用良好的乳酸菌。但是，乳酸菌的發酵特性和免疫功能調節作用根本不相關。因此，探索這種乳酸菌並不容易。近年來報導了一些提高乳酸菌等免疫賦活材料的活性的方法。例如有通過混合培養38種乳酸菌、酵母，使免疫賦活作用得到增強的報導(專利文獻1)，通過並用乳酸菌和蘑菇使免疫賦活作用增強的方法(專利文獻2)等報導。巖藻多糖及巖藻多糖水解產物巖藻多糖是藻類中含有的多糖硫酸酯，據報導其有抗血液凝固作用、降低血脂作用(除去血液中的膽固醇、過氧化脂質的作用)、抗腫瘤作用、癌轉移抑制作用、抗愛滋病毒感染作用等各種活性，其中使生物體的免疫功能正常化的作用受到關注，認為作為具有免疫功能調節作用的醫藥品、健康食品的材料行之有效。但是，巖藻多糖是分子量極大的多糖硫酸酯，直接作為飲食品、醫藥品等使用時，存在有關吸收性、抗原性、均一性、抗凝血活性等問題。為了解決這些問題，曾多次進行了從巖藻多糖中獲得低分子化合物的嘗試。例如到目前為止報導了化學合成的含有巖藻糖的低聚糖(非專利文獻1、2及3)，但因為這些物質是通過有機合成反應製備的，所以不優選在食品等中使用。另一方面，也報導了將巖藻多糖水解使巖藻多糖低分子化的方法。例如，專利文獻3中公開了將巖藻多糖進行酸水解的方法，得到的低分子巖藻多糖具有5X103以下的分子量分布。且在專利文獻4中記載了不從外部添加酸使巖藻多糖水解得到低聚糖的方法。此外，專利文獻5報導了通過酶使巖藻多糖水解的方法。專利文獻1日本特開2005-68092專利文獻2日本特開2004-51504專利文獻3日本特開平7-215990專利文獻4日本特開2002-226496專利文獻5日本特開2000-236889非專利文獻lCarbohydrateresearch4，189-195(1967)非專利文獻2Carbohydrateresearch37，75-79(1974)非專利文獻3Carbohydrateresearch41,308-312(1975)
發明內容但是，專利文獻1和2的方法，都是將不溶性材料相互組合的方法，並不能防止沉澱。此外，對於能夠高效提高乳酸菌以外的免疫賦活材料的活性的材料，到目前為止還沒有研究。因此，如果有能夠使免疫賦活材料、乳酸菌的活性協同提高的水溶性材料，不僅能夠開發具有更強功效的免疫功能調節劑、飲食品，而且能夠在維持活性的同時減少免疫賦活材料、乳酸菌的使用量，因此，其結果能夠擴大含有免疫賦活材料、乳酸菌的食品的開發範圍。並且還能夠減輕研究同時具備良好的發酵特性和免疫功能調節作用的乳酸菌的負擔。此外，考慮到食品、醫藥品的用途，該物質必須是安全性高且能夠簡便製造的物質。因此，本發明的目的是，提供通過組合免疫賦活材料，能夠增強這些材料的免疫功能調節作用的物質。這裡所述的免疫功能調節作用，例如並不是如低聚木糖那樣，通過改善腸內細菌群間接地調整免疫功能，而是指幾種巖藻多糖所示的直接使免疫活性細胞活化的作用。本發明的更進一步的目的是，提供在飲食品或醫藥組合物中能夠準確添加有效量的組合物。本發明者發現，通過將巖藻多糖或巖藻多糖的酸水解產物、優選低聚糖和任意的乳酸菌、免疫賦活材料組合，這些物質的免疫功能調節或免疫賦活活性得到協同增強，從而完成了本發明。在本發明中，將來自巖藻多糖的這些低聚糖稱為巖藻多糖低聚糖。本發明涉及(1)組合物，其含有巖藻多糖或巖藻多糖水解產物和免疫賦活材料。(2)如(1)所述的組合物，其中，水解產物是使巖藻多糖在0.16.0N的酸中，在2510(TC下水解0.252.5小時後得到的產物。(3)如(2)所述的組合物，其中，水解產物是使巖藻多糖在0.54.0N的酸中，在309(TC下水解0.52.0小時後得到的產物。(4)如(1)(3)中任一項所述的組合物，其中，水解在鹽酸或硫酸中進行。(5)如(1)(4)中任一項所述的組合物，其中，水解產物是低聚糖。(6)如(5)所述的組合物，其中，低聚糖是從由巖藻糖、硫酸基巖藻糖、乙醯基巖藻糖、以及葡萄糖醛酸組成的組中選擇的至少一種糖所構成的二糖到五糖的低聚糖。(7)如(6)所述的組合物，其中，作為低聚糖，含有從下述結構式(I)、(n)、(ni)、(iv)、(v)、(vi)、(vm、(vi)、(ix)、(x)以及(xi)所示的化合物中選擇的至少一種。(分子量390)formulaseeoriginaldocumentpage11(I)(分子量340)(分子量486)formulaseeoriginaldocumentpage1120COOH(分子量420)OH(V)(分子量566)formulaseeoriginaldocumentpage13(分子量850)formulaseeoriginaldocumentpage14(分子量858)formulaseeoriginaldocumentpage14(分子量900)(8)如(1)(7)中任一項所述的組合物，其中，所述免疫賦活材料是從乳酸菌(乳酸球菌和乳酸桿菌)、酵母、真菌類的微生物；香菇、灰樹花、靈芝、阿加利格斯菇等蘑菇類；含有CpG基序的免疫原性寡聚脫氧核苷酸(CpG-0DN)、聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(PolyI:C)類的來自核酸的物質；脂多糖(LPS)、P—葡聚糖；海藻類；中藥；腿46癌抗原類抗癌疫苗；刀豆蛋白A(ConA);Krestin(註冊商標)、0K-342(Picibanil、註冊商標)、Lentinan(註冊商標)的B脂(生物反應修飾劑)中選擇的至少一種。(9)如(8)所述的組合物，其中，所述免疫賦活材料是乳酸菌。(10)免疫功能調節劑，其含有(1)(9)中任一項所述的組合物。(11)飲食品，其中添加有(1)(9)中任一項所述的組合物。(12)飲食品，其中含有(1)(9)中任一項所述的組合物，並附帶具有免疫功能調節作用的內容的標示。(13)醫藥組合物，其含有(1)(9)中任一項所述的組合物。以及(14)化妝品，其含有(1)(9)中任一項所述的組合物。本發明的巖藻多糖或其水解產物和免疫賦活材料的組合物，與單獨使用這些物質時相比較，具有協同增強的免疫功能調節或免疫賦活作用。因此，能夠開發出比以往的使用免疫賦活材料的飲食品、醫藥品更有效的產品。並且，因為高效，所以能夠減少免疫賦活材料在飲食品、醫藥品、化妝品中的添加量。這些優點在將乳酸菌用作免疫賦活材料時特別重要。例如，對於水溶性低的乳酸菌來說，如果能夠減少其添加量，就可防止其沉澱。並且也可省略篩選同時具備免疫賦活活性和良好發酵特性的乳酸菌的過程。結果能夠有利地推進含有乳酸菌的產品的開發。另外，作為本發明組合物的構成要素的巖藻多糖或其水解產物，因為是從食品材料中分離的，所以作用溫和，安全性極高。因此，本發明的組合物非常有效，其應用範圍不僅適用飲食品，也可適用於醫藥品和化妝品o此外，作為低聚糖，通過使用含有從上述結構式(i)、(n)、(m)、(iv)、(V)、(VI)、(W)、(VID)、(K)、(X)以及(XI)所示的化合物中選擇的至少一種的低聚糖，能夠簡便且正確地進行質量管理。此外，因為這些來自巖藻多糖的低聚糖是低分子，容易處理且可簡便製造，又因為其安全性高，所以將這些低聚糖和免疫賦活材料組合的組合物，可用於飲食品、醫藥品等各種用途。圖1是表示從日本衝繩海蘊中通過熱水提取得到的巖藻多糖的糖組成分析的HPLC圖譜。圖2A表示水解巖藻多糖時使用的酸濃度對免疫賦活活性的影響。圖2B表示水解巖藻多糖時使用的酸濃度對免疫賦活活性的影響。圖3A表示水解巖藻多糖時反應溫度對免疫賦活活性的影響。圖3B表示水解巖藻多糖時反應溫度對免疫賦活活性的影響。圖4表示水解巖藻多糖時反應時間對免疫賦活活性的影響。圖5表示式(I)表示的分子量為340的巖藻多糖低聚糖的MS光譜。圖6表示式(II)表示的分子量為486的巖藻多糖低聚糖的MS光譜。圖7表示式(I)表示的分子量為340的巖藻多糖低聚糖的^-麗R光譜。圖8表示式(I)表示的分子量為340的巖藻多糖低聚糖的130應R光譜。圖9表示式(II)表示的分子量為486的巖藻多糖低聚糖的'H-麗R光譜。圖10表示式(II)表示的分子量為486的巖藻多糖低聚糖的13C-麗R光譜。圖11表示式(III)表示的分子量為390的巖藻多糖低聚糖的力-歷R光譜。圖12表示式(III)表示的分子量為390的巖藻多糖低聚糖的13C-薩R光譜。圖13表示式(V)表示的分子量為566的巖藻多糖低聚糖的W-麗R光譜。圖14表示式(V)表示的分子量為566的巖藻多糖低聚糖的13C-醒R光譜。圖15表示式(VI)表示的分子量為712的巖藻多糖低聚糖的'H-麗R光譜。圖16表示式(VI)表示的分子量為712的巖藻多糖低聚糖的13C-麗R光譜。圖17表示式(VD)表示的分子量為754的巖藻多糖低聚糖的'H-NMR光譜。圖18表示式(Vn)表示的分子量為754的巖藻多糖低聚糖的13C-醒R光譜。圖19表示式(VI)表示的分子量為808的巖藻多糖低聚糖的^-麗R光譜。圖20表示式(V1II)表示的分子量為808的巖藻多糖低聚糖的13C-麗R光譜。圖21表示式(IX)表示的分子量為850的巖藻多糖低聚糖的麗R光譜。圖22表示式(DO表示的分子量為850的巖藻多糖低聚糖的13C-麗R光譜。圖23表示使式(VI])表示的分子量為754的巖藻多糖低聚糖再生後的麗R光譜。圖24表示使式(VH)表示的分子量為754的巖藻多糖低聚糖再生後的TOF-MS光譜。圖25表示使式(VE)表示的分子量為754的巖藻多糖低聚糖再生後的ESI-MS/MS光譜。圖26表示式(W)表示的分子量為420的巖藻多糖低聚糖的FAB-MS光譜。圖27表示式(IV)表示的分子量為420的巖藻多糖低聚糖的MS/MS光譜。圖28表示式(X)表示的分子量為858和式(XI)表示的分子量900的巖藻多糖低聚糖的FAB-MS光譜。圖29表示式(X)表示的分子量為858的巖藻多糖低聚糖的FAB-MS/MS光譜。圖30表示式(XI)表示的分子量為900的巖藻多糖低聚糖的FAB-MS/MS光譜。圖31表示水解日本衝繩海蘊後，用ABEE螢光標記的ESI-MS圖譜。圖32A表示並用式(I)表示的巖藻多糖低聚糖和乳酸菌可協同提高脾細胞的IFN-Y誘導效果。圖32B表示並用式(II)表示的巖藻多糖低聚糖和乳酸菌可協同提高脾細胞的IFN-Y誘導效果圖33表示並用巖藻多糖低聚糖混合物和乳酸菌可協同提高脾細胞的IFN-Y誘導效果。圖34表示並用巖藻多糖低聚糖和乳酸菌可協同提高樹突狀細胞的IL-12誘導效果。圖35表示並用巖藻多糖低聚糖和乳酸菌可協同提高樹突狀細胞的IL-IO誘導效果。圖36表示並用巖藻多糖低聚糖和乳酸菌可協同提高CTL活性。圖37表示利用幾乎無活性的乳酸菌和巖藻多糖水解產物使IL-12的產生協同增強。圖38表示利用乳酸菌以外的免疫賦活劑和巖藻多糖水解產物使IFN-Y的產生協同增強。圖39表示通過體內(invivo)證明乳酸菌和巖藻多糖水解產物協同增強NK活性。圖40表示並用巖藻多糖和乳酸菌可協同提高脾細胞的IFN-Y誘導效果。具體實施方式免疫賦活材料免疫賦活材料，是指具有增強動物的免疫應答能力的作用的材料，也稱為免疫強化材料。本發明中使用的免疫賦活材料沒有特別限定，包括乳酸菌(乳酸球菌、乳酸桿菌)、酵母、真菌類的微生物；香菇、灰樹花、靈芝、阿加利格斯菇等蘑菇類；含有CpG基序的免疫原性寡聚脫氧核苷酸(CpG-0DN)、聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(PolyI:C)類的來自核酸的物質；脂多糖(LPS);海藻類；中藥；癌疫苗(例如麗46癌抗原)，刀豆蛋白A(ConA)，Krestin(註冊商標)、0K-432(Picibanil、註冊商標)、Lentinan(註冊商標)等BRM(生物反應修飾劑)等公知的免疫賦活劑。CpG-0DN是含有非甲基化胞嘧啶一鳥嘌呤二核苷酸(CpG)的(短)寡聚脫氧核苷酸(0DN)，含有這樣的CpG基序的CpG-ODN，能夠使抗原提呈細胞直接活化。其結果，用CpG-ODN使NK細胞等活化，促進誘發Thl型應答和產生細胞毒性T細胞(日本特表2004-519453)。PolyI:C是含有肌苷酸和胞嘧啶核苷酸的多聚核苷酸共聚物，也稱為聚肌苷酸聚胞嘧啶核苷酸。已知其在靈長類中具有提高干擾素在體液中的濃度的作用。已知脂多糖是誘導自然免疫體系的誘因物質。醒46是乳癌或腫瘤的一種，匿46癌抗原等抗癌疫苗，因為攻擊癌細胞而使免疫功能賦活，所以用於癌的預防、治療。ConA是來自刀豆種子的植物凝血素，已知其具有各種免疫賦活作用。BRM是在癌症治療中通過增強、調節宿主的免疫功能等，修飾腫瘤和宿主的相互關係，得到治療效果的藥劑、治療方法。在這種藥劑中包括0K-432、Krestin(註冊商標)、Lentinan(註冊商標)等。OK-432是含有作為主成分的化膿性鏈球菌(str印tococcuspyogenes)(A群3型)Su株的青黴素處理冷凍乾燥粉末、乾燥菌體的抗惡性腫瘤劑淋巴管腫瘤治療劑。Krestin是，含有作為主成分的從雲芝菌絲體中得到的與蛋白質結合的多糖類的治療癌症使用的藥劑。Lentinan是從香菇中得到的e-l，3—葡聚糖。乳酸菌本發明使用的乳酸菌不限於特定的菌株，優選乳桿菌屬(Lactobacillus),其中優選能夠使植物材料發酵的植物性乳酸菌。更優選普蘭特任菌(Lactobacillusplantarum)或戊糖乳桿菌(Lactobacillusperrtosus)。在本發明中與巖藻多糖或其水解產物組合使用時，乳酸菌可以是活的，也可以是死的。巖藻多糖作為本發明的組合物的原料使用的巖藻多糖，可以為各種結構，也可從任何藻類中獲取。藻類含有包括黑頂藻目(Sphacelariales)、索藻目(Chordariales)、萱藻目(Scytosiphonales)、網管藻目(Dictyosiphonales)、馬鞭藻目(Cutleriales)、毛頭藻目(Sporochnales)、網地藻目(Dictyotales)、海帶目(Laminariales)、墨角藻目(Fucales)的褐藻綱Phaeophyceae的海藻。優選使用來自海蘊、更優選使用來自日本衝繩海蘊的巖藻多糖。巖藻多糖的提取方法從藻類中提取巖藻多糖的方法己進行了各種探討，並己公知(例如，日本特開平10-245334記載的使用水的方法，日本特開平10-195106記載的使用酸的方法，日本特開2002-262788記載的使用鹼性水溶劑的方法等)。在本發明中作為原料使用的巖藻多糖可通過這些公知的方法獲得。在本發明中，例如使用根據以下方法獲得的巖藻多糖。在藻類(例如日本衝繩海蘊)中加入510倍量的蒸餾水，在5010(TC提取數分鐘5小時，優選在609(TC提取0.52.0小時，更優選在809(TC約提取1小時。通過將這樣得到的藻類提取物進行冷卻、吸引過濾、脫鹽及乾燥，能夠容易地得到溶解於水中的巖藻多糖組分。這樣得到的巖藻多糖組分，可以不經過精製在下一道工序中使用，也可以進一步精製後使用。巖藻多糖，優選使用上述從藻類中提取的巖藻多糖，但也能夠以含有在藻類中的狀態使用。將巖藻多糖或含有其的藻類通過以下水解工序，得到巖藻多糖水解產物。巖藻多糖水解產物巖藻多糖水解產物，是指含有通過水解作為多糖硫酸酯的巖藻多糖可得到的單糖和多糖類的糖衍生物及其混合物。巖藻多糖水解產物，優選為多糖類，更優選為含有210個單糖的低聚糖，進一步優選為含有25個單糖的低聚糖。在本發明中，將水解巖藻多糖得到的上述低聚糖也稱為巖藻多糖低聚糖。構成低聚糖的單糖，優選巖藻糖、硫酸基巖藻糖、乙醯基巖藻糖及/或葡萄糖醛酸。特別優選低聚糖為上述式(I)oa)的化合物。巖藻多糖水解產物如下述方法製造。巖藻多糖水解產物的製造(1)巖藻多糖的水解作為本發明的構成要素的巖藻多糖水解產物，如專利文獻35所述，可通過使用酸、酶的方法水解巖藻多糖而得到。進行酸水解時，可使用鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸等無機酸，也可使用醋酸、檸檬酸、草酸、琥珀酸、甲酸、丙酸等有機酸。優選酸為鹽酸和硫酸。優選使用以下的酸水解條件。即將含有上述從藻類中得到的巖藻多糖的組分或巖藻多糖，使用酸、優選鹽酸，在含有0.16.0N、優選0.54.0N、進一步優選0.52.ON的鹽酸的25100°C、優選309(TC、更優選508(TC的水性溶劑中，進行0.13小時、優選0.252.5小時、更優選0.52.0小時水解。將得到的反應物用鹼例如約1N的NaOH中和後，通過用電滲析或凝膠過濾等適當的手段脫鹽、乾燥(例如冷凍乾燥)，能夠得到含有巖藻多糖低聚糖混合物的水解產物。上述得到的水解產物可以直接作為巖藻多糖水解產物使用，也可通過精製使其活性提高。(2)水解產物的精製和低聚糖的分離巖藻多糖水解產物的精製，可以單獨或並用色譜法、重結晶、滲析、乙醇沉澱等方法。例如按照以下操作進行精製。首先，將含有低聚糖混合物的巖藻多糖水解產物提供給使用陰離子交換樹脂的色譜法，分離出不被吸附而通過的含有不含硫酸基的低聚糖組分(中性，酸性糖組分)、和含有被酸性洗脫液洗脫的含有大量硫酸基的低聚糖的組分(硫酸化糖組分)。在本發明中，優選將上述得到的各組分作為巖藻多糖水解產物使用，也可如下所述，使用進一歩精製分離的低聚糖。使中性*酸性糖組分進一步通過凝膠過濾，能夠得到式(I)表示的二糖和式(II)表示的三糖。另一方面，將硫酸化糖組分提供給色譜法，能夠分離出硫酸化低聚糖(in)、(w)、(v)、(w)、(vn)、(vii)、(ix)、(x)或(xi)各成分。各低聚糖，為了更容易地進行精製、結構分析，可將其適當標記或形成衍生物。例如，低聚糖可用4-氨基苯甲酸乙酯(ABEE)類的試劑進行螢光標記，這樣就使低聚糖的檢測變得容易。將被標記的各低聚糖分離後，除去標記的部分，能夠得到純淨的低聚糖。巖藻多糖或其水解產物和免疫賦活材料的組合本發明是含有上述得到的巖藻多糖或其水解產物和免疫賦活材料的組合的組合物。通過這樣的組合，巖藻多糖或其水解產物和免疫賦活材料的免疫功能調節作用及/或免疫賦活作用得到協同增強。在該組合物中，也可將一種巖藻多糖低聚糖作為巖藻多糖水解產物和免疫賦活材料(例如乳酸菌)組合使用。此外，也可使用多種如3種或3種以上的巖藻多糖低聚糖和免疫賦活材料組合。將乳酸菌用於本發明的組合中時，可以使用活的，也可以使用死的乳酸菌。與此相對，如低聚木糖是作為益生菌而被公知的低聚糖，主要是通過促進乳酸菌的增殖來增強免疫功能調節作用。本發明的水解產物也可增強死菌的免疫調節作用，這一點比以往作為益生菌使用的低聚糖良好。使用的巖藻多糖或其水解產物相對於免疫賦活材料的優選比率為，重量比1:110000:1，更優選250:11000:1。此外，本發明還包括通過組合使用巖藻多糖或其水解產物和免疫賦活材料，協同增強這些物質的免疫功能調節及/或免疫賦活作用的方法。將本發明的組合用於例如飲食品、醫藥品及化妝品等中，能夠使其具有免疫功能調節作用。免疫功能調節劑本說明書中的免疫功能調作用，是指使生物體內降低的免疫反應提高及/或抑制亢進的免疫反應的作用。因此，其作用包括免疫賦活作用和免疫抑制作用。本說明書中的免疫功能調節作用，可用該
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公知的方法測定。例如可將誘導具有免疫功能調節作用的細胞因子的作用作為指標測定。該目的使用的細胞因子包含幹擾素-Y，白介素-10、12等。此外，免疫功能調節作用，也可將與免疫應答相關的樹突狀細胞的成熟化、細胞毒性T細胞(CTL)的活性作為指標測定。本發明的免疫功能調節劑可用來增進健康，但對腫瘤、癌轉移、病毒性疾病(例如感冒、愛滋病、病毒性肝炎)、過敏性疾病(例如花粉症、過敏性鼻炎、遺傳性過敏症、哮喘)、自身免疫疾病(例如風溼性關節炎)、炎症性疾病、糖尿病類疾病或狀態有效。含有巖藻多糖或其水解產物和免疫賦活材料的食品添加劑及飲食品將本發明的巖藻多糖或其水解產物和免疫賦活材料的組合物用於飲食品時，優選製成含有該組合物且具有免疫功能調節作用的食品添加劑和飲食品，以及添加有該組合物且具有免疫功能調節作用的健康食品。將這些物質和公知的甜味料、酸味料、維生素等各種成分混合，能夠製成符合客戶嗜好的產品。飲食品，例如能夠以片劑、膠囊劑、清涼飲料、茶飲料、健康飲料、酸奶、乳酸菌飲料等乳製品，調味料，加工食品，餐後甜點類，點心(例如口香糖、糖果、果凍)等的形態提供。本發明的飲食品還包括在容器、說明書上附帶具有免疫功能調節作用內容的標示的功能性食品(包括特定保健用食品、附加條件的特定保健用食品)。標示位置可以為容器或添付的說明書等，但並不限於此。容器包括瓶、罐、聚酯瓶、塑料瓶、紙袋等，但並不限於此。此外，標示的方法包括印刷、刻印、貼紙等，但並不限於此。此外，飲食品也可以為作為寵物的餌食而加工的寵物食品、動物飼料等。含有巖藻多糖或其水解產物和免疫賦活材料的組合物的醫藥組合物將本發明的組合物作為醫藥品使用時，例如，可作為免疫功能調節劑、免疫賦活劑、抗過敏劑以及免疫抑制劑使用。因此，在一種方式中，本發明是含有巖藻多糖或其水解產物和免疫賦活材料且具有免疫功能調節作用、免疫賦活作用、抗過敏作用及/或免疫抑制作用的醫藥組合物。醫藥組合物，可以在主藥中使用稀釋劑、載體、賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、矯味矯臭劑、助溶劑、懸浮劑、包衣衣料等醫藥製劑
技術領域：
通常使用的公知的輔助劑進行製劑化。劑型可以為片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液劑、糖漿劑、栓劑、乳膏劑、軟膏劑、乳劑、巴布劑、注射劑等，無特別限定。本醫藥品的給藥途徑，例如可以為口服給藥、直腸給藥、胃腸道給藥等，無特別限定。含有巖藻多糖或其水解產物和免疫賦活材料的組合物的化妝品通過使用本發明的組合物，能夠製造具有免疫功能調節作用的化妝品。含有本發明的組合物的化妝品，例如為面部用、皮膚用、頭髮用的乳膏、化妝水、凝膠、摩絲、洗髮液、護髮素等。與其他成分的並用含有本發明的組合物的組合物，在飲食品、醫藥組合物以及化妝品中可以單獨使用，優選與其他的具有免疫功能調節作用或免疫賦活作用的食品材料或物質並用。作為這種食品材料或物質，可以為乳酸菌、香菇、巖藻多糖等。本發明的飲食品或組合物中，除這些活性成分以外，根據具體的形態，可以配合一般的成分如載體、稀釋劑、賦形劑、或添加劑等成分。這裡作為稀釋劑、載體、賦形劑，只要不影響巖藻多糖或其水解產物以及免疫賦活材料的生理活性，無特別限定。例如可以為蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、海藻糖、乳糖、澱粉、糖稀、異性化液糖等糖類，乙醇、丙醇、甘油等醇類，山梨糖醇、甘露醇、赤蘚醇、拉克替醇、木糖醇、麥芽糖醇、還原性異麥芽酮糖、還原性澱粉分解物等糖醇類，三乙酸甘油酯等溶劑，阿拉伯膠、卡拉膠、黃原膠、瓜爾膠、結冷膠、果膠等多糖類或水。此外，作為添加劑，可以為鰲合劑等助劑、香料、香辛料提取物、防腐劑等。只要不損壞本發明的效果，可以配合稀釋劑、載體、添加劑等。飲食品、醫藥組合物及化妝品中的巖藻多糖或其水解物和免疫賦活材料的配合量，根據與選擇的其他配合成分的關係等進行適當選擇，無特別限定。但是，通常的巖藻多糖或其水解產物和免疫賦活材料的合計量，在飲料或食品中、醫藥組合物中添加時，相對於個體體重60kg，為0.01g10g/日、優選0.05glg/日、特別優選0.05g0.5g/日。在化妝品中，使用0.0120重量％，優選0.0515重量％。本發明的巖藻多糖或其水解產物和低聚糖，可將其提取精製品、合成製品單獨用於飲食品、醫藥組合物或化妝品。本發明並不限於上述各實施方式，在權利要求書所示的範圍內可做各種變更，將不同的實施方式中分別公開的技術手段適當組合得到的實施方式也包括在本發明的技術範圍內。實施例以下根據實施例對本發明進行具體說明，但本發明的範圍並不限於這些實施例中。在以下實施例中，如果沒有特別明確記載，均使用ECA-600型核磁共振裝置(日本電子株式會社)進行麗R分析。使用重水(D20)作為測定溶劑。組成糖的結合方式用2D-N服分析。實施例1巖藻多糖組分的製備在日本衝繩海蘊藻體100g中加蒸餾水1000ml，IO(TC提取1小時。將得到的提取物冷卻後，進行抽濾、電滲析(脫鹽)並冷凍乾燥，得到巖藻多糖組分2g。使該巖藻多糖在含有2NH2S04的10(TC的水溶液中水解1小時，得到的水溶液用2NNaOH中和，通過用ABEE螢光標記，製備分析單糖用樣品。確認該組成糖的組成為，SFuc(硫酸基巖藻糖)GlcA(葡萄糖醛酸)Fuc(巖藻糖)Xyl(木糖)=49.3:4.9:12.1:1(圖1)。色譜柱CosmosilC18AR—II(4.6mm4>X250mm)流動相含有10%乙腈的0.2M硼酸鉀緩衝液流速LOml/分溫度45°C檢測螢光檢測器(株式會社島津製作所)、Ex:305nm、Em:360nm。實施例2巖藻多糖水解產物的製造和免疫功能調節作用的測定在下述各種條件下得到巖藻多糖水解產物，使用這些水解產物和乳酸菌的組合物，探討免疫功能調節作用。水解的酸濃度對免疫功能調節活性的影響使實施例l得到的巖藻多糖在O.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0N的HC1(80°C)中水解1小時，然後分別向其中添加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.ON的NaOH中和後，經過用電滲析脫鹽、冷凍乾燥，得到巖藻多糖水解產物。將該水解產物以100ug/ml的濃度添加到從C57BL/6小鼠(8周齡、雄性、日本CharlesRiver株式會社)中分離的脾細胞(5X106cells/ml)中。30分鐘後添加0.1Ug/ml的乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP_10028)，培養24小時，回收培養上清，IFN-y的產生量用ELISA試劑盒(0ptEIA、BDPharmingen)測定(圖2A)。此外，為了探討巖藻多糖水解產物的單獨效果，不用乳酸菌進行上述同樣的操作(白色柱形圖)。作為比較對照，使用不添加任何物質的樣品(白色柱形圖中的"none")、僅添加乳酸菌的樣品(黑色柱形圖中的"none")。其結果是，使水解得到的產物和乳酸菌並用後，與單獨使用得到的結果相比較，IFN-y的產生得到協同增強。該協同效果通過在0.54.0N的HC1中水解得到的產物得到證明。此外，僅使用水解前的巖藻多糖進行上述實驗，與其他樣品比較效果(圖2B)。其結果證明，在0.54.0N的HC1中水解得到的水解產物(圖2B、白色柱形圖)僅顯示與水解前的巖藻多糖(圖2B"巖藻多糖")同等程度的活性，但加入乳酸菌後(圖2B、黑色柱形圖)，顯示高於巖藻多糖得到的活性。反應溫度的影響將巖藻多糖在25、30、40、50、60、70、80、90、100°C的1NHC1中水解l小時，其後添加lNNaOH中和後，經過用電滲析脫鹽、冷凍乾燥，得到巖藻多糖水解產物。將該水解產物以100ug/ml的濃度添加到從C57BL/6小鼠(8周齡、雄性、日本CharlesRiver株式會社)中分離的脾細胞(5X10scells/ml)內。30分鐘後添加0.lug/ml的乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP-10028)，培養24小時，回收培養上清，IFN-y的產生量用ELISA試劑盒(OptEIA、BDPharmingen)測定(圖3A)。此外，為了探討巖藻多糖水解產物的單獨效果，不用乳酸菌進行上述同樣的操作(白色柱形圖)。作為比較對照，使用不添加任何物質的樣品(白色柱形圖中的none)、僅添加乳酸菌的樣品(黑色柱形圖中的none)。其結果證明，通過並用在HC1中水解得到的巖藻多糖水解產物和乳酸菌，與單獨使用時的結果相比，IFN-y的產生得到協同增強。該協同效果通過在2510(TC水解得到的全部產物得到證明，特別是在3090°C(優選508(TC)水解時效果良好。此外，僅使用水解前的巖藻多糖進行上述實驗，比較該效果和本發明的效果。其結果證明，使在5010(TC的HC1中水解得到的產物和乳酸菌並用後，顯示出比水解前的巖藻多糖的同等程度高的活性(圖3B)。反應時間的影響使巖藻多糖在1N的HC1(80°C)中水解30、60、120分鐘，然後添加1NNaOH中和後，經過用電滲析脫鹽、冷凍乾燥，得到巖藻多糖水解產物。將該水解產物以100yg/ml的濃度添加到從C57BL/6小鼠(8周齡、雄性、日本CharlesRiver株式會社)中分離的脾細胞(5X1(fcells/ml)內。30分鐘後添加0.1yg/ml的乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP-10028),培養24小時，回收培養上清，IFN-y的產生量用ELISA試劑盒(OptEIA、BDPharmingen)測定(圖4)。此外，為了探討巖藻多糖水解產物的單獨效果，不用乳酸菌進行上述同樣的操作。作為比較對照，使用不添加任何物質的樣品、僅添加乳酸菌的樣品。其結果證明，通過並用水解30120分鐘後得到的全部產物和乳酸菌，與單獨得到的結果相比，IFN-y的產生得到協同增強。因此證明，巖藻多糖水解產物通過和乳酸菌並用，具有協同增強的免疫功能調節或免疫賦活作用。實施例3精製的巖藻多糖水解產物的免疫功能調節作用將100ral的2NHC1加入到巖藻多糖lg中，8CTC酸水解1小時。接著用1NNaOH中和。使得到的反應液通過凝膠過濾(生物凝膠P-6(Bio-Rad))進行脫鹽，進行冷凍千燥後得到含有巖藻多糖低聚糖混合物的組分(低聚糖組分)，將得到的巖藻多糖低聚糖混合物，提供給使用用甲酸活化的陰離子交換樹脂(日本東曹株式會社(TosohCorporation))的色譜法。其結果，低聚糖組分被分離為含有用水洗脫得到的不含硫酸基的低聚糖的組分(Fr.B)，和含有用2NHC1洗脫得到的含有大量硫酸基的低聚糖的組分(硫酸化糖組分)。使硫酸化糖組分通過凝膠過濾(生物凝膠P-6)，分為分子量小於500的Fr.A和500以上的Fr.C。將上述精製的巖藻多糖水解產物的各組分分別以100yg/ml的濃度，添加到從C57BL/6小鼠(8周齡、雄性、日本CharlesRiver株式會社)中分離的脾細胞(5X106cells/ml)內。30分鐘後添加0.1yg/ml的乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP-10028)，培養24小時，回收培養上清，IFN-Y的產生量用ELISA試劑盒(OptEIA、BDPharmingen)測定(表l)。其結果是，對於巖藻多糖來說，濃度低時表現有活性，但其濃度增高后活性消失。另一方面，對於全部的水解產物(低聚糖各組分、Fr.AC、硫酸化糖各組分)來說，隨著濃度的增加免疫賦活能力提高，並且要比巖藻多糖的活性強。特別是，證明低聚糖經過精製後活性增強。作為比較對照使用的單糖(巖藻糖、硫酸基巖藻糖)、作為益生菌被廣泛使用的低聚木糖無上述作用。[表1]+0.1〃g/mI乳酸菌31030100Til)巖藻多糖9.810.25.2n.d.巖藻糖1.21.9—2.9硫酸基巖藻糖1.30.5一n.d.低聚糖組分n.d.n.d.5.59.6Fr.A10.517.221.215.8Fr.B4.66.711.021.2Fr.C5.011.519.321.0硫酸化糖組分0.019.8一21.3低聚木糖n.dn.d.一n.d乳酸菌00.1g/mln.d.n.d.實施例4巖藻多糖低聚糖的製造a)巖藻多糖的水解及低聚糖混合物的分離在實施例1得到的巖藻多糖組分lg中加入100ml的2NHCl，在50100°C酸水解1小時，接著用INNaOH中和。將得到的反應液通過凝膠過濾(生物凝膠P-6(Bio-Rad))進行脫鹽，進行冷凍乾燥後得到895mg巖藻多糖低聚糖混合物。將得到的巖藻多糖低聚糖混合物，提供給使用用甲酸活化的陰離子交換樹脂(日本東曹株式會社)的色譜法。其結果，低聚糖混合物被分離為含有用水洗脫得到的不含硫酸基的低聚糖的組分(中性*酸性糖組分)280mg，和含有用2NHC1洗脫得到的含有大量硫酸基的低聚糖的組分(硫酸化糖組分)425mg。b)化合物(I)和(II)的分離將a)得到的中性'酸性糖組分100mg通過凝膠過濾(生物凝膠P-4(Bio-Rad)、洗脫溶劑0.2M硼酸鉀(K2BA)水溶液)，從該組分中分離出分子量為340的二糖和分子量為486的三糖(化合物I、II:圖5、6)。這些分子量通過FAB-MS求出(化合物(I)[M-H]—:339.2、化合物(II)[M-H]—:485.0)。在5mg這些化合物中加入水lml、ABEE(4—氨基苯甲酸乙酯)1.6g、NaBH3CN(氰基硼氫化鈉)350mg、甲醇3.5ml、乙酸410ul，65。C攪拌4小時。通過使反應液在三氯甲烷和水中分配得到螢光標記的上述二糖和三糖約79mg。對這些標記的低聚糖測定的薩R及13C-NMR圖譜如圖710所示，其分析結果如表2、3所示。由這些結果可知，得到的分子量為340的二糖是用式(I)表示的a一D—GlcA—(1—2)—L一Fuc，分子量為486的三糖是用式(II)表示的a—D一GlcA—(1—2)—a—L—Fuc—(1—3)—L一Fuc。[表2]表2:螢光標記的化合物(i)的力-nmr和13c-mr分析結果tableseeoriginaldocumentpage29[表3]表3:螢光標記的化合物(II)的'H-MR和"C-MR分析結果tableseeoriginaldocumentpage30c)化合物an)(xi)的製造使硫酸化糖組分通過凝膠過濾(生物凝膠P-6(Bio-Rad))進行脫鹽。在得到的硫酸化糖組分lOOmg中，加入水lml、ABEE(4—氨基苯甲酸乙酯)1.6g、NaBH3CN(氰基硼氫化鈉)350mg、甲醇3.5ml、乙酸410ul，65。C攪拌4小時。將得到的產物在真空下乾燥，在水和三氯甲垸中分配，將水層通過用反相柱(載體Lichropr印RP-8(25—40tim)(Merck)、小IOX220mm;溶劑條件5%CH3CN/0.1%TFA(100ml)、8%CH3CN/0.1%TFA(100ml)、15fl/。CH3CN/0.P/oTFA(lOOml)、20%CH3CN/0.1%TFA(100ml))處理，得到螢光標記的低聚糖混合物。將得到的螢光標記化合物利用HPLC(色譜柱cosmosil5C18—AR—II、4>10.OX250mm;溶劑條件:12.5%CH3CN/0.1%TFA(5分鐘)、12.5-27.5%CH3CN/0.1%TFA(50分鐘)；流速3ml/分鐘)，用乙腈0.1%TFA水溶液以530%的濃度梯度洗脫，從混合物中分離出分子量為539、715、861、903、957、999的具有硫酸基的6個標記的巖藻多糖低聚糖(分子量用ESI—MS確定)。對得到的標記低聚糖測定麗R光譜，分析其結果。標記的低聚糖的力-NMR和13C-NMR的圖譜如圖1122所示，其分析結果如表47所示。根據上述結果，證明分子量539、715、861、903、957、999的化合物，分別是化合物(III)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)的標記體。為了確認，將各低聚糖上結合的ABEE除去，得到再生的低聚糖的純品。艮口、在所述分離的各標記低聚糖10mg(100nl)中，加入過氧化氫、乙酸各10ul，放置一晝夜後，乾燥固化。在這樣得到的再生低聚糖中，從分子量903的化合物中得到的化合物通過'H-麗R(圖23)、T0F—MS(裝置VoyagerDE-STR(AppliedBiosystems)、Ionmode:negative、Modeofoperation:reflector、Acceleratingvoltage:20kV、Matrix:2，5-dihydroxybenzoicacid)(圖24)、ESI—MS/MS(圖25)分析，結果表明的確是式(VII)的結構。此外，對於無法用上述方法分離的分子量420、858、900的化合物(分別為(IV)、(X)、(XI))，通過將反應混合物用FAB-MS/MS(裝置HXU0A/HX110A(JEOL)、Ionmode:MS,MS/MS(negative)、Xeatombeam:5kV、Ionsourceacceleratingpotential:10kV、Collisionenergy:2keV、Matrix:Glycerol),以及ESI—MS—MS分析，確認其存在。圖26表示(IV)的FAB-MS圖譜，圖27表示MS/MS圖譜。此外，圖28表示(X)和(XI)的FAB-MS圖譜，圖29、30分別表示各MS/MS圖譜。根據上述結果可知，分子量為390的二糖是化學式(III)表示的a—L一Fuc—4一0—S0「一(1—3)—L一Fuc，分子量為420的二糖是化學式(IV)表示的a—D—GlcA-(1—2)—L一Fuc，分子量為566的三糖是化學式(V)表示的a—L—Fuc—4一0—S(V—(1—3)—[a—D_GlcA—(1—2)]—L—Fuc，分子量為712的四糖是化學式(VI)表示的a—L一Fuc—4一0—S(V—(1—3)—[a—D—GlcA—(1—2)]_a—L一Fuc—(1—3)—L—Fuc，分子量為754的四糖是化學式(VII)表示的a—L一Fuc—4—0—S0「一(1—3)—[a—D一GlcA—(1—2)]—a—L—Fuc—4—0—乙醯一(1—3)—L—Fuc，分子量為808的5糖是化學式(VIII)表示的[a—D—GlcA—(1—2)—a—L一Fuc—(1—3)]—[a—D—GlcA—(1—2)]—a—L—Fuc—(1—3)—L—Fuc，分子量為850的5糖是化學式(IX)表示的[a—D—GlcA—(1—2)—a—L一Fuc—(1—3)]—[a—D—GlcA—(1—2)]—4—0—乙醯一a—L一Fuc—(1—3)一L一Fuc，分子量為858的5糖是化學式(X)表示的a—L一Fuc—4一0—S0「一(1—3)—a—L一Fuc—(1—3)—[a—D—GlcA—(1—2)]—a—L一Fuc一(1—3)—L一Fuc，分子量為900的5糖是化學式(XI)表示的a—L一Fuc—4—0—S(V—(1—3)—a—L—Fuc—(1—3)—[a—D—GlcA—(1—2)]一a—L一Fuc—4—0—乙醯一(1—3)—L—Fuc。[表4]表4:螢光標記的化合物(III)的力-NMR和"C-NMR分析結果Position1-NMR(l),O)-N，(U:!0)ABEE-l]〗7.3_2，6131.8ir、115—.9「二414S).2H一O108.f)4331(2H,u,/=7.2llz)SI1i-343(311t,/=7.1Hz)Fuc-i((:h」、、.17.8-1、(W.7-3、cr一1onn:7S.4-4:l709(1H,dd,乂—-6.2,'丄)'■llz)力.4.(111,dq'/=12.,3.1Hz)(;(;.!—一二[H,1—194(3H,〔1,/=(i.4liz)IK-7SFuc-1;J.081(IH.cl,/=9Hz)-2;182;idd,./=U).8,4.i僅)-3工;II、。:68.6」+sa「1，■，;、肌3—一;l:〗.歸(1H,q,/:(i.3llz)-C1L1.(J8i(3h,d，/=6.tiH'/.)15.9'表5:螢光標記的化合物(V)的W-NMR和W-NMR分析結果Position'H-順(謂"C-NMR(D.力)(5一ABEE-1畫畫1!7.8-2.67.794(飢d，/=8.5Hz>13U-3,56.699(2H,d，/=8,2H幻112.4-4—-oo-169.44.257(mq，p7.1則61.81.加(組t,/二Y.1Hz)13.7Fuc-1(CH2)3.595(1H,dd'/:14.8'4.7Hz)3.557(mt,/二3.5Hz)-43.6-24.076-4-G55UH'm)77.0_33.860(m,d，/=8.7Hz)77.3-43.729(1h,d,/=8.5Hz)73.2_54109(ih,q，/=6.5起65.61.173(3H,d,/=6.4Hz)1S.6G!cA-J5.川(m,d,/=3.4Hz)98.5-23.556-3.526(1H，m)70.9_33.644(1H,t,/二9.2Hz)72.6—43.柳(l比t,/UHz)-54.l化UH,d,_/=Hz)71.2-C00H-17U5.036UH,d'_/=3.7Hz)跳6-23.768(1H,dd,/=10.8.3.7Hz)68.2-33.843t,/=5.bHz)能64.371m)肌3_53,911uh'q,/=6.4Hz)66.91.038(犯，d,/=6.4Hz)15.8[表6]表6:螢光標記的化合物(VI)的111-NMR和"C-NMR分析結果tableseeoriginaldocumentpage34[表7]表7:螢光標記的化合物(\U)的'H-NMR和"C-NMR分析結果tableseeoriginaldocumentpage35實施例5在日本衝繩海蘊藻體100g中加入1000ml的2NHC1，在50100。C酸水解1小時。將得到的提取物冷卻後，進行抽濾、電滲析(脫鹽)並冷凍乾燥，得到2g巖藻多糖組分。將得到的巖藻多糖組分用ABEE螢光標記後通過ESI—MS(4000QTRAPLC/MS/MS體系(A卯liedBiosystems)分析條件Polarity:Negativeionmode;DeclusteringPotential:-50v;Collisionenergy:-10eV;Temperature:550°C)分析的結果，得到圖31所示的圖譜，確認式(I)(XI)所示的巖藻多糖低聚糖存在。實施例6巖藻多糖低聚糖化合物和乳酸菌組合的協同效果對小鼠脾細胞的IFN-y誘導作用在與實施例3同樣製備的脾細胞5X106Cells/ml中，使分子量為340的巖藻多糖低聚糖(化合物(I))為衡g/ml，添加到培養孔(well)內。作為比較對照使用等量的巖藻糖和硫酸基巖藻糖(匿分別為164、244)、低聚木糖(X0S)。30分鐘後，分別在各培養孔中添加乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP-10028)(死菌)0.lyg/ml。培養24小時後，回收培養上清，IFN-y的產生量用ELISA試劑盒(0ptEIA、BDPharmingen)測定(圖32A)。此外，為了確認糖的單獨效果，不用乳酸菌進行上述同樣的操作。此外，對於化合物(11)，進行與化合物(I)同樣的實驗。使用的化合物(II)的量，在培養孔中為10、100和300lig/ml(圖32B)。對於化合物(I)，將其和乳酸菌並用後得到顯著增強的IFN-y誘導能力(圖32A)。該作用強度之大是根據分別單獨使用化合物(I)和乳酸菌得到的效果(圖32A中從左開始的第2個到從右開始的第5個)所無法預料的，證明通過兩者並用產生協同效果。此外，對於化合物(n)，也同樣證明其和乳酸菌的協同效果(圖32B)。組成成分的巖藻糖、硫酸基巖藻糖沒有這樣的活性，作為益生菌被廣泛使用的低聚木糖也沒有這種作用。因此，本發明的巖藻多糖低聚糖通過和乳酸菌並用，可協同活化脾細胞，在生物體免疫功能調節方面非常有用。此外，在同樣製備的脾細胞中，將化合物(I)(VII)中的化合物任意3種均等混合後的混合物以50ug/ml的濃度添加到其中，30分鐘後將乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP-10028)(死菌)以0.1ug/ml分別添加到各培養孔中。培養24小時後，回收培養上清，測定IFN-Y的產生量(圖33)。如圖所示，使用(V)、(VI)和(VII)的混合物，(1)、(V)和(VI)的混合物，以及(1)、(V)和(VII)的混合物後，觀察到高的IFN-y產生量。由此可知，即使化合物(I)(XI)混合時，通過和乳酸菌並用，也會提高免疫功能調節活性。實施例7巖藻多糖低聚糖的對來自小鼠的樹突狀細胞的IL-IO、12誘導作用和CTL活性增強作用從BALB/c小鼠(8周齡、雄性、日本SLC株式會社)的大腿骨分離骨髓細胞，使其懸浮於含有10%FBS、20ng/mlGM-CSF(P印rotec)、20ng/ml1L—3(P印rotec)的RPMI1640培養基中，調整為1X106cells/ml，在24孔板上培養。培養開始第3、5天更換培養基，得到黏性未成熟樹突狀細胞。將得到的樹突狀細胞用化合物(1)、(H)、(III)、(V)、(VI)和(VII)分別以50"g/ml的濃度進行預處理。在預處理30分鐘後，將乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP-10028)(死菌)以0.1ng/ml分別添加到各培養孔內。培養2天後，回收培養上清和細胞。此外，為了確認糖化合物的單獨效果，不添加乳酸菌進行上述同樣的操作。對回收的培養上清用ELISA試劑盒測定IL-12和IL-IO。結果分別如圖34、35所示。化合物(I)和乳酸菌並用後協同誘導IL-12(圖34)。此外，化合物(11)、(III)和(V)和乳酸菌並用後誘導IL-10(圖35)。由上述可知，本發明發現的巖藻多糖低聚糖具有對生物體免疫功能進行正及負調節(使降低的免疫活化，或使抑制過剩的免疫反應)的功能。低聚木糖沒有這種作用。對回收的細胞計數，製備成1X105cells/ml後，在lml的細胞懸浮液中處理絲裂黴素C(50yg/ml)，37t:反應30分鐘。反應結束後，用PBS洗滌除去絲裂黴素C，添加lml根據常法製備的C57BL/6小鼠的脾細胞(5X106Cells/ml)，混合培養4天。回收培養後細胞，將具有C57BL/6小鼠的同種異型抗原的P-815細胞(5000cells/100ix1)作為耙細胞，以E:T比為40:1和80:1的比例反應4小時，通過用流式細胞儀對殺傷的P-815的數量計數，求出CTL活性(圖36)。確認化合物(1)、(III)、(V)、(VI)、(VII)和乳酸菌並用後，也能增強CTL活性。實施例7的結果也表明，通過使本發明的巖藻多糖水解產物和乳酸菌組合，能夠得到協同增強的免疫功能調節或免疫賦活作用。實施例8與幾乎沒有免疫功能調節活性的乳酸菌並用協同增強IL-12的產生給BALB/C小鼠(8周齡、雄性、日本SLC株式會社)腹腔內投與4.05%硫乙醇酸鹽培養基(Difco)，4天後使用10ml的PBS回收腹腔內浸潤的細胞。然後製備成lX106cells/ml，在24孔板上培養。培養開始3小時後，通過交換培養基除去浮遊細胞，得到巨噬細胞。在各培養孔中將化合物(I)和實施例3記載的低聚糖組分以100ug/ml的濃度添加，30分鐘後，將免疫功能調節活性強的乳酸菌(LactobacilluspentosusDS84C株;獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心2004年5月26日收領的FERMABP-10028)、或幾乎沒有免疫功能調節活性的乳酸菌(市售的Lactobacilluspentosus(以下稱乳酸菌A))(市售的Lactobacillusplantarum(以下稱乳酸菌B))以0.1ug/ml的濃度添加，培養24小時。然後回收培養上清，測定IL-12的產生量(圖37)。為了比較，分別單獨使用上述3種菌株進行與上述同樣的操作。不論是乳酸菌A還是乳酸菌B，其自身均沒有顯示可檢測程度的IL-12誘導活性，但將這些菌株和化合物(I)或低聚糖組分並用後，得到了顯著增大的IL-12誘導活性。由此證明，本發明得到的巖藻多糖水解產物，即使與沒有免疫功能調節活性的乳酸菌並用，也能發揮協同增強的免疫功能調節作用。實施例9與乳酸菌以外的物質的協同效果從C57BL/6小鼠(8周齡、雄性、日本CharlesRiver株式會社)中分離脾細胞，製備成5X106CellS/ml，在24孔板上培養。使實施例3的Fr.C組分分別成為30yg/ml，並添加到各培養孔中。30分鐘後，作為具有免疫賦活作用或免疫功能調節作用的物質，分別將PolyI:C(SIGMA)5ug/ral、LPS(SIGMA)2ng/ml、CpG-0DN(5，—TCCATGACGTTCCTGATGCT—3，從IntegratedDNATechnologies,Inc.得到)3yg/ml、腿46癌抗原(將醒46乳腺癌細胞在HANK，s溶液(NacalaiTesque)中均質化，從中提取的蛋白質帝京大學醫真菌研究中心提供)50ngprotein/ml、ConA(和光純藥)0.25yg/ml，分別添加到培養孔內。培養24小時後，回收培養上清，IFN-y的產生量用ELISA試劑盒(0ptEIA、BDPharmingen)測定(圖38)。為了比較，不使用Fr.C進行上述同樣操作。各免疫功能調節物質在本次實驗中使用的濃度下，幾乎沒有誘導IFN-y。但是，將這些物質和Fr.C即巖藻多糖水解產物(低聚糖)並用後，得到強的IFN-y誘導能力。由此證明，巖藻多糖水解產物和從其中得到的低聚糖，不僅在和乳酸菌並用時，和其他免疫賦活材料並用時也能使這些材料的免疫賦活或免疫功能調節作用提高。實施例10NK活性增強效果(體內)(Invivo)將C57BL/6小鼠(8周齡、雄性、日本CharlesRiver株式會社)分為4組，分別將單獨的巖藻多糖水解產物(實施例3記載的硫酸化糖組分500mg/kg、圖39的"巖藻多糖低聚糖")、單獨的乳酸菌(0.2mg/kg)、巖藻多糖水解產物+乳酸菌(圖39的"乳酸菌+巖藻多糖低聚糖")混在飲水中，使其自由攝取。使對照組攝取自來水。攝取開始1周後，根據規定方法從小鼠內分離脾細胞，將Yac-l細胞(5000cells/100u1)作為耙細胞測定NK活性。NK活性通過下述方法求出，即使以E:T比為20:1、40:1的比例反應4小時後，用流式細胞儀對殺傷的Yac-1的數量計數(圖39)。攝取從巖藻多糖中得到的巖藻多糖低聚糖後NK活性提高。進而通過並用巖藻多糖和乳酸菌，NK活性更高。因此，通過體內(Invivo)也可確認通過攝取巖藻多糖水解產物和乳酸菌的組合物，使免疫功能活化。實施例11巖藻多糖和乳酸菌組合的協同效果對小鼠脾細胞的IFN-y誘導作用在與實施例3同樣製備的脾細胞5X106Cells/ml內，使巖藻多糖A(株式會社SouthProduct)、巖藻多糖B(株式會社衝繩發酵化學)、巖藻多糖C(實施例l製備)分別為1、10、100yg/ml，並添加到培養孔內。添加巖藻多糖30分鐘後，分別將乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP—10028)(死菌)以O.lug/ml添加到各培養孔內。培養24小時後，回收培養上清，IFN-y的產生量用ELISA試劑盒(0ptEIA、BDPharmingen)測定(圖40)。此外，為了確認巖藻多糖的單獨效果，不用乳酸菌進行與上述同樣的操作。分別單獨使用3種巖藻多糖時，確認有IFN-y誘導能力。進而將這些物質與乳酸菌並用，其活性比預想的更強。由此證明，巖藻多糖通過和乳酸菌並用，能夠協同地使脾細胞活化，在生物體的免疫功能調節方面非常有用。權利要求1.組合物，其含有巖藻多糖或巖藻多糖水解產物和免疫賦活材料。2.如權利要求1所述的組合物，其中，所述水解產物是使巖藻多糖在0.l6.0N的酸中，在25100。C下水解0.252.5小時後得到的產物。3.如權利要求2所述的組合物，其中，所述水解產物是使巖藻多糖在0.54.ON的酸中，在309(TC下水解0.52.0小時後得到的產物。4.如權利要求13中任一項所述的組合物，其中，所述水解在鹽酸或硫酸中進行。5.如權利要求14中任一項所述的組合物，其中，所述水解產物是低聚糖。6.如權利要求5所述的組合物，其中，所述低聚糖是從由巖藻糖、硫酸基巖藻糖、乙醯基巖藻糖、以及葡萄糖醛酸組成的組中選擇的至少一種糖所構成的二糖到五糖的低聚糖。7.如權利要求6所述的組合物，其中，作為所述低聚糖，含有從下述結構式(i)、(n)、(m)、(rv)、(v)、(vi)、(vn)、(週)、(do、(x)以及(xi)所示的化合物中選擇的至少一種。formulaseeoriginaldocumentpage3formulaseeoriginaldocumentpage3formulaseeoriginaldocumentpage3formulaseeoriginaldocumentpage3formulaseeoriginaldocumentpage4formulaseeoriginaldocumentpage5formulaseeoriginaldocumentpage68.如權利要求17中任一項所述的組合物，其中，所述免疫賦活材料是從乳酸菌、酵母、真菌類的微生物；香菇、灰樹花、靈芝、阿加利格斯菇等蘑菇類；含有CpG基序的免疫原性寡聚脫氧核苷酸、聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸類的來自核酸的物質；脂多糖、e—葡聚糖；海藻類；中藥；腿46癌抗原類的抗癌疫苗；刀豆蛋白A;B腹中選擇的至少一種。9.如權利要求8所述的組合物，其中，所述免疫賦活材料是乳酸菌。10.免疫功能調節劑，其含有權利要求19中任一項所述的組合物。11.飲食品，其中添加有權利要求19中任一項所述的組合物。12.醫藥組合物，其含有權利要求19中任一項所述的組合物。13.化妝品，其含有權利要求19中任一項所述的組合物。全文摘要提供使乳酸菌等免疫賦活材料的活性增強的材料。通過提供這樣的材料，可使免疫賦活材料的使用量減少。並且，通過提供這樣的材料，可縮短用於篩選具有強的免疫賦活活性和良好的發酵特性的乳酸菌的時間。為了實現上述目的，將由酸水解巖藻多糖得到的產物或低聚糖和免疫賦活材料組合使用。通過這樣的組合，使所述物質的免疫功能調節作用或免疫賦活活性協同增強。文檔編號A61K45/00GK101282732SQ20068003601公開日2008年10月8日申請日期2006年7月28日優先權日2005年7月29日發明者安元健,楠元俊英,直木秀夫,野中裕司申請人:三得利株式會社;熱帶科技中心株式會社