抗體與人b7.1和b7.2之間獨特結合相互作用的鑑定的製作方法

2023-09-19 09:47:10

專利名稱：抗體與人b7.1和b7.2之間獨特結合相互作用的鑑定的製作方法
技術領域：
本發明涉及特異於B7.1抗原(CD80)的單克隆抗體的鑑定和應用。本發明更具體地涉及能抑制人B7.1抗原與CD28受體結合，但不能抑制B7.1與CTLA-4受體結合的單克隆抗體或其靈長化(primatized)形式的鑑定和應用。因此，本發明涉及識別B7.1抗原上除CTLA-4受體結合位點外的特異性位點的單克隆抗體或其靈長化形式的鑑定和應用。
本發明還涉及識別人B7.1抗原上的特異性位點並能抑制IL-2產生的單克隆抗體或其靈長化形式。
本發明還涉及含有特異於B7.1抗原的單克隆或靈長化抗體的藥物組合物，及其作為免疫抑制劑的用途，所述免疫抑制劑通過調節B7CD28途徑，可治療例如自身免疫病和預防器官排斥。
背景技術：
長期以來，人們已經意識到免疫學，血液學和腫瘤學之間存在臨床交叉。由血液學或腫瘤學專家治療的很多疾病在其病理生理學上既具有自身免疫的成分又具有免疫缺損的成分，這使得血液學專家廣泛應用免疫抑制藥物療法，而腫瘤學專家則尋求能增強對腫瘤的內源性免疫力的免疫學輔助物。迄今為止，這些幹預一般由非特異性方式的免疫抑制和免疫刺激組成。除這些幹預的效力有限外，其非特異性所致的毒性也限制了它們全面的成功，因此，已經在尋求其它的策略。
闡明數目快速增加的細胞表面分子的功能作用為免疫學與臨床血液學和腫瘤學的一體化作出了巨大貢獻。在免疫和造血系統的細胞中已鑑定出將近200個細胞表面抗原(Schlossman SF，Boumsell L，Gilks JM，Harlan T，Kishimoto，C Morimoto C，Ritz J.，Shaw S，SilversteinRL，Springer TA，Tedder TF，Todd RFCD抗原(1993)，血液83879，1994)。這些抗原代表的是受譜系限制的和更廣泛分布的分子，其中所述分子參與多個過程，包括細胞識別，粘著，增殖的誘導和維持，細胞因子分泌，效應物功能，甚至細胞死亡。
對這些分子功能屬性的認識促進了操縱免疫應答的新嘗試。儘管參與細胞粘著和抗原特異性識別的分子以前曾被評價為治療性免疫學幹預的靶，但最近人們著力研究的是被稱為共刺激分子的細胞表面分子亞組(Bretscher P「21年後，淋巴細胞活化的雙-信號模型」，今日免疫學，1373(1992)；Jenkins MK，Johnson JG「參與T細胞共刺激的分子」，免疫學最新看法，5351(1993)；Geppert T，Davis L.Gur H.WacholtzM.Lipsky P「參與T細胞活化的佐細胞信號」，免疫學評論，1175(1990)；Weaver CT，Unanue ER「抗原呈遞細胞的共刺激功能」，今日免疫學，1149(1990)；Stennam RM，Young JW「抗原呈遞細胞產生的信號」，免疫學最新看法，3361(1991))。共刺激分子不會引發但能產生和擴大抗原特異性T細胞應答和效應物功能(Bretscher P「21年後，淋巴細胞活化的雙-信號模型」，今日免疫學，1373(1992)；Jenkins MK，JohnsonJG「參與T細胞共刺激的分子」，免疫學最新看法，5351(1993)；GeppertT，Davis L.Gur H.Wacholtz M.Lipsky P「參與T細胞活化的佐細胞信號」，免疫學評論，1175(1990)；Weaver CT，Unanue ER「抗原呈遞細胞的共刺激功能」，今日免疫學，1149(1990)；Stennam RM，YoungJW「抗原呈遞細胞產生的信號」，免疫學最新看法，3361(1991)；JuneCH，Bluestone JA，Linsley PS，Thompson CD「CD28受體在T細胞活化中的作用」，今日免疫學，15321(1994))。
最近，不同的研究小組研究了一個被稱為B7CD28的特異性共刺激途徑，因為該途徑在B和T細胞活化中作用顯著(June CH，Bluestone JA，Linsley PS，Thompson CD「CD28受體在T細胞活化中的作用」，今日免疫學，15321(1994)；June CH，Ledbetter JA「CD28受體在針對抗原的T細胞應答過程中的作用」，免疫學年評，11191(1993)；SchwartzRH「T淋巴細胞的共刺激CD28，CTLA-4和B7/BB1在白細胞介素-2的產生和免疫療法中的作用」，細胞711065-1068(1992)；Jenkins MK，Taylor PS，Norton SD，Urdahl KB「CD28傳遞參與人T細胞產生抗原特異性IL-2的共刺激信號」，免疫學雜誌，1472461-2466(1991))。由於4年前就發現了這種配體受體途徑，因此，已積累的大量證據表明B7CD28相互作用代表測定免疫反應性與無反應性中的一個重要時機(June CH，B1uestone JA，Linsley PS，Thompson CD「CD28受體在T細胞活化中的作用」，今日免疫學，15321(1994)；June CH，LedbetterJA「CD28受體在針對抗原的T細胞應答過程中的作用」，免疫學年評，11191(1993)；Schwartz RH「T淋巴細胞的共刺激CD28，CTLA-4和B7/BB1在白細胞介素-2的產生和免疫療法中的作用」，細胞711065-1068(1992)；Cohen J「有目的地打擊不必要的免疫應答」(新聞；評論)科學，257751(1992)；Cohen J「新蛋白質，即T細胞的『共刺激物』搶出風頭」(新聞；評論)科學，262844(1993))。
具體地說，已報導人B7抗原，即人B7.1(CD80)和B7.2(CD86)在T細胞活化中起著共刺激作用，例見Gimmi CD，Freeman，GJ，Gribben JG，Sugita K，Freedman AS，Morimoto C，Nadler LM「B細胞表面抗原B7提供誘導T細胞增殖和分泌白細胞介素2的共刺激信號」Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)886575-6579(1991)。
1.B7.1和B7.2在T細胞活化中的共刺激作用成功免疫應答的具體運作取決於T細胞和抗原呈遞細胞之間一系列特異性的相互作用。儘管在MHC II類分子的上下文中，此過程必要的第一步取決於抗原與T細胞受體的結合(Lane，P.J.L.，F.M.McConnell，G.L.Schieven，E.A.Clark和J.A.Ledbetter(1990)，「II類分子在人B細胞活化中的作用」，免疫學雜誌，1443684-3692)，但僅有這種相互作用不足以誘導對給定抗原作出持續反應所必需的所有情況(Schwartz，R.H.(1990)，「T淋巴細胞克隆無反應性的細胞培養模型」，科學，2481349；Jenkins，M.K.(1992)，「細胞分裂在誘導克隆無反應性中的作用」，今日免疫學，1369；Azuma，M.，M.Cayabyab，D.Buck，J.H.Phillips和L.L.Lanier(1992)，「CD28參與由人天然殺傷性白血病細胞系介導的MHC-非限制性細胞毒性」，免疫學雜誌，1491115-1123；Azuma，M.，M.Cayabyab，D.Buck，J.H.Phillips和L.L.Lanier(1992)，「CD28與B7的相互作用共同刺激初次同種異體增殖性應答和由小的靜息T淋巴細胞介導的細胞毒性」，實驗醫學雜誌，175353-360；S.D.Norton，L.Zuckerman，K.B.Urdahl，R.Shefner，J.Miller和M.K.Jenkins(1992)，「CD28的配體B7通過為T細胞提供共刺激信號以增強IL-2產生」，免疫學雜誌，1491556-1561；R.H.Schwartz「T淋巴細胞的共刺激CD28，CTLA-4和B7/BB1在白細胞介素-2的產生和免疫療法中的作用」，細胞711065-1068(1992))。
其它一些共刺激分子的參與是必要的(Norton，S.D.，L.Zuckerman，K.B.Urdahl，R.Shefner，J.Miller和M.K.Jenkins(1992)，「CD28的配體B7通過為T細胞提供共刺激信號增強IL-2產生」，免疫學雜誌，1491556-1561)。在T細胞上表達的同二聚體CD28和CTLA-4(June CH，J.A.Ledbetter，P.S.Linsley和C.B.Thompson(1990)「CD28受體在T細胞活化中的作用」，今日免疫學，11211-216；Linsley，P.S.，W.Brady，M.Urnes，L.S.Grosmaire，N.K.Damle和J.A.Ledbetter(1991)，「CTLA-4是B細胞活化抗原B7的第二受體」，實驗醫學雜誌，174561)，與抗原呈遞細胞上表達的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)是維持免疫應答所必需的主要共刺激分子對(Azuma，M.，H.Yssel，J.H.Phillips，H.Spits和L.L.Lanier(1993)，「B7/BB1在活化的T淋巴細胞上的功能性表達」，實驗醫學雜誌，177845-850；Freeman，G.J.，A.S.Freedman，J.M.Segil，G.Lee，J.F.Whitman和LM.Nadler(1989)，「B7，在活化的和致瘤性B細胞上具有獨特表達的Ig超家族新成員」，免疫學雜誌，1432714-2722；Hathcock，K.S.，G.Laslo，H.B.Dickler，J.Bradshaw，P.Linsley和R.J.Hodes(1993)，「共刺激T細胞活化的CTLA-4配體的鑑定」，科學，262905-911；Hart，D.N.J.，G.C.Starling，V.L.Calder和N.S.Fernando(1993)，「B7/BB-1是人樹狀細胞上由活化誘導的白細胞分化抗原」，免疫學，79616-620)。在體外可以表明這些共刺激信號的缺乏導致失敗的T細胞活化途徑和對特異性抗原產生非反應性或無反應性(例見Harding，F.A.，J.G.McArthur，J.A.Gross，D.M.Raulet和J.P.Allison(1992)，「CD28介導的信號傳遞共刺激鼠T細胞並防止在T細胞克隆中誘導無反應性」，自然，356607-609；Gimmi，C.D.，G.J.Freeman，J.G.Gribben，G.Gray和L.M.Nadler(1993)，「缺乏B7共刺激時抗原呈遞誘導人T細胞克隆無反應性」，Proc.Natl.Acad.Sci，906586-6590；Tan，P.，C.Anasefti，J.A.Hansen，J.Melrose，M.Brunvand，J.Bradshaw，J.A.Ledbetter和P.S.Linsley(1993)，「通過阻斷CD28與其天然配體B7/BB1的相互作用在人T淋巴細胞中誘導同種抗原-特異性低反應性」，實驗醫學雜誌，177165-173)。體內耐受性的獲得構成了免疫抑制和器官移植排斥的活體療法以及治療自身免疫病的機理。給實驗模型施用CTLA-4Ig之後能達到上述目的(Lenschow，D.J.Y.Zeng，R.J.Thistlethwaite，A.Montag，W.Brady，M.G.Gibson，P.S.Linsley和J.A.Bluestone(1992)，「由CTLA-4Ig誘導的異種胰島移植物的長期存活」，科學，257789-795)。
B7.1和B7.2分子能與CD28或CTLA-4結合，雖然B7.1與CD28結合的kd為200Nm，而與CTLA-4結合的親合力要高20倍(Linsley，P.S.，E.A.Clark和J.A.Ledbetter(1990)，「T細胞抗原CD28通過與活化抗原B7/BB-1相互作用介導與B細胞的粘著」，Proc.Natl.Acad.Sci，875031-5035；Linsley等(1993)，「CD28受體在針對抗原的T細胞應答過程中的作用」，免疫學年評，11191-192；Linsley等(1993)，「B7/BB-1導致的CD28的參與誘導CD28合成的瞬時下調和對CD28所傳遞信號的延長的無反應性」，免疫學雜誌，1503151-3169)。B7.1在活化的B細胞和由幹擾素誘導的單核細胞上表達，但不在靜息B細胞上表達(Freeman，G.J.，G.S.Gray，C.D.Gimmi，D.B.Lomarrd，L-J.Zhou，M.White，J.D.Fingeroth，J.G.Gribben和LM.Nadler(1991)，「人B淋巴細胞活化抗原B7的鼠同系物的結構，表達和T細胞共刺激活性」，實驗醫學雜誌，174625-631)。另一方面，B7.2以很低的水平在靜息單核細胞，樹狀細胞和B細胞上組成型表達，在活化的T細胞，NK細胞和B淋巴細胞上其表達有所增強(Azuma，M.D.Ito，H.Yagita，K.Okumura，J.H.Phillips，L.L.Lanier和C.Somoza，1993，「B70抗原是CTLA-4和CD28的第二配體」，自然，36676-79)。儘管B7.1和B7.2可在相同的細胞類型上表達，但它們以不同的動力學在B細胞中表達(Lenschow，D.J.，G.H.Su，L.A.Zuckerman，N.Nabavi，C.L.Jellis，G.S.Gray，J.Miller和J.A.Bluestone(1993)，「CTLA-4其它配體的表達和功能重要性」，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，9011054-11058；Boussiotis，V.A.，G.J.Freeman，J.G.Gribben，J.Daley，G.Gray和L.M.Nadler(1993)，「活化的人B淋巴細胞表達三個共刺激T細胞活化的CTLA-4反受體」，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，9011059-11063)。在RNA水平上的進一步分析闡明B7.2 mRNA組成型表達，而B7.1 mRNA在活化後4小時才能檢測到，並且直到刺激後24小時才可檢測到最初低水平的B7.1蛋白(Boussiotis，V.A.，G.J.Freeman，J.G.Gribben，J.Daley，G.Gray和L.M.Nadler(1993)，「活化的人B淋巴細胞表達三個共刺激T細胞活化的CTLA-4反受體」，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，9011059-11063)。因此，CTLA-4/CD28反受體可在B細胞活化後的不同時間表達。
最近，已闡明第二個與T細胞相關的共同受體CTLA-4明顯起負調節物的作用以阻止脫離控制的免疫系統和使之無效(Krummel M，Allison J「CD28和CTLA-4對T細胞對刺激的反應具有相反的作用」，實驗醫學雜誌，182459-466(1995))。CTLA-4受體在下調免疫應答時起著重要作用，這一點已在CTLA-4剔除小鼠中得以證實。出生時不具備表達CTLA-4基因的能力的剔除小鼠在3-4周內即死於嚴重的淋巴增生性疾病(Tivol EA，Borriello G，Schweitzer AN，Lynch WP，Bluestone JA，Sharpe AH「CTLA-4的缺乏導致大量淋巴增生和致命的多器官組織破壞，這表明CTLA-4重要的負調節作用」，免疫力，3541-547(1995))。據認為CTLA-4通過與誘導細胞凋亡相關聯的信號傳遞機制起作用(Gribben JG，Freeman GJ，Boussiotis VA，Rennert P，Jellis CL，Greenfield E，Barber M，Restivo JR.VA，Ke X，Gray GS，Nadler LM「CTLA-4介導人T細胞的抗原特異性細胞凋亡」，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)92811-815(1995))，通過至今尚未限定的配體引發與受體特異性位點的結合。在體外已闡明以多種方式阻斷依賴於B7.1/B7.2的共刺激信號會導致T細胞活化途徑失效，並對特異性抗原產生非反應性(Lederman S，Chess L，Yellin MJ「識別人T淋巴細胞表面糖蛋白的鼠單克隆抗體(5c8)，含有所述抗體的組合物」，美國專利5,474,771(1995-12-12)；Linsley PS，Ledbetter JA，Damle NK，Brady W「嵌合的CTLA4受體及其使用方法」，美國專利5,434,131(1995-7-18)；Harding，1992；Gimmi CD，Freeman GJ，Bribben JG，Gray G，Nadler LM「缺乏B7共刺激時由抗原呈遞誘導人T細胞克隆無反應性」，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)906586-6590(1993)；Tan P，Anasetti C，Hansen JA，MelroseJ，Brunvand M，Bradshaw J，Ledbetter JA，Linsley PS「通過阻斷CD28與其天然配體B7/BB1的相互作用在人T淋巴細胞中誘導同種抗原-特異性低反應性」，實驗醫學雜誌，177165-173(1993))。體內耐受，無反應性或抗原特異性T細胞被除盡的獲得構成了免疫抑制和器官移植排斥的活體療法或對自身免疫病進行可能的治療的機理。
B7.1和B7.2的差異時間表達說明這兩個分子與CTLA-4和/或CD28的相互作用給T細胞傳遞了不同但相關的信號(LaSalle，J.M.，P.J.Tolentino，G.J.Freeman，L.M.Nadler和D.A.Hafler(1992)，「CD28和T細胞抗原受體信號傳導響應超抗原刺激以協調白細胞介素2基因表達」，實驗醫學雜誌，176177-186；Vandenberghe，P.，G.J.Freeman，L.M.Nadler，M.C.Fletcher，M.Kamoun，L.A.Turka，J.A.Ledbetter，C.B.Thompson和C.H.June，(1992)，「抗體和B7/BB1-介導的CD28受體的連接誘導人T細胞中的酪氨酸磷酸化」，實驗醫學雜誌，175951-960)。目前仍不知道T細胞上的CTLA-4和CD28的確切的信號傳遞功能(Janeway，C.A.，Jr.和K.Bottomly，(1994)，「淋巴細胞反應的信號和跡象」，細胞，76275-285)。然而，一套受體可以為T細胞活化提供最初的刺激物，另外，持續的信號能夠進一步地展開途徑和進行克隆擴增(Linsley，P.S.，J.L.Greene，P.Tan，J.Bradshaw，J.A.Ledbetter，C.Anasetti和N.K.Damle，(1992)，「CTLA-4與CD28在活化的T淋巴細胞上的共表達和功能協作」，實驗醫學雜誌，1761595-1604)。最新的資料支持由Jenkins和Schwartz提出的兩-信號假說(Schwartz，R.H.，(1990)，「T淋巴細胞克隆無反應性的細胞培養模型」，科學，2481349；Jenkins，M.K.，(1992)，「細胞分裂在誘導克隆無反應性中的作用」，今日免疫學，1369)，TCR和共刺激信號都是T細胞擴展，淋巴因子分泌和效應物功能全面展開所必需的(Greenan，V.和G.Kroemer，(1993)，「細胞免疫耐受的多個路徑」，今日免疫學，14573)。傳遞第二信號的失敗導致T細胞不能分泌IL-2並使得細胞對抗原呈無反應性。
結構上，B7.1和B7.2都含有胞外免疫球蛋白超家族V和C-樣區域，疏水跨膜區和胞質尾(Freeman，G.J.，J.G.Gribben，V.A.Boussiotis，J.W.Ng，V.Restivo，Jr.，L.A.Lombard，G.S.Gray和L.M.Nadler，(1993)，「B7.2的克隆共刺激人T細胞增殖的CTLA-4反受體」，科學，262909)。B7.1和B7.2都是高度糖基化的。B7.1是44-54KD的糖蛋白，該糖蛋白由223個胺基酸的胞外區域，23個胺基酸的跨膜區域和61個胺基酸的胞質尾組成。B7.1含有3個潛在的蛋白激酶磷酸化位點(Azuma，M.，H.Yssel，J.H.Phillips，H.Spits和L.L.Lanier，(1993)，「B7/BB1在活化的T淋巴細胞上的功能性表達」，實驗醫學雜誌，177845-850)。B7.2是306個胺基酸的膜糖蛋白，它由220個胺基酸的胞外區域，23個胺基酸的疏水跨膜區域和60個胺基酸的胞質尾組成(Freeman，G.J.，A.S.Freedman，J.M.Segil，G.Lee，J.F.Whitman和LM.Nadler(1989)，「B7，在活化的和致瘤性的B細胞上具有獨特表達的Ig超家族新成員」，免疫學雜誌，1432714-2722)。儘管B7.1和B7.2基因都位於相同的染色體區域(Freeman，G.J.，D.B.Lombard，C.D.Gimmi，S.A.Brod，L Lee，J.C.Laning，D.A.Hafler，M.E.Dorf，G.S.Gray，H.Reiser，C.H.June，C.B.Thompson和L.M.Nadler，(1992)，「CTLA-4和CD28 mRNA在活化後的大多數T細胞上共表達」，免疫學雜誌，1493795-3801；Schwartz，R.H.，(1992)，「淋巴細胞的共刺激CD28，CTLA-4和B7/BB1的作用」，於Selvakumar，A.，B.K.Mohanraj，R.L.Eddy，T.B.Shows，P.C.White，C.Perrin，和B.Dupont(1992)，「編碼B淋巴細胞活化抗原B7的人基因的基因組構成和染色體定位」，免疫遺傳學，36175-181)，這些抗原不共享高水平的同源性，B7.1和B7.2之間的全部同源性為26％，鼠B7.1和人B7.1之間的全部同源性為27％(Azuma，M.，H.Yssel，J.H.Phillips，H.Spits和L.L.Lanier，(1993)，「B7/BB1在活化的T淋巴細胞上的功能性表達」，實驗醫學雜誌，177845-850；Freeman，G.J.，A.S.Freedman，J.M.Segil，G.Lee，J.F.Whitman和LM.Nadler(1989)，「B7，在活化的和致瘤性的B細胞上具有獨特表達的Ig超家族新成員」，免疫學雜誌，1432714-2722)。儘管人B7.1，人B7.2和鼠B7.1序列的排列表明具有長同源性的序列段很少，但已知所有這三個分子都與人CTLA-4和CD28結合，因此，這三個分子很可能享有共同的，或密切同源的區域，該區域或者是鄰接的，或者是構象的。所述區域可構成B7.1和B7.2分子與它們的反受體的結合位點。針對這些表位產生的抗體可有效地抑制B7與T細胞上的其反受體的相互作用。另外，與B7.1和B7.2分子上的此區域交叉反應的抗體比分別針對B7.1或B7.2的抗體可能更具有實際可行的好處。
2.阻斷B7/CD28相互作用阻斷B7/CD28相互作用可以誘導特異性的免疫抑制，所述免疫抑制具有產生長期的抗原特異性治療效果的潛能。暫時阻斷這種相互作用的抗體或藥劑可成為具有產生長期的抗原特異性治療效果潛能的，有用的，特異性的和安全的臨床免疫抑制劑。
如通過在體外抑制IL-2的產生所測定的，已表明B7.1或B7.2的抗體可阻斷T細胞活化(DeBoer，M.，P.Parren，J.Dove，F.Ossendorp，G.van der Horst和J.Reeder(1992)，「新的抗B7單克隆抗體的功能性鑑定」，歐洲免疫學雜誌，223071-3075；Azuma，M.，H.Yssel，J.H.Phillips，H.Spits和L.L.Lanier，(1993)，「B7/BB1在活化的T淋巴細胞上的功能性表達」，實驗醫學雜誌，177845-850)。然而，不同的抗體顯示出不同的免疫抑制效力，這可以反映出它們的親合性或表位特異性。對此現象的可能的解釋是一些抗體僅能阻斷B7與CD28的結合，卻在活化的T細胞中經由CTLA-4受體促進了細胞凋亡或一些其它形式的負信號傳遞。實際上，一些針對B7.1或B7.2的抗體通過與CTLA-4結合區域交叉反應可阻礙CTLA-4的活性，CTLA-4Ig融合蛋白和抗CD28Fab顯示出對IL-2產生的下調具有類似的作用。
體內施用可溶性的CTLA-4Ig融合蛋白已表明可抑制小鼠體內依賴於T細胞的抗體應答(Linsley，P.S.，J.L.Greene，P.Tan，J.Bradshaw，J.A.Ledbetter，C.Anasetti和N.K.Damle(1992)，「CTLA-4和CD28在活化的T淋巴細胞上的共表達和功能性合作」，實驗醫學雜誌，1761595-1604；Lin，H.，S.F.Builing，P.S.Linsley，R.O.Wei，C.D.Thompson和L.A.Turka(1993)，「由CTLA-4-Ig加上供體特異性輸血誘導的對與主要組織相容性複合物錯配的心臟同種移植物的長期接受」，實驗醫學雜誌，1781801)，另外，較大的劑量還能抑制對第二次免疫的反應，這表明了該方法在治療抗體介導的自身免疫病中的可行性。另外，在小鼠中，CTLA-4Ig能通過直接抑制T細胞與B7.1/B7.2抗原呈遞細胞的相互作用來防止胰島細胞排斥(Lenschow，D.J.，G.H.Su，L.A.Zuckerman，N.Nabavi，C.L.Jellis，G.S.Gray，J.Miller和J.A.Bluestone(1993)，「CTLA-4其它配體的表達和功能重要性」，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，9011054-11058)。此時，獲得長期的供體特異性的耐受性。
3.用於選擇抗體的重組噬菌體展示技術迄今為止，尚未報導過與B7.1和B7.2發生交叉反應的單克隆抗體。另外，尚未報導過特異於B7.1或B7.2，也識別抗原上僅限於與共活化受體CD28結合的特異性位點的單克隆抗體。或者，尚未報導過特異於B7.1或B7.2，也識別抗原上除CTLA-4受體結合位點外的特異性位點的單克隆抗體。如上文所討論，這種抗體作為免疫抑制劑可能是很合適的。
由於相對於傳統方法而言，噬菌體展示技術可評估更大百分比的免疫所有組成成分，因此開始以此技術取代傳統方法以分離免疫應答過程中產生的抗體。這部分是由於PEG融合失效，染色體的不穩定，和大量組織培養物及與異源雜交瘤產生相關的篩選。與之形成對照的是噬菌體展示技術依靠可能捕獲到免疫球蛋白基因的全部組成成分的分子技術，所述基因與針對給定抗原的反應有關。
此技術由Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，7978-7982(1991)描述。實質上，免疫球蛋白重鏈基因被PCR擴增，並以產生重鏈融合蛋白的形式克隆至含有編碼絲狀噬菌體M13的次要外被蛋白的基因的載體中。裝配時將重鏈融合蛋白與輕鏈基因一起摻入M13噬菌體顆粒中。每個重組噬菌體的基因組中含有在其表面展示的不同抗體Fab分子的基因。在這些文庫中，可克隆和展示超過106個不同抗體。在包被有抗原的微升孔中淘選噬菌體文庫，洗下非特異性的噬菌體，洗脫與抗原結合的噬菌體。分離得自抗原特異性克隆的基因組，切下基因III使抗體可表達為可溶性Fab形式供進一步鑑定。一旦將單個Fab選擇為有潛力的候選治療劑，可容易地將它轉變為完整的抗體。以前描述的用於將Fab序列轉變為完整抗體的表達系統是IDEC哺乳動物表達載體NEOSPLA，此載體含有人γ1或γ4恆定區基因。用NEOSPLA載體轉染CHO細胞，擴增後，可得到據報導可提供很高的表達水平(＞30pg/細胞/天)的此載體系統。
4.靈長化的抗體Newman，(1992)，生物技術，10，1455-1460公開了另一種產生重組抗體的高度有效的方法，更具體地，該技術導致含有猴可變區和人恆定區序列的靈長化抗體的產生，將此參考文獻的全文引入作為參考。另外，此技術也描述於1995年1月25日提交的共同轉讓的美國申請08/379,072中，該申請是1992年7月10日提交的美國流水號07/912,292的繼續申請，07/912,292是1992年3月23日提交的美國流水號07/856,281的部分繼續申請，07/856,281是1991年7月25日提交的美國流水號07/735,064的部分繼續申請。08/379,072及其母申請全文引入作為參考。
此技術修飾了抗體以使它們在施用於人的過程中不會被當作抗原排斥。此技術依賴於用人抗原或受體免疫cynomolgus猴。開發此技術可產生針對人細胞表面抗原的高親合力的單克隆抗體。
在1995年6月7日提交的共同轉讓的美國申請08/487,550(全文列入本文作為參考)中也描述了通過篩選使用經B7.1和/或B7.2免疫的猴的B淋巴細胞得到的噬菌體展示文庫或猴異源雜交瘤來鑑定針對人B7.1和B7.2的獼猴抗體。更具體地，08/487,550提供了4個單克隆抗體7B6，16C10，7C10和20C9，所述抗體可抑制B7CD28途徑，從而作為有效的免疫抑制劑起作用。
據報導以這些共轉讓申請中所述方式產生的抗體可顯示人效應物功能，具有降低的免疫原性和長的血清半壽期。該技術依據的事實是儘管cynomolgus猴在系統發育上類似於人，但它們仍然將很多人蛋白質識別為外源蛋白質，因此會發動免疫應答。另外，由於cynomolgus猴在系統發育上與人接近，這些猴產生的抗體與人產生的抗體具有高水平的胺基酸同源性。實際上，對獼猴免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區基因進行測序後，發現各個基因家族的序列與其人對應物85-98％同源(Newman等，(1992)，文獻同上)。以此方式產生的第一個抗體抗-CD4抗體與人免疫球蛋白構架區域的共有序列91-92％同源(Newman等，生物技術，101458-1460(1992)。
在以前的文獻中描述了特異於人B7抗原的單克隆抗體。例如，Weyl等，人類免疫學，31(4)，271-276(1991)中描述了使用天然和突變的抗原變體對針對HLA-B-27的人單克隆抗體進行表位作圖。Toubert等，臨床實驗免疫學，82(1)，16-20，(1990)也描述了與35-KD細菌外膜蛋白反應的HLA-B27單克隆抗體的表位作圖。Valle等，免疫學，69(4)，531-535(1990)也描述了識別活化的B細胞和HTLV-1轉化的T細胞上表達的B7抗原的IgG1亞類單克隆抗體。另外，Toubert等，免疫學雜誌，141(7)，2503-9(1988)描述了使用區域內重組體對HLA-B27和HLA-B7抗原進行表位作圖，所述重組體是通過在大腸桿菌中製備這兩個等位基因之間的雜合基因而構建的。
一些研究者認為B7抗原的高表達與自身免疫病相關，例如，Ionesco-Tirgoviste等，Med.Interre，24(1)，11-17，(1986)報導了1型胰島素依賴型糖尿病中B7抗原的表達有所增加。另外，據報導在得自銀屑病患者的真皮樹狀細胞上表達了B7抗原(Nestle等，J.Clin.Invest.，94(1)，202-209(1994))。
另外，文獻中還報導了使用經親和純化的可溶性HLA-B7抑制抗-HLA-B7同種反應性CTL(Zavazava等，移植，51(4)，838-42，(1991))。另外，還報導了B7受體可溶性配體CTLA-4-Ig在動物模型中阻斷B7活性的用途(例見Lenschow等，科學，257，789，7955(1992))，和能抑制B7的B7.1-Ig融合蛋白。
這些文獻中提供了鑑定單克隆抗體的證據，所述抗體能識別僅限於與CD28受體結合的B7.1抗原上的特異性位點。另外，本文提供了鑑定抗體的證據，所述抗體能識別B7.1抗原上除CTLA-4受體結合位點外的位點。因此，本文提供的證據支持人B7.1(CD80)共刺激抗原上獨特抗原結合位點的存在。通過抗-B7.1 PRIMATIZED抗體鑑定所述位點，提供的證據進一步證實與B7.1抗原上相互作用位點的結合局限於與共活化受體CD28結合。
發明概述和目的本發明的一個目的是鑑定特異於人B7.1抗原的新抗體。更具體地，本發明的目的是鑑定特異於人B7.1抗原並能抑制B7.1與CD28受體結合的抗體。本發明的另一目的是鑑定特異於人B7.1抗原且不能抑制B7.1與CTLA-4受體結合的抗體。因此，本發明的目的是鑑定識別B7.1抗原上特異性位點的抗體，其中被識別的位點僅限於與CD28受體結合，而不是與CTLA-4受體結合的位點。
本發明的另一目的是鑑定特異於人B7.1抗原，但不能識別人B7.2抗原的抗體。
本發明的另一目的是鑑定能識別人B7.1抗原上的特異性位點，抑制IL-2產生和T細胞增殖並能用作有效的免疫抑制劑的單克隆抗體及其靈長化的形式。更具體地，本發明的目的是鑑定特異於B7.1並能抑制IL-2產生的抗體。
本發明的目的是提供能抑制供體脾細胞培養物中由抗原驅動的應答，如抗原特異性IgG應答，IL-2產生和細胞增殖的單克隆抗體及其靈長化的形式。
本發明的另一特殊目的是鑑定具有有利特性，即親和性，免疫抑制活性，並可用作治療劑的特異於人B7.1抗原的特定單克隆抗體及其靈長化的形式。更具體地，這些抗體及其靈長化的形式可用作例如免疫抑制劑，即阻斷由抗原驅動的免疫應答以治療自身免疫病，如銀屑病，類風溼性關節炎，系統性紅斑狼瘡(SLE)，1型糖尿病，特發性血小板減少性紫癜(ITP)，變態反應，炎性膽汁病，並預防器官排斥。
本發明的另一目的是提供藥物組合物，該組合物含有一種或多種特異於人B7.1抗原的單克隆抗體及其靈長化的形式，還含有藥物可接受的載體或賦形劑。這些組合物可用作例如免疫抑制劑以治療自身免疫病，如特發性血小板減少性紫癜(ITP)和系統性紅斑狼瘡(SLE)，阻斷由抗原驅動的免疫應答，並預防移植物受體的器官排斥。
本發明的另一目的是提供新的治療方法，所述方法是施用治療有效量的一種或多種或靈長化的與人B7.1抗原特異性結合的單克隆抗體。這種治療方法可用於治療通過抑制B7CD28途徑可以治療的疾病，如自身免疫病，包括特發性血小板減少性紫癜(ITP)，系統性紅斑狼瘡(SLE)，1型糖尿病，銀屑病，類風溼性關節炎，多發性硬化，再生障礙性貧血，所述方法還可預防移植受試者的排斥。
本發明的另一目的是提供轉染子，如CHO細胞，它至少表達特異於人B7.1抗原的單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區。
定義定義下列術語以便更清楚地理解本發明。
清除型抗體-殺死活化的B細胞或其它抗原呈遞細胞的抗體。
非清除型抗體-阻斷B7和T細胞活化配體CD28和CTLA-4的共刺激作用的抗體，因此它使抗原呈遞細胞無反應性，但並不消除該細胞。
靈長化抗體-為重組抗體，經改造含有猴抗體，具體為cynomolgus猴抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，它含有人恆定區序列，優選含有人免疫球蛋白γ1或γ4恆定區(或PE變體)。這種抗體的製備描述於Newman等，(1992)，「用於人類疾病的免疫療法的重組抗體的靈長化針對人CDH的獼猴/人嵌合抗體」，生物技術，101458-1460；和共同轉讓的美國申請08/379,072中，這兩篇文獻的全文都列入本文作為參考。據報導這些抗體表現出與人抗體高水平的同源性，即85-98％，顯示出人效應物功能，具有降低的免疫原性，對人抗原具有高親合性。
B7抗原-本申請中的B7抗原包括例如人B7，B7.1和B7.2抗原，這些抗原與CD28和/或CTLA-4結合。這些抗原在T細胞活化中具有共刺激作用。這些B7抗原都含有胞外免疫球蛋白超家族V和C-樣區域，疏水的跨膜區和胞質尾(例見Freeman等，科學，262909(1993))，並且是高度糖基化的。
抗-B7抗體-以足夠的親合力與人B7抗原，如人B7.1和/或B7.2抗原特異性結合以阻斷B7CD28相互作用從而誘導免疫抑制的抗體，優選為猴單克隆抗體或其靈長化形式。
附圖簡述

圖1圖示了pMS載體，該載體可用於篩選針對絲狀噬菌體表面展示的B7產生的重組免疫球蛋白文庫，所述載體上含有基於獼猴免疫球蛋白序列的引物。
圖2圖示了用於表達本發明特異於人B7.1抗原的靈長化抗體的NEOSOLA表達載體。
圖3a圖示了7C10輕鏈的靈長化形式的胺基酸和核酸序列。
圖3b圖示了7C10重鏈的靈長化形式的胺基酸和核酸序列。
圖4a圖示了7B6輕鏈的靈長化形式的胺基酸和核酸序列。
圖4b圖示了7B6重鏈的靈長化形式的胺基酸和核酸序列。
圖5a圖示了16C10靈長化輕鏈的胺基酸和核酸序列。
圖5b圖示了16C10靈長化重鏈的胺基酸和核酸序列。
圖6圖示了P16C10不能阻斷CTLA-4Ig-生物素與被B7.1轉染的CHO細胞的結合。
圖7圖示了CTLA-4Ig不能阻斷P16C10-生物素與被B7.1轉染的CHO細胞的結合。
圖8圖示了BB-1完全阻斷了CTLA-4Ig-生物素與被B7.1轉染的CHO細胞的結合，還圖示了BB-1不能顯著影響P16C10-生物素與被B7.1轉染的CHO細胞的結合。
圖9圖示了CTLA-4Ig-生物素被除P16C10以外的所有B7.1抑制劑有效阻斷。
圖10圖示了P16C10能阻斷CD28/B7-1Ig結合的相互作用。所示數據是得自4次獨立實驗的平均值。
發明詳述如上所述，本發明涉及鑑定特異於人B7.1抗原，能抑制人B7.1與CD28受體結合，但不能抑制B7.1與CTLA-4受體結合的單克隆抗體或其靈長化形式。用經鑑定的抗體封閉CD28和B7.1(CD80)之間主要的活化位點，而允許對陽性共刺激的拮抗作用與對陰性信號傳遞的興奮作用並存，這是幹預復發形式的自身免疫病的有用的治療方法。通過阻斷T細胞刺激性細胞因子IL-2的產生可限定所鑑定抗體的功能活性。儘管存在第二驅動配體B7.2，但鑑定出的抗體表現出可阻斷50％以上IL-2產生，這表明存在另一種作用機制，該機制不是典型的文獻中限定的其它抗B7.1抗體所觀察到的作用。
本文所述的共同待審的美國申請流水號08/487,550中描述了特異性結合人B7.1和/或人B7.2抗原的新的猴單克隆抗體，以及由此衍生的靈長化抗體的製備。這些抗體對人B7.1和/或人B7.2具有高親和性，因此可用作抑制B7CD86途徑的免疫抑制劑。
優選通過篩選噬菌體展示文庫或通過使用經B7(如人B7.1和/或人B7.2)免疫過的猴的B淋巴細胞製備猴異源雜交瘤來實現猴單克隆抗體的製備。
如上所述，產生抗B7抗體的第一種方法涉及重組噬菌體展示技術，上述文獻中一般性地描述了該技術。
實質上，這包括合成針對絲狀噬菌體表面展示的B7抗原的重組免疫球蛋白文庫，和選擇出可分泌對B7.1和/或B7.2抗原具有高親和性的抗體的噬菌體。如上述文獻所述，優選選擇與人B7.1和B7.2都可結合的抗體。為了實現這一方法學，本發明人製備了獨特的猴文庫，該文庫降低了重組的可能性並改善了穩定性。下文將詳細描述的載體pMS示於圖1。
實質上，為了採用噬菌體展示與獼猴文庫一起使用，此載體含有特異性引物以用於PCR擴增猴免疫球蛋白基因。這些引物基於開發靈長化技術和含有人序列的資料庫時所得的獼猴序列。
適當的引物描述於共同轉讓的08/379,072中，該文獻被列入本文作為參考。
第二種方法涉及針對人B7抗原，優選針對人B7.1和B7.2抗原免疫猴，即獼猴。上述文獻中討論了用獼猴產生單克隆抗體的內在優點。具體地說，這種猴，即cynomolgus猴可被免疫以抗人抗原或受體。另外，根據Newman等，生物技術，10，1455-1460(1992)和Newman等於1995年1月25日提交的共同轉讓的美國流水號08/379,072的方法學可將所得抗體用於製備靈長化抗體，上述兩篇文獻的全文列入本文作為參考。
得自cynomolgus猴的抗體的顯著優點是這些猴可將很多人蛋白質識別為外源蛋白質，從而形成抗體，一些抗體對所需人抗原，如人表面蛋白和細胞受體具有高親和性。另外，由於它們在系統發育上與人接近，所得抗體表現出與人體內產生的抗體具有高水平的胺基酸同源性。如上所述，對獼猴免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區基因進行測序之後，可發現各個基因家族的序列與其人對應物85-88％同源(Newman等，(1992)，文獻同上)。
實質上，給cynomolgus獼猴施用人B7抗原，如人B7.1和/或人B7.2抗原，從中分離B細胞，如從動物體內取淋巴結活檢，然後使用聚乙二醇(PEG)將B淋巴細胞與KH6/B5(小鼠×人)異源骨髓瘤細胞融合。鑑定可分泌與人B7抗原，如人B7.1和/或人B7.2抗原結合的抗體的異源雜交瘤。
與B7.1和B7.2都能結合的抗體是合乎需要的，因為這種抗體可用於抑制B7.1和B7.2，以及B7與其反受體即人CTLA-4和CD28的相互作用。針對這些表位的抗體可抑制人B7.1和人B7.2與其位於T細胞上的反受體的相互作用，這可以提供協同作用。
然而，僅與人B7抗原之一，B7.1抗原或B7.2抗原結合的抗體也是很合乎需要的，因為這些分子共同參與T細胞活化，克隆擴增，淋巴因子(IL-2)分泌和對抗原的反應。假定人B7.1和B7.2都與人CTLA-4和CD28結合，可能至少存在一個共用或同源的區域(可能是共享的構象表位或表位)，針對該區域可產生獼猴抗體。
本發明涉及使用經致敏可產生特定抗體的動物。可用於此方法的動物包括但不限於下列小鼠，大鼠，豚鼠，倉鼠，猴，豬，山羊和兔。
在共同擁有的共待審美國專利申請流水號08/488,376中公開了使用SCID小鼠產生人抗體的優選方法。
本發明人決定使用重組的可溶性B7.1抗原免疫獼猴以抗人B.1抗原，所述抗原在CHO細胞中產生，並通過使用L307.4-瓊脂糖凝膠親和柱的親和層析得以純化。然而，對人B7抗原，人B7.1抗原或人B7.2抗原的特定來源並無苛求，只要它的純度足以導致針對特別施用的B7抗原和其它B7抗原的特異性抗體反應即可。
人B7抗原，人B7.1抗原(也稱為CD80)和人B7.2抗原(也稱為CD86)基因已被克隆並測序，因此通過重組方法易於製備。
優選施用可溶形式的人B7抗原，人B7.1抗原和/或人B7.2抗原，例如通過表達除去跨膜區和胞質區，而只留下胞外部分，即胞外超家族V和C-樣區域的B7，B7.1或B7.2基因(例見Grumet等，人類免疫學，40(3)，p228-234，1994，該文獻教導了可溶形式的人B7的表達，其全文列入本文作為參考)。
在導致抗原特異性抗體產生的條件下，用B7，B7.1和/或B7.2抗原，優選用其可溶形式免疫獼猴。優選可溶形式的人B7，B7.1或B7.2抗原與佐劑聯合使用，所述佐劑如完全弗氏佐劑(CFA)，明礬，皂苷或其它已知佐劑，以及它們的聯合。一般需要重複免疫幾個月，如通過重複注射。例如，施用可溶性的B7.1抗原與佐劑，在3至4個月內進行加強免疫，結果產生的血清中含有與人B7.1抗原結合的抗體。
免疫後，通過例如從經免疫的動物體內取淋巴結活檢以收集B細胞，然後使用聚乙二醇將B淋巴細胞與KH6/B5(小鼠×人)異源骨髓瘤細胞融合。製備這種異源骨髓瘤的方法是已知的，例見Newman等人於1995年1月25日提交的美國流水號08/379,072(列入本文參考文獻)。
鑑定可分泌與人B7抗原，B7.1和/或B7.2結合的抗體的異源雜交瘤。通過已知技術可實現這一目的，例如，通過ELISA或使用酶或放射性核苷酸標記的人B7，B7.1和/或B7.2抗原的放射性免疫測定法可測定該雜交瘤。
然後將分泌抗體的細胞系亞克隆至單克隆狀態，所述抗體對人B7，B7.1和/或B7.2抗原具有所需的特異性。
在本發明中，本發明人篩選純化的抗體與ELISA試驗中被可溶性B7.1抗原包被的培養板，抗原陽性的B細胞和在其細胞表面表達人B7.1抗原的CHO轉染瘤結合的能力。另外，篩選抗體阻斷B細胞/T細胞相互作用的能力，所述能力由IL-2產生和混合淋巴細胞反應(MLR)中氚化胸苷的攝取測定，使用125I-放射性標記的可溶性B7.1(SB7.1)檢測B7結合。
而且，檢測了來自獼猴的親和純化的抗體對表達B7.1/Ig融合蛋白的CHO轉染子以及對產生人B7.2抗原的CHO細胞的反應性。這些結果表明B7.1免疫血清與B7.2轉染瘤結合。可使用可溶性的B7.2-Ig試劑證實抗體與B7.2抗原的結合。如實施例所討論的，這可通過從CHO轉染瘤中產生和純化足夠量B7.2-Ig以製備B7.2-Ig-瓊脂糖親和柱來完成。與B7.2交叉反應的那些抗體將與B7.2-Ig-瓊脂糖柱結合。
接著基本上如Newman等(1992)，文獻同上和Newman等人於1995年1月25日提出的美國專利流水號379,072所述，用表達特異性地與人B7抗原、B7.1抗原和/或B7.2抗原結合的抗體的細胞系克隆用於製備靈長化抗體的可變區序列，其中這兩篇文獻被本文引作參考。這基本上需要從中提取RNA，轉變為cDNA和通過使用Ig特定引物的PCR的擴增。適宜的引物描述在Newman等，1992，文獻同上和美國流水號379,072中(尤其參見美國流水號379,072的圖1)。
接著將克隆的猴的可變基因插入到包含人重鏈和輕鏈恆定區基因的表達載體中。這優選通過使用IDEC公司稱為NEOSPLA的專利表達載體來進行。該載體示於圖2中，包含巨細胞病毒啟動子/增強子、小鼠β珠蛋白主要啟動子、SV40複製起點、牛生長激素聚腺苷酸化系列、新黴素磷酸轉移酶外顯子1和外顯子2、人免疫球蛋白k或λ恆定區、二氫葉酸還原酶基因、人免疫球蛋白γ1或γ4 PE恆定區和前導序列。通過摻入猴可變區基因，在CHO細胞中轉染，接著在含G418培養基中選擇以及氨甲喋呤擴增，發現該載體導致極高水平的靈長化抗體的表達。
例如，以前已公開了這種表達系統產生具有高的針對CD4和其它人細胞表面受體的親和力(Kd≤10-10M)的靈長化抗體。而且，發現抗體顯示與初始猴抗體相同的親和性、特異性和功能活性。該載體系統基本上公開在被本文引作參考的共同轉讓的美國專利流水號379,072以及全文也被本文引作參考的1993年11月3日提出的美國流水號08/149,099中。該系統提供高的表達水平，即＞30pg/細胞/天。
如下文所討論的，本發明人選擇了四種最重要的特異性與B7.1抗原結合的代表性的猴單克隆抗體。這些猴單克隆抗體在本文被稱為7B6、16C10、7C10和20C9。
如下文更詳細地討論，通過測定在用於T細胞結合的T細胞結合實驗的混合淋巴細胞反應中的IL-2的產生以及氚化胸苷的攝取評價這些抗體阻斷B細胞/T細胞相互作用的能力，在存在PHA刺激物下，將人淺黃色層的外周血淋巴細胞培養3-6天。使用125I-放射性標記的可溶性B7.1放射性分析B7的結合。如通過減少的IL-2的產生和減少的混合淋巴細胞培養物的增殖所證實的，觀察到的結果表明所有這些抗體高親和性地與B7.1抗原結合併有效地阻斷B細胞/T細胞相互作用。
這些特定的猴單克隆抗體的特性總結如下1.Scatchard分析表明與B7-Ig包被的平板結合的猴抗體的表觀親和常數(Kd)大約為a7C10 6.2×10-9Mb16C108.1×10-9Mc7B6 10.7×10-9Md20C9 16.8×10-9M2.在混合淋巴細胞反應試驗(MLR)中體外檢測抗體。如下面IC50值所示，MLR表明所有4種抗-B7.1抗體不同程度地抑制IL-2的產生a7B65.0ug/Mb16C10 ＜0.1ug/Mc20C9 20.ug/Md7C10 5.0ug/M3.檢測猴抗-B7.1抗體與人外周血淋巴細胞(PBL)中的B7的結合能力。FACS分析表明所有4種猴的抗體檢測為陽性。
4.通過FACS分析檢測猴抗體16C10、7B6、7C10和20C9的C1q結合。結果表明在與B7.1CHO轉染細胞一起保溫後，7C10猴Ig具有強的人C1q結合。16C10為陽性，而20C9和7B6猴抗體為陰性。
5.為了選擇用於途徑-毒性研究的動物模型，用來自不同種類的動物血檢測猴抗體。證實猴抗-B7.1抗體與人，黑猩猩發生交叉反應。
基於這些特性，顯然三種猴單克隆抗體，16C10、7C10和20C9擁有最有利的特性，16C10和7C10在某種程度上優於20C9。
使用上文以及共同轉讓的美國流水號08/379,072描述的技術，本發明人克隆了7C10、7B6和16C10的可變區，提供了靈長化形式的7C10輕鏈、7C10重鏈、7B6輕鏈、7B6重鏈、16C10輕鏈和16C10重鏈的胺基酸和核酸序列。可在圖3a和3b、4a和4b、5a和5b中找到這些胺基酸和核酸序列。可在08/379,072中知曉人γ1、γ4恆定區的DNA和胺基酸序列。
如上文所討論的，使用基本上描述在共同轉讓的08/379,072和08/149,099中並由圖2所示的NEOSPLA表達載體表達這些靈長化抗體，其中這兩篇申請被本文引作參考。
如前面所提到的，本發明靈長化抗體優選包含人免疫球蛋白γ1或γ4恆定區，優選γ4在兩個位置發生突變以產生γ4 PE。γ4 PE突變體包含兩個突變，被導入以除去殘餘的FCR結合的CH2區中的穀氨酸以及打算增強重鏈二硫鍵相互作用穩定性的絞鏈區的脯氨酸置換(參見Alegre等，免疫學雜誌，148，3461-3468(1992)；和Angel等，分子免疫學，30，105-158，(1993)，它們均被本文引作參考)。
本發明的靈長化抗體是否包含γ1、γ4或γ4 PE恆定區極大地取決於特定的疾病靶。優選產生和檢測針對特定疾病靶的清除和非清除靈長化IgG1和IgG4抗體。
本發明的猴單克隆抗體具有所述結合和功能特性，因此這些抗-B7.1單克隆抗體和其靈長化的形式應非常適宜作為用於阻斷B7CD28相互作用從而提供免疫抑制的治療劑。尤其是，已知其具有對B7.1抗原的高親和性和阻斷B細胞/T細胞相互作用的能力(由混合淋巴細胞培養物中的IL2產生和氚化的胸苷的攝取表示)以及有效抑制供體脾細胞培養物中抗原驅動應答的能力(表現為降低的抗原特異性IgG應答、IL-2的產生)，這些猴單克隆抗體和其靈長化形式應起著調節B7CD28途徑的有效的免疫抑制劑的作用。這對於治療其中免疫抑制為治療所希望的以抑制不希望的抗原特異性IgG應答的許多疾病，例如自身免疫病是非常重要的，並且還對於預防器官排異作用和移植物抗宿主疾病也是非常重要的。本發明的抗體基本上可用於治療其中B7CD28途徑的抑制是治療所希望的任何疾病。
本發明的抗B7.1抗體的主要治療適應症包括例如自身免疫病，如特發性血小板減少性紫癜(ITP)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、I型糖尿病、多發性硬化、再生障礙性貧血、銀屑病、變態反應、炎性膽汁病和類風溼性關節炎。
本發明抗-B7.1抗體的其它重要的治療適應症為用於預防器官移植和骨髓移植(BMT)期間的移植物抗宿主疾病(GVHD)。本發明的抗體可被用來誘導宿主對供體特異性同種抗原的耐受性並從而便於移植和降低移植物排斥的發生率。在同種心臟移植的小鼠模型中已表明CTLA4-Ig的靜脈內給藥可導致免疫抑制或甚至誘導對同種抗原的耐受性(Lin等，實驗醫學雜誌1781801，1993；Torka等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 8911102，1992)。預期本發明的靈長化抗-B7.1抗體將顯示類似或更大的活性。
可通過在功能性生物分析中用於鑑定的親和層析以及大小排阻層析的結合來純化以上述方法或通過等同的方法製備的抗體。這些分析包括確定特異性和結合親和性以及與表達同型，例如ADCC相關的效應物功能或補體固定。這些抗體可被用作針對許多人類疾病的被動或主動治療劑，包括B細胞淋巴瘤、傳染病，包括病毒疾病，如HIV/AIDS、自身免疫和炎性疾病以及移植。抗體可以其天然形式或作為抗體/螯合劑、抗體/藥物或抗體/毒素複合物的一部分來使用。另外，全抗體或抗體片段(Fab2、Fab、Fv)可被用作用於抗獨特型反應的主動免疫治療中的顯象劑或用作可能的疫苗或免疫原。
可通過本領域普通技術人員熟知的標準技術確定可用於產生治療效果的抗體的量。通常通過標準方法以藥物可接受的緩衝液來提供抗體，並可通過任何所需途徑給藥。由於本文要求的抗體的功效和人對其的耐受性，為了與人的各種疾病或疾病狀態抗爭，可以重複施用這些抗體。
本發明的抗-B7.1抗體(或其片段)可用於誘導免疫抑制，即誘導人或動物免疫系統的抑制。本發明因此涉及一種通過給人或其它動物施用有效無毒量的本發明的這種抗體來在需要它的人或其它動物中預防或治療性地誘導免疫抑制的方法。
本發明化合物誘導免疫抑制的能力已在用於此目的的標準試驗中得以證實，例如混合淋巴細胞反應試驗或測定由胸苷攝取測得的T細胞增殖抑制試驗。
本發明的抗體可用於誘導免疫抑制的事實表明它們應可用於治療或預防對移植器官或組織(例如腎、心臟、肺、骨髓、皮膚、角膜等)的抗性或排斥作用；治療或預防自身免疫、炎性、增殖和增殖過度疾病以及表現在皮膚的免疫介導的疾病(例如類風溼性關節炎、盤狀紅斑狼瘡、系統性紅斑狼瘡、Hashimotos甲狀腺炎、多發性硬化、重症肌無力、I型糖尿病，眼色素層炎、腎病綜合症、銀屑病、特應性皮炎、接觸性皮炎和其它溼疹性皮炎、脂溢性皮炎、扁平苔癬、天皰瘡、大皰天皰瘡、表皮鬆解性大皰、蕁麻疹、血管水腫、脈管炎、紅斑、皮膚嗜曙紅細胞增多、簇狀脫髮等)；可逆性氣管阻塞疾病、腸炎和過敏反應(例如炎性膽汁病、腹腔疾病、直腸炎、嗜曙紅細胞增多胃腸炎、肥大細胞病、節段性迴腸炎和結腸潰瘍)、與食物有關的過敏反應(例如偏頭痛、鼻炎和溼疹)以及其它類型的過敏反應。
本領域技術人員能通過常規實驗確定用於誘導免疫抑制目的的抗體的有效無毒量將是多少。然而，有效劑量通常為約0.05-100mg/kg體重/天的範圍。
本發明的抗體(或其片段)還應可用於治療哺乳動物腫瘤。更具體地說，它們應可用於降低腫瘤大小、抑制腫瘤生長和/或延長荷瘤的動物的存活時間。因此，本發明還涉及一種通過對這些人或動物給予有效無毒量的抗體來治療人或動物腫瘤的方法。本領域技術人員能通過常規實驗確定用於治療致癌腫瘤目的的抗-B7抗體的有效無毒量將是多少。然而，有效劑量通常被預計為約0.05-100mg/kg體重/天的範圍。
根據前述的治療方法，可以足以在治療或預防水平上產生這種效果的量給人或動物施用本發明的抗體。可以根據已知技術通過將本發明的抗體與常規的藥物可接受的載體或賦形劑混合而製備的常規劑型對這些人或動物給予本發明的抗體。本領域技術人員將認識到藥物可接受的載體或賦形劑的形式或特性由將與其混合的活性成分的量、給藥途徑以及其它熟知的可變因素來決定。
本發明抗體(或其片段)的給藥途徑可為口服、胃腸外、通過吸入或局部途徑。本文使用的術語胃腸外包括靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、直腸或陰道給藥。通常優選皮下和肌肉內形式的胃腸外給藥。
採用本發明化合物以預防或治療性地誘導免疫抑制或治療性地治療致癌腫瘤的每日胃腸外和口服劑量通常為約0.05-100mg/kg體重/天的範圍，但優選0.5-10mg/kg體重/天。
還可通過吸入給予本發明的抗體。經「吸入」指鼻內和口吸入給藥。可通過常規技術製備用於這種給藥的適宜劑型，如氣霧劑或定量吸入劑。將採用的本發明化合物的優選劑量通常為約10-100mg/體重/天的範圍內。
還可局部給予本發明的抗體。經局部給藥指非全身性地給藥，包括將本發明的抗體化合物(或其片段)經外部施用於表皮、頰腔和將該抗體滴入耳、眼睛和鼻中，並且其中它不大量進入血流中。經全身給藥指口服、靜脈內、腹膜內和肌肉內給藥。當然用於治療或預防效果所需的抗體量將隨選擇的抗體、治療疾病的性質和嚴重性以及進行治療的動物而變化，並最終取決於醫生的決定。本發明抗體的適宜的局部劑量通常為約1-100mg/體重/天的範圍內。
製劑雖然可單獨給予抗體或其片段，但可優選以藥物製劑的形式提供。對於局部給藥，活性成分可包括製劑的0.001％-10％(w/w)，如1％-2％(重量計)，雖然它可包括多達製劑的10％(w/w)，但優選不超過5％(w/w)，較優選為0.1％-1％(w/w)。
本發明的局部製劑包含活性成分和一種或多種可接受的載體和任選任何其它的治療成分。載體必須是在與其它製劑成分相容的意義來講為可接受的並對其賦形劑無害。
適宜於局部給藥的製劑包括適宜於透皮到達需要治療的部位的液體或半液體製劑，如搽劑、洗劑、乳油、軟膏或糊劑以及適宜於施用於眼、耳或鼻的滴劑。
根據本發明的滴劑可包含無菌水性或油狀溶液劑或懸浮劑，並可通過將活性成分溶解在殺菌和/或殺真菌劑和/或任何其它適宜的防腐劑的適宜水溶液中來製備，優選包括表面活性劑。可接著將產生的溶液通過過濾澄清，轉移至適宜的容器中，該容器接著被密封，通過高壓滅菌殺菌或在90-100℃下保持半小時。另外，溶液可通過過濾除菌並通過無菌技術轉移至容器中。適宜於包含在滴劑中的殺細菌和殺真菌劑的實例為硝酸汞苯或乙酸汞苯(0.002％)、苄扎氯銨(0.01％)和醋酸洗必泰(0.01％)。用於製備油狀溶液劑的適宜的溶劑包括甘油、稀釋的乙醇和丙二醇。
根據本發明的洗劑包括適宜於施用至皮膚或眼睛的那些。眼洗劑可含有任選包含殺菌劑的無菌水溶液，並可通過與製備滴劑類似的方法來製備。施用於皮膚的洗劑或搽劑還可包括促進皮膚乾燥或冷卻的物質，如醇或丙酮，和/或保溼劑，如甘油或油，如蓖麻油或花生油。
根據本發明的乳油、軟膏或糊劑為用於外部施用的活性成分的半固體製劑。它們可在適宜機器的輔助下，通過將磨得很細的或粉狀的活性成分單獨或其水溶液、含水或不含水液體的懸浮液與油脂或非油脂基質混合來製備。基質可包含烴，如硬、軟或液體石蠟、甘油、蜂蠟、金屬皂；膠漿；天然來源的油，如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄欖油；羊毛脂或其衍生物，或脂肪酸，如硬脂酸或油酸以及醇，如丙二醇或聚乙二醇。製劑可摻入任何適宜的表面活性劑，如陰離子、陽離子或非離子表面活性劑，如脫水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。還可包含懸浮劑，如天然樹膠、纖維素衍生物或無機礦物質，如蛟狀矽膠和其它成分，如羊毛脂。
也可將本發明的抗-B7.1抗體或其片段與調節B7CD28途徑的其它物質結合施用。這些物質包括例如細胞因子，如IL-7、IL-10、CTLA4-Ig、可溶性CTLA-4和抗-CD28抗體和其片段。而且，本發明的抗體可與其它免疫抑制劑一起施用。這些免疫抑制劑包括小分子，如環孢菌素A(CSA)和FK506；單克隆抗體，如抗腫瘤壞死因子a(抗-TNFa)、抗-CD54、抗-CD11、抗-CD11a以及抗-IL-1；和其它可溶性受體，如rTNFa和rIL-1。
本領域技術人員將理解本發明抗體或其片段的單劑的最佳量和間隔將由治療疾病的性質和程度，給藥的形式、途徑和部位以及治療的具體的動物來決定，並且這些的最佳值可通過常規技術確定。本領域技術人員還將理解治療的最佳過程，即在指定的天數裡每天提供的本發明的抗體或其片段的劑量數，可由本領域技術人員使用常規的治療確定試驗方法來確定。
無需進一步的詳細描述，認為本領域技術人員可利用前面的描述來最大程度地使用本發明。因此，下面的製劑被認為僅僅是為說明的具體實例，決不限制本發明的範圍。
膠囊劑組合物通過用50mg粉末形式的本發明的抗體或其片段，100mg乳糖，32mg滑石和8mg硬脂酸鎂填充標準的兩片硬膠囊來製備膠囊劑形式的本發明的藥物組合物。
注射用胃腸外組合物通過將1.5％(重量計)的本發明的抗體或其片段在10％(體積計)的丙二醇和水中攪拌來製備為適宜於注射給藥形式的本發明的藥物組合物。將溶液過濾除菌。
軟膏組合物本發明的抗體或其片段 1.0g白軟石蠟 100.0g將本發明的抗體或其片段分散在少量體積的賦形劑中以產生光滑均勻的產物。接著將分散液填入金屬軟管中。
局部乳油組合物本發明的抗體或其片段 1.0gPolawax GP 200 20.0g無水羊毛脂 2.0g白蜂蠟 2.5g羥基苯甲酸甲酯 0.1g加蒸餾水至 100.0g60℃下，將polawax、蜂蠟和羊毛脂一起加熱。加入羥基苯甲酸甲酯溶液並使用高速攪拌實現均化。接著讓溫度降至50℃。然後加入本發明的抗體或其片段，充分分散，低速攪拌下讓組合物冷卻。
局部洗劑組合物本發明的抗體或其片段1.0g脫水山梨糖醇一月桂酸酯 0.6g多乙氧基醚200.6g十六硬脂基醇1.2g甘油6.0g
羥基苯甲酸甲酯 0.2g加純化水B.P.至100-00ml。(B.P.＝英國藥典)75℃下，將羥基苯甲酸甲酯和甘油溶解在70ml水中。75℃下，將脫水山梨糖醇一月桂酸酯、多乙氧基醚20、十六硬脂基醇一起熔化，並加至水溶液中。均化產生的乳狀液，連續攪拌下讓其冷卻，以在剩餘水中的懸浮液的形式加入本發明的抗體或其片段。攪拌整個懸浮液直至均化。
眼滴劑組合物本發明的抗體或其片段 0.5g羥基苯甲酸甲酯 0.01g加純化水B.P.至100-00ml。
75℃下，將羥基苯甲酸甲酯和羥基苯甲酸丙酯溶解在70ml純化水中，並讓產生的溶液冷卻。接著加入本發明的抗體或其片段，將溶液經膜濾器(0.022um孔徑)過濾除菌，無菌分裝至適宜的無菌容器中。
用於吸入給藥的組合物對於15-20ml容量的氣霧劑容器將10mg本發明的抗體或其片段與0.2-0.5％潤滑劑，如多乙氧基醚85或油酸混合，並將該混合物分散在在推進劑如氟裡昂中，優選在(1，2二氯四氟乙烷)與二氟氯甲烷的混合物中，並放入用於鼻內或口吸入給藥的合適的氣霧劑容器中。
用於吸入給藥的組合物對於15-20ml容量的氣霧劑容器將10mg本發明的抗體或其片段溶解在乙醇中(6-8ml)，加入0.1-0.2％的潤滑劑，如多乙氧基醚85或油酸；並將該混合物分散在推進劑如氟裡昂中，優選在(1，2二氯四氟乙烷)與二氟氯甲烷的混合物中，並放入用於鼻內或口吸入給藥的合適的氣霧劑容器中。
本發明的抗體和藥物組合物尤其可用於胃腸外給藥，即皮下、肌肉內或靜脈內。用於胃腸外給藥的組合物通常包含溶解在可接受載體，優選含水載體中的本發明的抗體或其片段或其混合物的溶液。可採用各種含水載體，例如水、緩衝水溶液、0.4％鹽溶液、0.3％甘氨酸溶液等。這些溶液為無菌的並通常不含顆粒物。可通過常規熟知的滅菌技術將這些溶液滅菌。組合物可包含近似於生理條件所需的藥物可接受的輔助物質，如pH調節劑和緩衝劑等。該藥物製劑中的本發明的抗體或其片段的濃度可廣泛地變化，即從小於約0.5％，通常等於或小於約1％至15％或20％(重量計)，並將根據所選擇的特定的給藥方式主要基於液體的體積、粘度等來進行選擇。
因此，用於肌肉內注射的本發明的藥物組合物可被製備成包含1Ml無菌的緩衝水溶液和50mg本發明的抗體或其片段。類似地，用於靜脈內輸注的本發明的藥物組合物可被製備成包含250ml無菌Ringer溶液和150mg本發明的抗體或其片段。用於製備胃腸外給藥的組合物的有效方法對於本領域技術人員來講是熟知或顯然易見的，其被更詳細地描述在例如Remington’s藥物科學，第15版，Mack出版公司，Easton，Pennsylvania，其被本文引作參考。
本發明的抗體(或其片段)可被冷凍乾燥以用於儲存，並在使用前重新配製。該技術已表明對常規的免疫球蛋白有效，可採用本領域熟知的冷凍乾燥以及重新配製技術。
取決於預期的結果，可將本發明的藥物組合物用於預防和/或治療性治療中。在治療性應用中，對已患有疾病的病人施用足以治療或至少部分抑制疾病和其併發症的量的組合物。在預防性的應用中，對未處於疾病狀態的病人施用含有本發明抗體或其混合物的組合物以增強病人的抵抗力。
可使用治療醫生選擇的劑量水平和方式進行藥物組合物的一次或多次給藥。在任何情況下，本發明的藥物組合物應提供足以有效治療病人的量的改變的抗體(或其片段)。
還應注意到本發明的抗體可被用於將可用於與抗體相同的治療中的肽或非肽化合物(模擬物)的設計和合成中。參見例如Saragovi等科學，253，792-795(1991)。
為了進一步說明本發明，提供下面的實施例。這些實施例不打算或被認為是對本發明的進一步的限定。
實施例1絲狀噬菌體表面展示的重組免疫球蛋白文庫首次由McCafferty等，自然，348552-554，1990和Barbas等Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 887978-7982，1991描述。使用該技術，已從免疫人重組文庫分離了高親和性的抗體(Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 58910164-10168，1992)。雖然所採用的噬菌體展示的情況基本上與由Barbas，1991，文獻同上描述的類似，但通過置換用於猴文庫的特有的載體以降低重組的可能性和增強穩定性改進了該技術。圖1中的載體pMS包含一個用於多順反子重鏈和輕鏈猴DNA的有效轉錄和轉譯的lac啟動子/操縱子。該載體包含兩個不同的前導序列，對於輕鏈的ompA(Movva等，生物化學雜誌，25527-29，(1980))和對於重鏈Fd的pel B(lei，細菌學雜誌，4379-1094383(1987))。兩個前導序列被轉譯成控制重鏈和輕鏈克隆產物分泌至周質空間的疏水性的信號肽。在周質的氧化環境中，兩條鏈摺疊並形成二硫鍵以產生穩定的Fab片段。我們從噬菌粒bluescript得到載體的主要成分(Stratagene，La Jolla，CA)。它包含將氨苄青黴素抗性(羧苄青黴素)傳給含有pMS DNA的細菌的β-內醯胺酶基因。我們還從bluescript中獲得多拷貝質粒ColE1的複製起點和絲狀噬菌體f1的複製起點。噬菌體f1的複製起點(所稱的基因內區段)提供引發單鏈pMS DNA的合成、引發粘粒的形成以及通過病毒酶終止RNA合成的信號。pMS DNA鏈複製和裝配至噬菌體顆粒中需要必須由輔助噬菌體提供的病毒蛋白。由於它也含有編碼卡那黴素抗性的基因，因此，我們使用特別適宜於它的輔助噬菌體VCSM13。可通過向培養基中加入卡那黴素和羧苄青黴素來選擇被VCSM13和pMS感染的細菌。細菌將最終產生含有pMS或VCSM13基因組的絲狀噬菌體顆粒。輔助噬菌體的包裝不如pMS有效，產生主要包含重組pMS噬菌體的混合噬菌體群。噬菌體的末端選取各末端特異性的小包被蛋白。這裡尤為感興趣的是在噬菌體一個末端以3-5個拷貝存在的基因III產物。基因III產物為406個胺基酸殘基並為藉助於F菌毛的噬菌體感染大腸桿菌所需要。將重鏈的開始兩個區，可變區和CH1區在羧基末端與基因III蛋白一半融合。受pel B前導序列的控制，該重組菌毛蛋白被分泌到周質中，在被摻入到噬菌體外殼之前，菌毛蛋白在此處積累並與輕鏈形成二硫鍵。而且，另一個載體包含被改造位於基因III下遊的FLAG序列。FLAG為在Fd蛋白的羧基末端表達的8個胺基酸肽。我們使用市場上可購得的單克隆抗FLAG M2通過ELISA來純化和檢測噬菌體Fab(Brizzard，生物技術，16(4)730-731，(1994))。
在構建載體pMS後，我們使用對照抗體基因檢測了其產生噬菌體結合Fab的能力。我們將抗破傷風類毒素抗體(從Carlos Barbas博士獲得)克隆至pMS中並轉化XLI-blue。我們用VCSM共轉染我們的細胞，產生展示抗破傷風類毒素抗體的噬菌體。我們進行有效的實驗，其中抗破傷風類毒素噬菌體與形成珠狀不相關抗體的噬菌體以1∶100,000混合。我們通過將50ul混合噬菌體加至被抗原(破傷風類毒素)包被的聚苯乙烯孔中進行了三輪淘選。洗去未粘附的噬菌體，將粘附的噬菌體用酸洗脫。洗脫的噬菌體被用來感染XLI-Blue細菌的新鮮的等份試樣並加入輔助噬菌體。過夜擴增後，製備噬菌體並再次在被抗原包被的平板上淘選。三輪淘選後，我們能表明我們已成功地富集了抗破傷風類毒素噬菌體。該方法的成功還取決於製備可溶性的用於表徵最後淘選產物的Fab的能力。這通過使用限制酶NheI從pMS DNA中切除基因III並接著重新連接來實現。在切除基因III後，在噬菌體表面不再出現Fab，但在周質空間中積累。從表達可溶性Fab的細菌製備溶菌產物並使用ELISA檢測抗原特異性。檢測到了高水平的可溶性Fab。
為了使噬菌體展示技術適用於獼猴文庫，我們開發了用於PCR擴增獼猴免疫球蛋白基因的特異性引物。這些是基於我們開發PRIMATIXED抗體技術(參見被本文引作參考的08/379,072)和含有人序列的資料庫(Kabat等，(1991)，「免疫感興趣的蛋白的序列」US Dept.of Healthand Human Services，國立衛生研究院)時獲得的獼猴序列。
我們開發了三組覆蓋獼猴所有組成成分擴增的引物。我們第一組引物被設計用於重鏈VH和CH1(Fd)區的擴增。它由一個3』CH1區引物和6個結合在框架1區中的5』VH族特異性引物組成。我們第二組用於擴增整個λ鏈的引物包括許多λ鏈亞組。它由一個3』引物和3個結合在VL框架1區中的5』簡併引物組成。我們第三組引物被設計用於k鏈亞組的擴增。它由一個3』引物和5個VK框架1引物組成。使用每一組引物，優化PCR參數以從各引物對獲得足夠強的信號以致可獲得用於文庫克隆的足夠的材料。使用這些優化的PCR條件，我們最近在pMS載體中製備了獼猴重組文庫。從作為免疫球蛋白RNA來源的CD4免疫獼猴獲取骨髓活組織。文庫包含約106個成員，並正在抗原包被的孔中用特異性結合劑淘選。
實施例2B7/CTLA-4試劑的製備我們製備了許多用於免疫獼猴、進行體外結合和功能性分析，篩選異源雜交瘤和淘選噬菌體文庫目的的試劑。表1列出了每一種試劑和其預期目的。在B7.1的情況下，從SB細胞中提取RNA，使用逆轉錄酶轉變成cDNA。使用B7.1特異性引物將第一鏈cDNA進行PCR擴增並克隆至IDEC』S NEOSPLA哺乳動物表達載體中。用B7.1 NEOSPLA DNA轉染CHO細胞，確定表達膜相關B7.1的克隆。類似地產生B7.1融合蛋白，不同之處是將PCR擴增的B7.1基因克隆至含有人CH2和CH3免疫球蛋白基因的NEOSPLA盒載體中。用B7.1/Ig NEOSPLA DNA轉化CHO細胞，擴增分泌B7.1/Ig融合蛋白的穩定的克隆。通常，以相同方式產生B7.2和CTLA4試劑，不同之處是對於B7.2，從已用抗Ig和IL-4刺激24小時的人脾細胞中分離RNA，對於CTLA4構建物，基因來源為PHA活化的人T細胞。
表1
這些試劑和B7.1(L3074)(Becton Dickinson，1994)和B7.2(Fun-l等，血液，84，1402-1407，(1994))的單克隆抗體以及特異性的開發以檢測獼猴Fab片段的純化的山羊和兔抗血清的獲得有助於鑑定具有所需性質的抗體。
實施例3噬菌體展示文庫的產生從B7.1和B7.2免疫獼猴產生重組噬菌體展示文庫。在免疫7-12天後，進行淋巴結和骨髓活組織檢查以收集富含RNA的B細胞和漿細胞。使用Chomczynski分析生物化學，162(1)，156-159，(1987)描述的方法從淋巴細胞中分離RNA。使用寡dT引物和逆轉錄酶將RNA轉化為cDNA。將第一鏈cDNA分成等份試樣，使用數組前面描述的k、λ和重鏈Fd區引物和Pfu聚合酶(Stratagene，San Diego)或Taq聚合酶(Promega，Madison)進行PCR擴增。收集重鏈PCR擴增產物，用Xho Vspe I限制酶切割並克隆至載體pMS中。隨後，收集輕鏈PCR產物，用Sac I/XbaI限制酶切割，並克隆以產生重組文庫。將XLI-Blue大腸桿菌用文庫DNA轉化並用VCSM13超感染以產生噬菌體展示抗體。在用B7.1或B7.2抗原包被的聚苯乙烯孔中將文庫淘選四輪。分析來自每輪淘選的噬菌體克隆。分離pMS載體DNA，切除基因III。產生可溶性的Fab片段，用ELISA檢測與B7.1和B7.2的結合。
實施例4噬菌體Fab片段的表徵確定獼猴噬菌體Fab片段的阻斷B7.1-Ig和B7.2-Ig與CTLA-4-Ig或CTLA-4轉染細胞結合的特異性和能力。還確定了在對用於免疫的B7種類的4輪淘選中的第一次淘選後噬菌體片段的交叉反應性以選擇高親和性的片段。通過感染並在大腸桿菌的24小時發酵培養基中培養擴增從對B7.1或B7.2抗原包被表面的4輪淘選確定的Fab片段。將片段通過與抗FLAG親和柱結合的Kodak FLAG純化。通過基於ELISA的定向結合修飾的Scatchrd分析(Katoh等，化學與生物工程雜誌，76451-454，(1993))，使用羊抗獼猴Fab抗體或與辣根氧化物酶結合的抗FLAG MAb檢測純化的噬菌體Fab的親和性。抗獼猴Fab試劑將被吸附來抗人重鏈恆定區Ig以除去融合與B7-Ig的交叉反應。在測定與B7.1-Ig或B7.2-Ig包被平板的直接結合後，計算各片段的Kd值。
實施例5噬菌體Fab片段阻斷CTLA-4/B7結合在最低濃度下最有效地阻斷B7-Ig結合的Fab片段被選擇作為前導代表。通過125I-B7-Ig與CTLA-4-Ig或CTLA-4轉染細胞的結合競爭來進行選擇。另外的選擇標準包括如通過抑制效應細胞中的3H-胸苷的攝取和使用IL-2分析試劑盒對IL-2產生進行直接分析而測得的混合淋巴細胞反應(MLR)的阻斷(Azuma等，實驗醫學雜誌，177845-850；Azuma等，自然，30176-79，(1993))。在抑制MLR和CTLA-4結合的測定中最有效的三或四種代表物被選擇用於克隆至轉染到CHO細胞中並表達嵌合猴/人抗體的上述哺乳動物表達載體中。
實施例6猴異源雜交瘤的產生從其血清被檢測為B7.1和/或B7.2陽性的存活免疫動物中產生分泌單克隆抗體的猴異源雜交瘤。從對一種或兩種抗原為陽性的動物中獲取淋巴結活組織。雜交瘤產生的方法類似於已建立的用於產生猴抗CD4抗體的方法(Newman，1992(Id))。麻醉下切下具有高血清效價的獼猴的腹股溝淋巴結部分。從組織中洗出淋巴細胞並使用聚乙二醇(PEG)與KH6/B5異源骨髓瘤細胞融合(Carrol等，免疫方法雜誌，8961-72(1986))。在H.A.T.培養基中選擇雜交瘤並通過在96孔平板中重複亞克隆進行穩定。
篩選B7.1抗原特異性的獼猴單克隆抗體的對B7.2的交叉反應性。使用125I-B7-Ig結合測定來確定獼猴抗B7抗體對B7/CTLA-4結合的阻斷。通過3H-胸苷攝取以及直接測定L-2產生確定的MLR抑制被用來選擇三種代表物。在重複所有功能性實驗時，兩種代表物被用於II期研究中並在CHO細胞中表達。為了開發用於體內藥物學的動物模型的目的，在幾種動物種類的細胞中檢測抗B7抗體。動物模型的建立就使得能進行臨床前研究以用於選擇的臨床適應症。
實施例7如上文所討論的，使用上面的異源雜交瘤方法，確定4種主要的猴抗B7.1抗體16C10、7B6、7C10和20C9。這些抗體被表徵如下Dcatchard分析表明，猴抗體結合B7-Ig包被平板的表觀親和常數大約為a7C10 6.2×10-9Mb16C108.1×10-9Mc7B6 10.7×10-9M
d20C9 16.8×10-9M在混合淋巴細胞反應試驗(MLR)中體外測定抗體。MLR表明所有4種抗B7.1抗體不同程度地抑制IL-2的產生a7B6 5.0ug/MLb16C10 0.1ug/MLc20C9 2.0ug/MLd7C10 5.08ug/ML檢測猴抗B7.1抗體與人外周血淋巴細胞(PBL)中的B7結合的能力。FACS分析表明所有4種猴抗體檢測為陽性。通過FACS分析檢測猴抗體16C10、7B6、7C10和20C9的C1q結合。結果表明在與B7.1CHO轉染的細胞一起保溫後，7C10猴Ig具有強的人C1q結合。16C10也為陽性，而20C9和7B6猴抗體為陰性。
實施例8使用引作參考的共同轉讓的美國流水號08/379,072的靈長化抗體方法，並使用圖2所示的NEOSPLA載體系統，克隆7C10，7B6和16C10的重鏈和輕鏈可變區，使用NEOSPLA載體系統在CH0細胞中合成它的靈長化形式。靈長化的7C10輕鏈和重鏈、7B6輕鏈和重鏈以及16C10輕鏈和重鏈的胺基酸和核酸序列分別示於圖3a、3b、4a、4b、5a、5b。
實施例9CTLA-4的非交叉反應性和B7.1中的PRIMATIZED抗體結合位點的證明實驗在使用生物素化的CTLA-4Ig(圖6)的競爭性結合分析中，未標記的靈長化16C10(即P16C10)不能阻斷CTLA-4Ig與B7.1轉染的CH0細胞的結合。可以看出在這些條件下未標記的CTLA-4Ig和未標記的B7.1有效地競爭。
在使用生物素化的P16C10的第二個實驗中，可作出相同的結論。在圖7所示的實驗中，P16C10-生物素的結合被未標記的P16C10和B7.1Ig所抑制，但不被CTLA-4Ig抑制。雖然據報導CTLA-4Ig親和性高4-10倍(Kd＝0.4nM；Morton等，免疫學雜誌1561047-1054(1996))，甚至在CTLA-4Ig濃度超過100倍時仍沒有P16C10結合的明顯抑制。
當在實驗中它取代P16C10時，使用靈長化的抗體7C10(P7C10)獲得類似的結果(數據未提供)。
實施例10在存在CTLA-4Ig存在下L307.4和BB-1小鼠抗體與B7 CHO細胞結合的能力的比較為了確定小鼠抗體結合位點是否與CTLA-4結合位點重疊，研究了CTLA-4Ig存在下L307.4和BB-1小鼠抗B7抗體的結合。進行使用P16C10-生物素、L307.4-生物素和CTLA-4Ig-生物素的競爭測定實驗以確保親和性的不同不妨礙競爭性結合的檢測。結果示於圖8和9中。
圖8的結果證實了早期的研究，即小鼠抗體BB-1不與P16C10競爭。這些結果還表明存在約50％的與L307.4的交叉反應性。圖8的結果證實BB-1和L307.4相互競爭並且BB-1完全阻斷CTLA-4Ig-生物素與B7.1轉染的細胞的結合。BB-1不顯著地影響P16C10與B7.1陽性CHO細胞的結合。
圖9所示的結果表明當在結合實驗中使用CTLA-4Ig-生物素時競爭大於50％。圖9表明CTLA-4Ig-生物素被除P16C10外的所有B7.1抑制劑有效地阻斷，因此P16C10識別一個獨特的結合決定子，其在產生陰性信號中允許正常CTLA-4配體結合。早期的功能性研究(數據未顯示)表明在同種異體MLR中L307.4阻斷IL-2產生的減弱的能力，這與它可能干擾CTLA-4陰性信號的假設一致。不清楚文獻中報導的其它小鼠抗體中有多數種產生CTLA-4結合的完全抑制；然而，這在確定B7.1和B7.2特異性抗體的真正功能機理中非常重要。
這些結果證實了在使用B7-Ig與P16C10生物素競爭與B7.1轉染CHO細胞的結合的早期研究。研究還證實了CTLA-4Ig不抑制P16C10的早期觀察。這些結果清楚地表明靈長類抗體對獨立於CTLA-4結合位點的主要與CD28相互作用的唯一的B7.1表位是特異性的。由於它可阻斷B7.1與CD28受體結合而仍允許CTLA-4的陰性信號功能不被抑制地產生，因此，這種類型的相互作用將提供好處。無論是Th1或Th2表型的優勢，被發現的這種相互作用可能導致整個T細胞活化應答的下調。
當在實驗中使用P7C10取代P16C10時，獲得類似的結果(數據未提供)。
實施例11證明P16C10與CD28受體結合和阻斷B7.1與CD28受體相互作用能力的實驗通過用125I標記B7.1Ig，接著競爭性地與CD28陽性未活化的外周血T淋巴細胞結合進行確定是否P16C10結合B7.1可阻斷B7.1與CD28的相互作用的實驗。如通過用未標記的B7.1Ig的抑制所證實的，示於圖10的結果表明標記的B7.1Ig特異性地與T細胞結合。結果還表明CTLA-4Ig、抗CD28和P16C10均能阻斷這種相互作用。結果進一步證實P16C10阻斷CD28/B7相互作用的結合，IC50＜1ug/mL。
在沒有膜相關的CTLA-4被表達的條件下獲得上面的結果(Linsley等，實驗醫學雜誌173721-730(1991))並通過抗CD28抗體阻斷而證實。
當在實驗中使用P7C10取代P16C10時，獲得類似的結果(數據未提供)。
由於其可能較低的抗原性和人效應功能，預期這些靈長化抗體將極適宜於作為治療劑。事實上，最近已表明靈長化的16C10顯示人Clq結合。
本領域技術人員通過常規實驗將認識到或能確定本文描述的本發明具體實施方案的許多等同物。這些等同物被權利要求書所包括。
權利要求
1.特異性結合B7.1抗原(CD80)或B7.2抗原(CD86)的單克隆抗體，所述抗體抑制所述B7.1或B7.2抗原與CD28的結合。
2.權利要求1的單克隆抗體，其中所述抗體特異性結合B7.1抗原(CD80)。
3.權利要求2的單克隆抗體，其中所述抗體不抑制B7.1抗原與CTLA-4結合。
4.權利要求1的單克隆抗體，其中所述抗體特異性結合B7.2抗原(CD86)。
5.權利要求4的單克隆抗體，其中所述抗體不抑制B7.2抗原與CTLA-4結合。
6.權利要求1的單克隆抗體，所述抗體抑制T細胞產生IL-2。
7.權利要求2的單克隆抗體，所述抗體通過CD28/B7.1途徑選擇性地抑制B和T細胞的相互作用。
8.權利要求4的單克隆抗體，所述抗體通過CD28/B7.2途徑選擇性地抑制B和T細胞的相互作用。
9.權利要求1的單克隆抗體，所述抗體能在體外抑制T淋巴細胞產生IL-2。
10.權利要求9的單克隆抗體，其中當以至少10μg/ml的濃度加入到含有T淋巴細胞的培養物中時，所述抗體能抑制IL-2產生。
11.一種單克隆抗體，所述抗體與B7.1上16C10或7C10結合的同一表位結合，或所述單克隆抗體抑制16C10或7C10與B7.1的相互作用。
12.權利要求1的單克隆抗體，其為靈長化的抗體。
13.權利要求1的單克隆抗體，其為人的，嵌合的小鼠/人的，或人源化的抗體。
14.權利要求1的單克隆抗體，其中所述B7.1是人B7.1。
15.權利要求1的單克隆抗體，其中所述B7.2是人B7.2。
16.治療涉及T細胞/B細胞相互作用的疾病的方法，包括施用足以通過B7.1/CD28途徑抑制B細胞和T細胞結合的量的權利要求2的單克隆抗體。
17.治療涉及T細胞/B細胞相互作用的疾病的方法，包括施用足以通過B7.2/CD28途徑抑制B細胞和T細胞結合的量的權利要求4的單克隆抗體。
18.權利要求16的方法，其中所述疾病是自身免疫病。
19.權利要求17的方法，其中所述疾病是自身免疫病。
20.權利要求16的方法，其中所述疾病選自特發性血小板減少性紫癜，系統性紅斑狼瘡，1型糖尿病，類風溼性關節炎，銀屑病，再生障礙性貧血，炎性膽汁病，變態反應和多發性硬化。
21.權利要求17的方法，其中所述疾病選自特發性血小板減少性紫癜，系統性紅斑狼瘡，1型糖尿病，類風溼性關節炎，銀屑病，再生障礙性貧血，炎性膽汁病，變態反應和多發性硬化。
22.權利要求16的方法，其中所述疾病是移植物抗宿主疾病。
23.權利要求17的方法，其中所述疾病是移植物抗宿主疾病。
24.權利要求16的方法，其中所述疾病選自B細胞淋巴瘤，傳染病和炎性疾病。
25.權利要求17的方法，其中所述疾病選自B細胞淋巴瘤，傳染病和炎性疾病。
26.適用於治療通過抑制B7CD28結合可以治療的疾病的藥物組合物，所述組合物含有權利要求1的抗體。
27.權利要求16的方法，其中將抗體與其它重組蛋白質或小分子免疫抑制劑結合施用。
28.權利要求17的方法，其中將抗體與其它重組蛋白質或小分子免疫抑制劑結合施用。
全文摘要
本發明涉及特異於人B7.1抗原(CD80)、能抑制B7.1與CD28受體結合、不能抑制B7.1與CTLA－4受體結合的抗體的鑑定。儘管存在第二個活化配體B7.2(CD86),但其中兩種抗體,16C10和7C10明顯抑制IL－2的產生。用這些抗體阻斷CD28與B7.1(CD80)之間的主要活化信號,而允許CTLA－4與B7.1和/或B7.2的未減弱或一致的相互作用代表了對陽性共刺激的拮抗作用與對陰性信號傳遞的興奮作用並存。這些抗體可被用作特異性的免疫抑制劑,例如用於治療自身免疫病和預防器官移植排斥反應。
文檔編號A61P7/06GK1244128SQ97181289
公開日2000年2月9日 申請日期1997年10月29日 優先權日1996年11月8日
發明者D·R·安德森, N·漢納, P·布拉姆斯, C·赫爾德 申請人:艾德藥品公司