一種快速檢測轉基因油菜gt73的方法
2023-09-19 22:47:40
專利名稱：一種快速檢測轉基因油菜gt73的方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學技術領域，涉及轉基因產品的檢測方法，具體 說是一種快速檢測轉基因油菜GT73的方法，通過肉眼觀察反應管濁度或觀 察加入1000 x SYBR Green後顏色變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳來判斷擴增情 況。
背景技術：
近年來，我國生產的油菜籽供不應求，平均每年進口菜籽100萬噸以 上，最多的年份達300多萬噸，主要進口國為加拿大。加拿大油茱籽已成 為我國菜籽消費的一個重要組成部分。加拿大是世界第二大油菜生產國和 第一大油菜產品出口國，還是世界上第一個大面積商業化種植轉基因油菜 的國家，油菜生產主要採用抗除草劑轉基因油菜品種，種植面積最大的品 種是孟山都公司培育的抗農達(草甘膦)品種GT73/RT73及其衍生品種， 約佔加拿大油菜播種面積的46%,其次是拜耳公司培育的轉基因抗草胺膦 雜交油菜MsSRH系統及其衍生組合，約佔加拿大油菜面積的31%。另外還 有Pioneer Hi-bred ^司採用誘變育種方法獲得的抗咪唑啉酮除草劑品種， 約佔15%。加拿大目前抗除草劑品種種植面積達95%以上。該國從事油菜生 產的農戶約6萬戶，採取大面積機械化作業，年產油菜籽500-800萬噸。加 拿大的油菜生產主要分布在加拿大西部草原三個省，春播夏收，生產的油 菜籽50%在國內壓榨，50%通過沿海口岸出口到美國、日本、中國和墨西哥 等地區。
我國目前還沒有轉基因油菜產業化種植，但轉基因油菜研究十分活 躍，有的已經接近產業化階段。為了推進轉基因油菜的產業化和安全管理 進程，國家轉基因油菜的檢測和監測體系正在緊鑼密鼓的進行。目前，除 美國有少量轉基因油菜種植以外，加拿大是唯一 大面積產業化種植轉基因 油菜的國家，迄今已有十年的歷史，其經驗與教訓值得我國借鑑。隨著大量轉基因作物逐步走向市場，轉基因作物和轉基因作物加工的 食物的安全性問題也開始受到人們的關注。從本質上講，轉基因作物和常 規育成的作物品種沒有差別。常規育種一般是通過有性雜交來實現，而植
物基因工程則是用農桿菌、基因槍、電激、微注射等技術將外源重組DNA 導入植物基因組中。儘管從理論上講，轉基因的遺傳特性及表型應該可以 更加精確的預測，在應用上更加安全，但對轉基因作物進行安全性評估仍 然很有必要。
歐盟最早提出對轉基因食品進行標識管理。1999年，要求出口到歐盟 的非轉基因產品不得含有l。/fl的轉基因產品汙染；2002年，歐盟將標識的最 低限量降低到O. 9%。日本、澳大利亞、紐西蘭對轉基因成分的最低含量做 了不同規定，域值從l-554不等。
我國於2001年5月9日公布並實施《農業轉基因生物安全管理條例》， 於2002年1月5日公布了農業轉基因生物安全評價、標識和進口安全管 理三個配套管理辦法，確定了第一批實施標識管理的農業轉基因生物目 錄，並於2002年3月20日起正式實施。
目前，PCR檢測方法是主要的轉基因作物檢測方法，包括定性PCR方法、 複合PCR方法、巢式PCR方法、竟爭性定量PCR方法、螢光定量PCR方法等。 國內外推廣使用的是定性PCR和實時定量PCR檢測方法。PCR擴增技術的一 般檢測程序是提取基因組DNA —PCR擴增—酶切試驗一檢測目的基因— 檢測報告。檢測儀器設備主要是PCR儀、電泳儀、冷凍離心機、紫外觀察 (或凝膠成像)儀等，所需的技術條件較高，儀器設備較為昂貴，且檢測 成本和費用較高， 一般檢測單位難以達到。
發明內容
本發明的目的在於公開一種快速檢測轉基因油菜GT73的方法及根據 外源基因與內源基因接合處序列設計一套引物對其進行擴增，通過肉眼觀 察濁度或觀察加入SYBR Green後顏色的變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳結果判 斷擴增情況。
本發明的技術方案如下一種用於檢測轉基因油菜GT73的特異性引物，其中外引物正向序列 5，-GGTAATTACTCTTTCTTTTTCTCC-3，， 外引物反向序列 5，-GTGGAATGTTCAATACCTTGA-3，； 內引物正向序列 5，-GGAGGATGATCTTCATGTCCGGTTTTATATTGACCATCATACTCATTGC-3，，內引物反 向序列5'-GCCTTTCCTTCCTTTTCTTGCCTTTTTGTTTCTGAGTAATTCTTCAGC-3，，環 引物序列5 '-AAGCTTGTGTCAATTGTTGACAGAG-3，。
每條引物分別配製成濃度為lOOjumol/L的母液，取外引物各ljiL， 內引物各8/iL，滅菌去離子水2jaL,充分混合，為引物混合溶液。
本發明採用上述一套引物進行快速檢測轉基因油菜GT73的方法，其特 徵在於包括如下步驟
(1)將引物混合溶液及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，加入模 板DNA，在63-65匸進行45-60min，並且在80。C持續2min, 4X:保存；
其中的擴增反應體系擴增反應的總體積為25juL，其各種成分分別 為10xThermoPo1 Buffer 2. 5 p L, 4mol/L甜菜鹼6. 25yL， 0. 2mol/L MgS04 0. 25 uL，引物混合液l(jL， 10 ji mol/L dNTPs 3. 5pL, 8000U/LBst DM聚合酶大片段l-2nL,模板DNA l-5]aL,用滅菌去離子水補齊到25 UL，混勻離心(4000-8000rpm， 5-10秒)後上才;u;
(2)擴增反應結束，取體系液3-25juL，採用不同方法判斷擴增與否， 包括直接向擴增管中加入螢光染料SYBR Green,通過顏色變化觀察有無 擴增反應；或評估擴增副產物焦磷酸鎂白色沉澱物的量來觀察有無擴增反 應；或通過觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷擴增結果。
本發明所述的引物混合溶液指的是將上述的5條特異引物粉末分別配 成濃度為100pmol/L的母液，然後取外引物各ljiL,內引物各8nL，加 滅菌去離子水2pL,充分混合，製得引物混合溶液。
本發明所述的檢測方法，其中所述的鏈置換活性的DNA聚合酶為 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段l-2]nL。
本發明所述的螢光染料SYBR Green加入量為l-2piL,濃度為1000倍。 本發明所述的檢測方法，模板DNA指的是從待測樣品提取的基因組DNA。
為了能更加清楚的說明本發明的測定方法，下面對本發明的試驗方法 寸故以詳細的說明。
1、 原理
本方法應用一種新型的核酸擴增方法，其原理是採用5條特異引物及 一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63匸-65匸對核酸進行擴增，短時間 擴增效率可達到10'-10"個拷貝。具有高特異性、高效性、快速、簡便、易
檢測等特點。
2、 引物設計
本研究依據轉基因油菜GT73外源基因與內源基因結合處序列設計了 4 條引物。引物由上海生物工程公司合成。
表l引物序列表如下:
引物名稱序列(5'to3')
GT73正向外引物GGTAATTACTCTTTCTTTTTCTCC
GT73反向外引物GTGGAATGTTCAATACCTTGA
GT73正向內引物GGAGGATGATCTTCATGTCCGGTTTTATATTGACCATCATACTCATTGC
GT73反向內引物GCCTTTCCTTCCTTTTCTTGCCTTTTTGTTTCTGAGTAATTCTTCAGC
GT73環引物AAGCTTGTGTCAATTGTTGACAGAG
3、反應條件
反應試劑需要鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs、轉基因油菜GT73特異性引 物、甜菜鹼、MgS04和反應緩衝液。反應在恆溫條件下進行，反應時間依據 引物的效率和模板DM質量變化， 一般為lh或更少。加入模板DNA,在63-65 。C進行45-60min,並且在80匸，持續2min而終止。
這項技術的優點就是不需要熱循環，不需要PCR儀等昂貴的儀器，僅 需要恆溫水浴鍋或金屬加熱塊維持反應溫度。 材料與方法-.
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍ThermoPol Buffer溶液；特異性引物；甜菜鹼溶液；MgS04溶液；dNTPs;(2) 擴增反應體系擴增反應的總體積為25pL，其各種成分及終濃度 分另'J為10 x ThermoPol Buffer 2. 5 y L, 4mol/L甜菜鹼6. 25 0. 2mol/L MgS040. 25yL，引物混合液ljLiL， lOpmol/L dNTPs 3. 5 juL, 8000U/LBst DNA聚合酶大片段l-2pL，模板DNAl-5nL，用滅菌去離子水補齊到25 p L, 混勻、離心(4000-8000rpm， 5-10秒)後上機；
(3) 擴增反應過程在63-65 'C進行45-60min,並且在80'C持續2min, 4t:保存；
(4) 擴增反應結束，取體系液3-25juL用不同的檢測方法判斷擴增與否。 4、擴增結果觀察
有三種觀察方法，適合不同情況下進行
1) 使用2%瓊脂糖凝膠，加入EB染色劑，100V電泳50min，在紫外燈下 觀察。反應會產生各種片斷長度的莖環結構的擴增產物，因此在電泳圖譜 中顯示為從點樣孔處開始的彌散和階梯狀條帶現象。結果見圖l。
2) 由於反應形成大量雙鏈DM產物，所以可直接向擴增管中加入螢光 染料SYBR Green,通過肉眼觀察，無擴增反應的反應管呈橙色，有擴增反 應的反應管將變為綠色。結果見圖2。
3) 檢測還可以通過評估擴增副產物焦磷酸鎂的白色沉澱物的量來進 行。在反應中，在核酸大量合成時，產生副產物一焦磷酸鎂沉澱，可以用 肉眼觀察或濁度儀檢測反應管中的沉澱濁度就能夠判斷擴增與否。
本發明用於轉基因油菜GT73檢測的擴增方法，具有以下優點
(1) 操作筒便不需要複雜的儀器，只需一恆定溫度就能反應。
(2) 高特異性該技術由4條引物擴增靶序列的6個區段，因此具有高 度特異性。
(3) 快速高效整個擴增不到lh即可完成，產量可達到1(T-1(T個拷貝；
(4) 鑑定簡便可以用肉眼直接觀察反應管內沉澱的濁度或者通過 SYBR Green顏色變化判斷擴增與否。
圖l為擴增產物的電泳分析圖i瞽。自左向右依次為Marker、空白對照、陰性對照、陰性樣品、陽性對照和陽性樣品。
圖2為擴增產物加入SY肌Green結果圖。左為陽性對照，右為陰性對照。
圖3為擴增產物加入SYBR Green結果圖。從左邊依次為陰性對照、陽 性對照、待測樣品。
圖4為擴增產物加入SYBR Green結果圖。由左至右為陰性對照、陽性 對照、待測4羊品l和待測樣品2。
圖5為擴增產物的電泳分析圖i普。由左至右DL2000 DNA Marker、陰 性對照、待測樣品l、待測樣品2、待測樣品3、待測樣品4、陽性對照。
圖6為實施例4，採用本發明方法擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析，紫 外燈下觀察結果，其中l，m; 2,5%; 3， 1%; 4， 0， 5%; 5, 0.1%; 6， 0. 05%; 7， 0. 01%; 8， 0. 005%; 9， 0. 001%; 10,陰性對照；M，DL2000 DNA, Marker,
圖7為實施例4，常規定性PCR方法擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析，紫 外燈下觀察結果。其中1，10%; 2， 5%; 3,1%; 4,0.5%; 5， 0.1%; 6， 0.05%; 7, 0. 01%; 8, 0. 005%; 9, 0.001%; 10，陰性對照；M，DL2000 DNA， Marker。
具體實施例方式
為了能更加清楚的說明本發明的方法，下面對本發明的試驗方法做以 詳細的說明，在此需加以說明的是本發明所述的引物序列見表l。 實施例l
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產的Bst DM聚合酶大片段和 10倍ThermoPo1 Buffer溶液；特異性引物混合液；4mol/L甜菜鹼溶液；
0. 2mol/L MgS0濃液。
(2) 擴增反應體系擴增反應的總體積為25)iL,其各種成分分別為 10 x ThermoPol Buffer 2. 5 nL， 4mol/L甜菜鹼6. 25 p L, 0. 2mol/L MgS04 0,25pL，混合引物1juL， 10ymol/L證Ps 3.5pL, 8000U/L Bst DNA聚 合酶大片段ljaL,模板DMlyL，用滅菌去離子水補齊到25juL，混合均 勻後離心(4000rpm, 5秒)上機。
(3) 擴增反應程序在63'C進行60min，並且在80"C保溫2min， 4匸，保存。
(4)擴增反應結束，取體系液15nL,直接向擴增管中加入螢光染料 1/iL 1000 xSYBR Green,振蕩混勻，肉眼觀察結果。無擴增反應的反應 管呈橙黃色，有擴增反應的反應管將變為綠色。結果見圖3，由圖可見， 待測樣品為陽性樣品，含有轉基因油菜G T 7 3成份。 實施例2
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍ThermoPol Buffer溶液；特異性引物混合液；4mol/L甜菜鹼溶液；
0. 2mol/L MgS04溶液。
(2) 擴增反應體系擴增反應的總體積為25pL,其各種成分分別為 10 x ThermoPol Buffer 2. 5 pL， 4mol/L甜菜鹼6. 25|iL， 0. 2mol/L MgS04， 混合引物O. 25nL , 10pmol/L dNTPs 3. 5jaL， 8000U/L Bst DM聚合酶 大片段2jiL，模板DM2yL，用滅菌去離子水補齊到25nL,混合均勻後 離心(8000rpm, IO秒)上機。
(3) 擴增反應程序在65。C進行45邁in，並且在80lC保溫2min, 4匸，保存。
(4) 擴增反應結束，取體系液15pL，直接向擴增管中加入萸光染料 2pL 1000 xSYBR Green，震蕩混勻，肉眼觀察結果。無擴增反應的反應 管呈橙黃色，有擴增反應的反應管將變為綠色。結果見圖4，由圖可以看 出，待測樣品l為陽性樣品，不含有轉基因油菜GT73成分，樣品2不含有轉 基因油菜GT73成分。
實施例3
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產的Bst DM聚合酶大片段和 lO倍ThermoPol Buffer溶液；特異性引物混合液；4mol/L甜菜鹼溶液；
0. 2mol/L MgS04溶液。
(2) 擴增反應體系擴增反應的總體積為25yL,其各種成分分別為 10 x Ther邁oPol Buffer 2. 5 y L， 4mol/L甜菜鹼6. 25pL， 0. 2mol/L MgS04, 混合引物0.25jaL ， lO^mol/L dNTPs 3.5/iL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2yL,模板DM5nL,用滅菌去離子水補齊到25jLiL,混合均勻後 離心(5000rpm， 5秒)上機。
(3) 擴增反應程序在63"C進行60min，並且在80"C保溫2min, 4'C，保存。
(4) 擴增反應結束，取體系液3pL經2n/n瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外 燈下觀察結果。無擴增反應的反應管無明顯條帶，有擴增反應的反應管出 現階梯狀條帶。結果見圖5， 4個樣品中樣品1、 2不含有轉基因油菜GT73成 分，樣品3、 4含有轉基因油菜GT73成分。
實施例4
對比實驗
轉基因油菜GT73的定性PCR測定方法與本發明的測定方法的對比
(1) 本發明方法試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產的Bst DNA聚合 酶大片段和10倍ThermoPo1 Buffer溶液；特異性引物混合液；4mol/L甜 菜鹼溶液；0. 2mol/L MgS04溶液；DNA模板包括含有轉基因油菜GT73成份 10%、 5%、 1%、 0.5%、 0.1%、 0.05%、 0.01%、 0.005%、 0.001%、 0%的樣品。
(2) 本發明擴增反應體系擴增反應的總體積為25pL，其各種成分 分另寸為10 x ThermoPol Buffer 2. 5 juL, 4mol/L甜菜械6. 25 ji L， 0. 2mol/L MgS04 0.25 yL,混合引物1"L， 10|iimol/L dNTPs 3. 5 n L， 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2yL,模板DNA 5|iL,用滅菌去離子水補齊到25juL， 混合均勻後充分混勻、離心(8000rpm， 8秒)上機；
(3) 本發明擴增反應程序在63。C進行60min，並且在80X:保溫2min， 4'C，保存；
(4) 本發明擴增反應結束，取反應產物4yL,經2%瓊脂糖凝膠電泳 分析，紫外燈下觀察結果。無擴增反應的反應管無明顯條帶，有擴增反應 的反應管出現階梯狀條帶。結果見圖6:其中1，10%; 2,5%; 3， 1%; 4,0.5%; 5， 0.1%; 6， 0. 05%; 7， 0. 01%; 8， 0. 005%; 9, 0. 001%; 10，陰性對照；M，DL2000 DNA， Marker。
(5 ) PCR方法反應引物採用本發明反應中 一對外引物擴增目標基因。PCR反應為25 n L體系，10xPCR buffer (Promega) 2. 5yL, 10 mM dNTPs (Promega) 0. 5juL,上遊和下遊引物(10 mM)各O. 5 y L, Taq酶(5U/jn L, Promega) 0. 5jaL， DNA模板lpL，滅菌去離子水19. 5 n L。反應程序為 95 T預變性5min; 95C變性30s, 52'C退火30s， 72T延伸30s， 35個循環； 72'C延伸7 min。 PCR產物取IO n L於2W瓊脂糖凝膠電泳，100 V電壓下40 min， 通過凝膠成像分析儀觀察，結果見圖7:其中1，10%; 2,5%; 3,1%; 4,0.5%; 5, 0. 1%; 6， 0. 05%; 7, 0. 01%; 8, 0. 005%; 9, 0. 001%; 10,陰性對照；M,DL2000 麗，Marker。
由兩種方法比較可以看出，本發明的方法靈敏度明顯高於PCR方法的 敏感度，能檢測出轉基因油菜GT73含量更低的樣品。
在詳細說明的較佳實施例之後，熟悉該項技術人士可清楚地了解，在 不脫離上述申請專利範圍與精神下可進行各種變化與修改，凡依據本發明 的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬於 本發明技術方案的範圍。且本發明亦不受說明書中所舉實例實施方式的限 制。序列表
天津市農業科學院中心實驗室
—種快速檢測轉基因油菜GT73的方法
4
1
<211〉 24bp
腿
人工序列
1
ggUattact ctttcttttt ctcc 24
2 21bp 艦 人工序列 2
gtggaatgtt caataccUg a 21
3 49bp DNA 人工序列 3
ggaggatgat cttcatgtcc ggttttaUt tgaccatcat actcattgc 49
4 48bp
12 飄 人工序列 4
gcctUccU ccUttcttg cctttttgtt tctgagtaat tcttcagc 48
5 <211〉 25bp DNA 人工序列 <400〉 5
aagcttgtgt caattgttga cagag 2權利要求
1、用於檢測轉基因油菜GT73的特異性引物，其特徵在於，包括外引物正向序列5』-GGTAATTACTCTTTCTTTTTCTCC-3』，外引物反向序列5』-GTGGAATGTTCAATACCTTGA-3』；內引物正向序列5』-GGAGGATGATCTTCATGTCCGGTTTTATATTGACCATCATACTCATTGC-3』，內引物反向序列5』-GCCTTTCCTTCCTTTTCTTGCCTTTTTGTTTCTGAGTAATTCTTCAGC-3』，環引物序列5『-AAGCTTGTGTCAATTGTTGACAGAG-3』。
2、 一種採用權利要求1所述特異性引物快速檢測轉基因油菜GT73方 法，其特徵在於包括如下步驟(1)將引物混合溶液及一種具有鏈置換活性的DM聚合酶，加入模 板DM，在63-65 C進行45-60min，並且在80X:持續2min, 4t:保存；其中的擴增反應體系擴增反應的總體積為25yL，其各種成分分別 為10xThermoPo1 Buffer 2. 5jnL， 4mol/L甜菜鹼6. 25pL, 0. 2mol/L MgS04 0. 25 pL，引物混合液lyL， 10 u mol/L dNTPs 3. 5 n L, 8000U/LBst DM聚合酶大片段l-2nL,模板DMl-5jiL，用滅菌去離子水補齊到25 jiL,混勻，離心4000-8000rpm， 5-10秒後上機；(2)擴增反應結束，取體系液3-25pL，採用不同方法判斷擴增與否， 包括直接向擴增管中加入螢光染料SYBR Green，通過顏色變化觀察有無 擴增反應；或評估擴增副產物焦磷酸鎂白色沉澱物的量來觀察有無擴增反 應；或通過觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷擴增結果。
3、 如權利要求2所述的檢測方法，其中所迷的引物混合溶液指的是 將權利要求1所述的5條特異引物粉末分別配成濃度為100ymol/L的母 液，然後取外引物各ljiL,內引物各8uL,加滅菌去離子水2)iL，充分混合，製得引物混合溶液。
4、 如權利要求2所述的檢測方法，其中螢光染料SYBR Green濃度為1000倍，加入量為1-2 jiiL。
5、 如權利要求2所述的檢測方法，其中所述的鏈置換活性的DNA聚 合酶為8000U/L Bst DM聚合酶大片段l-2jaL。
全文摘要
本發明公開了一種轉基因油菜GT73的快速檢測方法。其原理是採用5條特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63～65℃對樣品DNA模板進行擴增，短時間擴增出大量產物。其鑑定採用肉眼直接觀察反應管內沉澱的濁度或者通過加入SYBR Green顏色變化判斷擴增與否。本發明的檢測方法具有高特異性、高效性、快速、簡便等優點。
文檔編號C12Q1/68GK101519694SQ200910068339
公開日2009年9月2日 申請日期2009年4月2日 優先權日2009年4月2日
發明者蘭青闊, 珠 朱, 永 王, 奕 程, 新 趙 申請人:天津市農業科學院中心實驗室