一種製備異種脫細胞基質的方法及其產品的製作方法

2023-09-14 22:44:30 1

一種製備異種脫細胞基質的方法及其產品的製作方法
【專利摘要】本發明涉及到一種製備脫細胞真皮基質敷料的方法，將動物皮通過製備斷層皮片﹑分離表皮和真皮﹑交聯﹑脫細胞﹑冷凍乾燥﹑病毒滅活後最終得到脫細胞真皮基質。本發明的優點：本方法用N,N-二環己基碳化二亞胺進行交聯時間短﹑效率高，另交聯前提，極大簡化了後面交聯劑殘留處理程序，節省了成本；脫細胞過程中利用酶﹑SDS和鹼聯合，對脫細胞基質進行微觀調控，利用冷凍乾燥對脫細胞基質進行宏觀調控，脫細胞徹底，細胞更容易在其上生長。
【專利說明】一種製備異種脫細胞基質的方法及其產品
【技術領域】
[0001]本發明涉及組織工程領域，具體涉及一種備異種脫細胞基質的方法。
【背景技術】
[0002]脫細胞真皮基質製備的目的是儘可能的去除皮膚組織中免疫原性很強的細胞成分(表皮細胞、毛囊、皮脂腺、汗腺及真皮中血管內皮細胞、成纖維細胞等)，保留免疫原性相對較弱的細胞基質外成分以及真皮組織完整的三維空間結構。這樣既能避免移植後的排斥反應和過強的免疫炎症反應，從而影響移植效果，又能提供引導組織再生的生物「模板」或支架，達到最大限度地修復組織缺損的目的。
[0003]目前脫細胞真皮基質的製備方法主要有以下幾種:1)DispaseI1- Triton法:皮膚標本先經DispaseII處理(2.5 U/ ml溶液，4e下作用48 h),再經TritonX-1OO處理(0.5%溶液，室溫下作用48 h)。DispaseII主要分解IV型膠原和纖維粘蛋白，能裂解基底膜中的緻密層，是一種快速有效的分離表皮與真皮的酶。標本經DispaseII處理後，表皮真皮間的基底膜及皮膚附屬器於周圍結締組織成分均被破壞。同時也破壞了纖維細胞和結締組織基質間的連結，更有利於TritonX-1OO的浸透。TritonX-1OO屬於非離子型表面活性劑，在溶液中穩定性高，不易受強電解質無機鹽存在的影響，能與生物膜中的磷脂等脂質結合形成複合物，溶解於溶液中。同時，TritonX-1OO中的疏水端也能和膜蛋白破壞生物膜，從而使細胞溶解破壞。
[0004]2)高滲鹽-SDS法: 皮膚標本先經高滲鹽作用(lmol/LNaCl溶液，37e下作用24h)使錨著細絲與表皮基底細胞的半橋粒分離開米，從而完整地去除表皮。然後在未改變膠原結構的情況下，再用破膜劑十二烷基硫酸鈉(0.5%SDS溶液，室溫下作用Ih)將皮膚標本中的細胞脫除。該法細胞脫除也比較徹底，基底膜完整保留，但真皮中IV膠原，纖維結合素，彈力素，HLA-DR等含量較多，因此具有相對高的抗原性。
[0005]3)高滲鹽-NaOH消蝕法，該法利用高滲鹽(lmol/LNaCl溶液，37e下作用24h)去除表皮，同時再利用NaOH(低濃度溶液，室溫下作用18h)中鹼離子的吸水作用，奪取組織細胞的水分，使細胞脫水而死亡。最後使用超聲清洗儀清洗除去細胞。該法細胞徹底脫除，膠原纖維結構完整，排列較正常鬆散。但要注意控制NaOH的作用時間，過長(如36h)則會使膠原變性，蛋白裂解，得到的是真皮皮漿。
[0006]4)其它:Lee Y 等用胰蛋白酶(0.25%溶，4e 下作用 24h)，接著 TritonX-100 ( 0.1%溶液，室溫下作用8h),最後用Dispase (560 units/L, 4e下作用24h)。Ray等使用胰蛋白酶(0.25%溶液，室溫下作用18h)和SDS(0.1%溶液，室溫下作用12h)，然後用胰蛋白酶再作用 12h,最後用 Dispase (560 units/L, 25e 下作用 12h)。
[0007]其它輔助製備措施:
I)戊二醛交聯:一般用2ml/L的戊二醛溶液交聯皮膚標本510min。該措施是利用醛基封閉抗原位點作用，降低異種/異體ADM的免疫炎症反應，減緩組織降解。更有利於ADM的創面黏附和移植成活。但同時醛基又有細胞毒性作用，導致滯後的炎症細胞浸潤和異物巨細胞反映。對於戊二醛醛基矛盾性的作用，有待進一步的深入研究。
[0008]2)網狀打孔:選擇孔徑500-800um，間距為35mm。孔徑的選擇十分重要，經大量的理論和實驗證明，孔徑過大或過密，會增加抗原位點的暴露和抗原提呈細胞等接觸ADM的機會。該措施是利用毛細現象，使創面基底血漿等滲液滲透到無細胞真皮替代物表面，維持皮片早期的營養供應，並防止皮下積液、積氣及血腫形成。
[0009]檢索近年來有關脫細胞真皮基質製備的相關文章，考慮到脫細胞效果以及對細胞外基質的損傷程度，脫細胞真皮基質的製備順序一般是製備斷層皮片，然後預處理，再經過脫細胞處理後，進行交聯處理，最終病毒滅活。此種製備技術存在以下不足:1.細胞真皮製備過程中酶消化或高滲鹽處理過度將破壞膠原三維結構，反之則可能殘留細胞成分，引起排斥反應；2.缺乏血管網結構，導致其缺血時間，再灌注時間和無營養支持的時間較長；3.脫細胞基質製備中孔隙率和通孔率不理想，使成纖維細胞不易於黏附遷移；4.常用交聯劑戊二醛交聯後易發生鈣化，變硬、變脆現象。

【發明內容】

[0010]本發明的目的在於克服現有技術中存在的缺陷，提供一種步驟簡單、成本低廉、效果好的製備異種脫細胞基質的方法。本發明同時提供了上述方法製備的異種脫細胞基質。
[0011]為實現上述目的，本發明所採取的技術方案為:
一種製備異種脫細胞基質的方法，其具體包括如下步驟:
(1)製備斷層皮片
用取皮機將動物皮膚製成0.1-2.0mm厚的斷層皮片，經洗滌，去脂，再用磷酸鹽緩衝液(PBS液)洗滌1-3次；
(2)分離表皮和真皮
將步驟(1)得到的斷層皮片用0.1%-0.5% (質量體積比g/100ml)的胰蛋白酶-PBS液在 4°C _20°C下，浸泡 6-24h ；
(3)交聯
將驟(2)處理後的材料用含有N，N-二環己基碳化二亞胺(DCC)、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)和一水嗎啉乙磺酸(MES)的乙醇水溶液浸泡3-12h ；
(4)脫細胞
將步驟(3)處理後的材料用1-2%的氫氧化鈉溶液處理8-24h，然後用0.1%-0.5% (質量體積比g/100ml)的胰蛋白酶-PBS液在40C _20°C處理20_36h，PBS衝洗，以0.2%_0.5%(質量體積比g/100ml)SDS對基質進行震蕩洗滌，100-200轉/分鐘，溫度20°C _30°C，每隔I小時更換SDS液，3-5h取出，PBS衝洗；
(5)冷凍乾燥
-100—60°C預冷凍3-5小時，在冷凍乾燥機做8-15小時真空冷凍乾燥。
[0012](6)病毒滅活
經經Co-60所產生的gamma射線輻照消毒滅菌，即得成品。
[0013]進一步的，所述的PBS液的配製方法如下:
NaCl 8.00g/L ；
KCl 0.20 g/L ；Na2HPO41.56g/L ；
KH2PO4 0.20 g/L ；
將上述各成分依次溶解於含有800ml水的容量瓶中，補加水至1000ml，混勻。
[0014]進一步的，所述步驟⑵中胰蛋白酶-PBS液的濃度為0.13%，溫度為7V。
[0015]進一步的，所述含有N，N- 二環己基碳化二亞胺、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)和一水嗎啉乙磺酸(MES)的乙醇水溶液的配製方法如下:用向乙醇水溶液(乙醇的體積比為40%)，加入一水嗎啉乙磺酸(MES)使其濃度達到0.06mol/L，再向上述溶液中加入N，N- 二環己基碳化二亞胺(DCC)和N-羥基丁二醯亞胺(NHS)，按質量比為每克脫細胞組織1.8-5.4克N, N- 二環己基碳化二亞胺和0.415-1.245克NHS。
[0016]進一步的，所述步驟⑷中氫氧化鈉溶液的濃度為1%，所述胰蛋白酶-PBS液的濃度為0.13%，溫度為7V。
[0017]本發明另一方面提供了一種上述方法製備的異種脫細胞基質。
[0018]與現有技術相比，本發明取得的有益效果為:
本發明用N，N- 二環己基碳化二亞胺進行交聯時間短、效率高，另交聯前提，極大簡化了後面交聯劑殘留處理 程序，節省了成本；脫細胞過程中利用酶、SDS和鹼聯合，對脫細胞基質進行微觀調控，利用冷凍乾燥對脫細胞基質進行宏觀調控，脫細胞徹底，細胞更容易在其上生長。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發明實施例1製備的基質的HE染色效果圖；
圖2未脫細胞前豬中厚皮的HE染色效果圖。
【具體實施方式】
[0020]下面將結合具體實施例對本發明進行進一步詳細的說明。
[0021]本實施例和對比例中的磷酸鹽緩衝液(PBS液)的製備方法如下:
NaCl 8.00g/L ；
KCl 0.20 g/L ；
Na2HPO41.56g/L ；
KH2PO4 0.20 g/L ；
將上述各成分依次溶解於含有800ml水的容量瓶中，補加水至1000ml，混勻。
[0022]實施例1
1.0製備斷層皮片:用取皮機將動物皮膚製成長6cm，寬4cm，0.6mm厚的斷層皮片，純淨水洗滌，用0.15%新潔爾滅消毒去脂30分鐘，每次100mLPBS洗滌，洗滌3次，處理得到的豬中厚皮的HE染色效果圖見圖2。
[0023]2.0分離表皮和真皮:用0.15%的胰蛋白酶-PBS液100ml，在7°C作用24小時終止。
[0024]3.0交聯:用100mL乙醇溶液(乙醇的體積比為40%)，加入一水嗎啉乙磺酸(MES)使其濃度達到0.06mol/L，再向溶液中加入N，N-二環己基碳化二亞胺(DCC)和N-羥基丁二醯亞胺(NHS)，按質量比為每克脫細胞組織對應1.8克N，N- 二環己基碳化二亞胺和0.415克NHS，浸泡4小時。
[0025]4.0脫細胞:用1%的氫氧化鈉溶液100mL處理18小時，然後用0.15%的胰蛋白酶-PBS液在7°C處理24小時。PBS反覆衝洗3次，間隔約10分鐘，每次100ml。以0.4%SDS 100mL對基質進行震蕩洗滌，150轉/分鐘，溫度26°C。每隔I小時更換SDS液，3小時取出，PBS反覆衝洗7次，每次100ml,間隔IOmin0
[0026]5.0冷凍乾燥:_80°C預冷凍4小時，在冷凍乾燥機做10小時真空冷凍乾燥。處理後的基質的HE染色效果圖見圖1。
[0027]6.0病毒滅活:經Co-60所產生的Y射線輻照消毒滅菌。
[0028]實施例2
1.0製備斷層皮片:用取皮機將動物皮膚製成長6cm，寬4cm，0.6mm厚的斷層皮片，純淨水洗滌，用0.1%新潔爾滅消毒去脂30分鐘，每次100mLPBS洗滌，洗滌3次。
[0029]2.0分離表皮和真皮:用0.1%的胰蛋白酶-PBS液100ml，在4°C作用6小時終止。
[0030]3.0交聯:用100mL乙醇溶液(乙醇的體積比為40%)，加入一水嗎啉乙磺酸(MES)使其濃度達到0.06mol/L。再向溶液中加入N，N- 二環己基碳化二亞胺和N-羥基丁二醯亞胺(NHS)，按質量比為每克脫細胞組織對應5.4克N，N- 二環己基碳化二亞胺和1.245克NHS,浸泡4小時。
[0031]4.0脫細胞:用2%的氫氧化鈉溶液100mL處理24小時，然後用0.1%的胰蛋白酶-PBS液在4°C處理36小時。PBS反覆衝洗3次，間隔約10分鐘，每次100ml。以0.2%SDS 100mL對基質進行震蕩洗滌，150轉/分鐘，溫度20°C。每隔I小時更換SDS液，3小時取出，PBS反覆衝洗7次，每次100ml,間隔IOmin0
[0032]5.0冷凍乾燥:-100°C預冷凍3小時，在冷凍乾燥機做8小時真空冷凍乾燥。
[0033]6.0病毒滅活:經Co-60所產生的Tf射線輻照消毒滅菌。
[0034]實施例3
1.0製備斷層皮片:用取皮機將動物皮膚製成長6cm，寬4cm，0.6mm厚的斷層皮片，純淨水洗滌，用0.15新潔爾滅消毒去脂30分鐘，每次100mLPBS洗滌，洗滌3次。
[0035]2.0分離表皮和真皮:用0.5%的胰蛋白酶-PBS液100ml，在20°C作用4小時終止。
[0036]3.0交聯:用100mL乙醇溶液(乙醇的體積比為40%)，加入一水嗎啉乙磺酸(MES)使其濃度達到0.06mol/L。再向溶液中加入N，N- 二環己基碳化二亞胺和N-羥基丁二醯亞胺(NHS)，按質量比為每克脫細胞組織對應3.6克N，N- 二環己基碳化二亞胺和0.930克NHS,浸泡4小時。
[0037]4.0脫細胞:用1.5%的氫氧化鈉溶液100mL處理24小時，然後用0.5%的胰蛋白酶-PBS液在20°C處理20小時。PBS反覆衝洗3次，間隔約10分鐘，每次100ml。以0.5%SDS 100mL對基質進行震蕩洗滌，200轉/分鐘，溫度26°C。每隔I小時更換SDS液，3小時取出，PBS反覆衝洗7次，每次100ml,間隔IOmin0
[0038]5.0冷凍乾燥:_60°C預冷凍5小時，在冷凍乾燥機做10小時真空冷凍乾燥。
[0039]6.0病毒滅活:經Co-60所產生的Tr射線輻照消毒滅菌。
[0040]對比例I
1.0製備斷層皮片:用取皮機將動物皮膚製成長6cm，寬4cm，0.6mm厚的斷層皮片，純淨水洗滌，用0.15新潔爾滅消毒去脂30分鐘，每次100mLPBS洗滌，洗滌3次。[0041]2.0脫細胞:用0.15%的胰蛋白酶-PBS液在7°C處理24小時。PBS反覆衝洗3次，間隔約10分鐘，每次100ml。以0.4% SDS 100mL對基質進行震蕩洗滌，150轉/分鐘，溫度26。。。每隔I小時更換SDS液，3小時取出，PBS反覆衝洗7次，每次100ml,間隔IOmin0
[0042]3.0交聯:用100mL乙醇溶液(乙醇的體積比為40%)，加入一水嗎啉乙磺酸(MES)使其濃度達到0.06mol/L。再向溶液中加入N，N- 二環己基碳化二亞胺和N-羥基丁二醯亞胺(NHS)，按質量比為每克脫細胞組織對應1.8克N，N- 二環己基碳化二亞胺和0.415克NHS,浸泡4小時。
[0043]5.0冷凍乾燥:_80°C預冷凍4小時，在冷凍乾燥機做10小時真空冷凍乾燥。
[0044]6.0病毒滅活:經Co-60所產生的Y射線輻照消毒滅菌。
[0045]對比例2
1.0製備斷層皮片:用取皮機將動物皮膚製成長6cm，寬4cm，0.6mm厚的斷層皮片，純淨水洗滌，用0.15新潔爾滅消毒去脂30分鐘，每次100mLPBS洗滌，洗滌3次。
[0046]2.0分離表皮和真皮:用0.15%的胰蛋白酶-PBS液100ml，在7°C作用24小時終止。
[0047]3.0交聯:用100mLPBS溶液(ρΗ7.4),加入40%的戊二醛1.25g,使其濃度達到0.625g/L,浸泡24小時。
[0048]4.0脫細胞:用 1%的氫氧化鈉溶液100mL處理18小時，然後用0.15%的胰蛋白酶-PBS液在7°C處理24小時。PBS反覆衝洗3次，間隔約10分鐘，每次100ml。以0.4%SDS 100mL對基質進行震蕩洗滌，150轉/分鐘，溫度26°C。每隔I小時更換SDS液，3小時取出，PBS反覆衝洗7次，每次100ml,間隔IOmin0
[0049]5.0冷凍乾燥:_80°C預冷凍4小時，在冷凍乾燥機做10小時真空冷凍乾燥。
[0050]6.0病毒滅活:經Co-60所產生的Y射線輻照消毒滅菌。
[0051]對比例3
1.0製備斷層皮片:用取皮機將動物皮膚製成長6cm，寬4cm，0.6mm厚的斷層皮片，純淨水洗滌，用0.15新潔爾滅消毒去脂30分鐘，每次100mLPBS洗滌，洗滌3次。
[0052]2.0分離表皮和真皮:用0.15%的胰蛋白酶-PBS液100ml，在7°C作用24小時終止。
[0053]3.0交聯:用100mL乙醇溶液(乙醇的體積比為40%)，加入一水嗎啉乙磺酸(MES)使其濃度達到0.06mol/L，再向溶液中加入N，N-二環己基碳化二亞胺和N-羥基丁二醯亞胺(NHS)，按質量比為每克脫細胞組織對應1.8克N，N- 二環己基碳化二亞胺和0.415克NHS，浸泡4小時。
[0054]4.0脫細胞:用0.15%的胰蛋白酶-PBS液在7°C處理24小時。PBS反覆衝洗3次，間隔約10分鐘，每次100ml。以0.4% SDS 100mL對基質進行震蕩洗滌，150轉/分鐘，溫度26。。。每隔I小時更換SDS液，3小時取出，PBS反覆衝洗7次，每次100ml,間隔IOmin0
[0055]5.0病毒滅活:經Co-60所產生的Y射線輻照消毒滅菌。
[0056]對比例4-13 表1
【權利要求】
1.一種製備異種脫細胞基質的方法，其特徵在於:其具體包括如下步驟: (1)製備斷層皮片 用取皮機將動物皮膚製成0.1-2.0mm厚的斷層皮片，經洗滌，去脂，再用磷酸鹽緩衝液(PBS液)洗滌； (2)分離表皮和真皮 將步驟(1)得到的斷層皮片用0.1%-0.5%的胰蛋白酶-PBS液在4°C _20°C下，浸泡6-24h ； (3)交聯 將驟(2)處理後的材料用含有N，N-二環己基碳化二亞胺、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)和一水嗎啉乙磺酸(MES)的乙醇水溶液浸泡3-12h ； (4)脫細胞 將步驟⑶處理後的材料用1-2%的氫氧化鈉溶液處理8-24h，然後用0.1%-0.5%的胰蛋白酶-PBS液在4°C -20°C處理20-36h，PBS衝洗，以0.2%-0.5%十二烷基磺酸鈉(SDS)對基質進行震蕩洗滌，100-200轉/分鐘，溫度20°C _30°C，每隔I小時更換SDS液，3_5h取出，PBS衝洗； (5)冷凍乾燥 -100—60°C預冷凍3-5小時，在冷凍乾燥機做8-15小時真空冷凍乾燥。 (6)病毒滅活 經Co-60所產生的？f射線輻照消毒滅菌，即得成品。
2.根據權利要求1所述的一種製備異種脫細胞基質的方法，其特徵在於:所述的PBS液的配製方法如下:
NaCl 8.00g/L ；
KCl 0.20 g/L ；
Na2HPO4 1.56g/L ；
KH2PO4 0.20 g/L ； 將上述各成分依次溶解於含有800ml水的容量瓶中，補加水至1000ml，混勻。
3.根據權利要求1所述的一種製備異種脫細胞基質的方法，其特徵在於:所述步驟(2)中胰蛋白酶-PBS液的濃度為0.13%，溫度為7V。
4.根據權利要求1所述的一種製備異種脫細胞基質的方法，其特徵在於:所述含有N，N-二環己基碳化二亞胺、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)和一水嗎啉乙磺酸(MES)的乙醇水溶液的配製方法如下:向乙醇水溶液，加入一水嗎啉乙磺酸(MES)使其濃度達到0.06mol/L,再向上述溶液中加入N，N-二環己基碳化二亞胺(DCC)和N-羥基丁二醯亞胺(NHS)，按質量比為每克脫細胞組織對應1.8-5.4克N，N- 二環己基碳化二亞胺和0.415-1.245克NHS。
5.根據權利要求1所述的一種製備異種脫細胞基質的方法，其特徵在於:所述步驟(4)中，氫氧化鈉溶液的濃度為1%，所述胰蛋白酶-PBS液的濃度為0.13%，溫度為7V。
6.一種異種脫細胞基質，其特徵在於:所述異種脫細胞基質是採用權利要求1-5所述的方法製得。
【文檔編號】A61L27/36GK103990179SQ201410223914
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月24日 優先權日:2014年5月24日
【發明者】宋靈傑, 高明, 侯朋, 丁春浦, 李一禮, 齊磊 申請人:河北愛能生物科技有限公司