一種聯合檢測急性心肌梗死生物標誌物的試劑盒的製作方法
2023-09-15 02:48:35
本發明涉及一種檢測生物標誌物的試劑盒，特別是涉及一種聯合檢測急性心肌梗死生物標誌物的試劑盒。
背景技術：
冠心病中主要導致患者死亡最重要的因素之一是急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,ami),是嚴重危害人類健康的心血管疾病[1]。ami是在冠狀動脈病變基礎上，發生冠狀動脈血供急劇減少或中斷，使得相應的心肌嚴重而持久地急性缺血導致而心肌短時間內壞死[2]。因此，在ami發病早期及時診斷並進行再灌注治療能明顯降低死亡率，改善預後。根據中華醫學會心血管分會制定的診斷標準，至少應當滿足缺血性胸痛等臨床症狀、動態心電圖變化和心肌壞死標誌物血清濃度動態改變這3項診斷標準中的2項，強調了實驗室檢查對於診斷ami的重要性[3]。
在診斷ami時，血清學診斷憑藉其特異度及靈敏度佔有重要位置，但單一的心臟標誌物檢測有時並不能在兩方面達到理想的效果，因此臨床上探討採用多個標誌物聯合檢測，互補不足，使診斷的特異度及靈敏度均達到較高水平，以達到準確診斷的目的。目前，診斷和排除ami應用最多的生化指標是ctni、ck-mb和myo[4]，在發生ami後，由於這三種物質釋放到血液的時間和達到峰值的時間各不相同，因此可通過這三項指標的聯合檢測來達到互補，以提高ami的快速診斷率[5]。心肌標誌物的檢測方法主要有金標層析法、酶聯免疫法、化學發光法和生物晶片法，但臨床應用中發現各種方法之間差異很大[6]，各有所長。
隨著生物晶片技術的發展，高通量懸浮晶片技術逐漸興起。它也被稱為多功能多指標同步分析系統(flexiblemultiple-analyteprofiling，)、多功能懸浮陣列(multi-analytesuspensionarrays，masa)或液體晶片(liquidchip)。2001年12月美國食品藥品監督管理局(fda)已批准將其用於臨床進行自身免疫病、人類白細胞抗原分型的診斷，這是唯一被美國fda批准用於臨床診斷的生物晶片產品[7]。
目前，尚未有可同時對肌鈣蛋白ti(cardiactroponini,ctni)、肌酸激酶同工酶(creatinekinaseisoenzyme,ck-mb)和肌紅蛋白(myoglobin,myo)進行快速聯合檢測急性心肌梗死生物標誌物的試劑盒的報導。
技術實現要素：
本發明的目的是克服現技術的不足，提供一種聯合檢測急性心肌梗死生物標誌物的試劑盒。
本發明的技術方案概述如下：
一種聯合檢測急性心肌梗死生物標誌物的試劑盒，包括：工作微球探針溶液、人ctni系列梯度標準品溶液、人ck-mb系列梯度標準品溶液、人myo系列梯度標準品溶液，三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液；100×稀釋的鏈黴親和素藻紅蛋白溶液和200×稀釋的生物素化鼠抗人二抗igg溶液；
所述工作微球探針溶液用下述方法製成：
(1)取編碼為35,42和52號的羧基螢光編碼微球分別置於三支的離心管中，用100μlph7.4的pbs重懸後，使所述羧基螢光編碼微球的濃度為1.25×107個微球/ml，分別加入100μlph8.00.1mol/l的pbs，分別加入新鮮配製的10μl濃度為50mg/ml的edc水溶液和10μl濃度為50mg/ml的s-nhs水溶液，室溫下攪拌10-30min，使羧基螢光編碼微球活化；
所述edc為1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的簡稱；
所述s-nhs為n-羥基琥珀醯亞胺磺酸鈉鹽的簡稱；
(2)在裝有活化後的35號羧基螢光編碼微球的離心管中加入10μgctni；在裝有活化後的42號羧基螢光編碼微球的離心管中加入10μgck-mb；在裝有活化後的52號羧基螢光編碼微球的離心管中加入10μgmyo；分別加ph7.4的pbs使終體積到500μl，室溫下以500-800rpm旋渦混勻2-4h，以12,000-16,000g離心3-6min，棄去上清液；分別加入100μl封閉緩衝液重懸並封閉交聯微球保持20min；離心，棄上清，用ph7.4的pbs清洗；
所述ctni為肌鈣蛋白的簡寫；ck-mb為肌酸激酶同工酶的簡寫；myo為肌紅蛋白的簡寫；
所述封閉緩衝液為：pbs中含有1wt％bsa,0.05wt％疊氮鈉，ph7.4；
(3)分別用150μl儲備緩衝液重懸步驟(2)獲得的微球，用血球計數器確定濃度，用儲備緩衝液稀釋到3000個/μl，分別得到偶聯有ctni探針微球溶液、偶聯有ck-mb探針微球溶液和偶聯有myo探針微球溶液；
(4)分別取偶聯有ctni探針微球溶液、偶聯有ck-mb探針微球溶液和偶聯有myo探針微球溶液50μl，混合，得工作微球探針溶液，工作微球探針溶液中偶聯有ctni探針微球的濃度為1000個/μl，偶聯有ck-mb探針微球的濃度為1000個/μl，偶聯有myo探針微球的濃度為1000個/μl，4℃儲存；
所述儲備緩衝液為pbs中含有0.1wt％bsa,0.02wt％吐溫-20,0.05wt％疊氮鈉,ph7.4。
優選地，人ctni系列梯度標準品溶液是用ph＝7.4的pbs緩衝液為溶劑，配製的濃度分別為0、0.013、0.064、0.32、1.6、8和40μg/l的溶液。
優選地，人ck-mb系列梯度標準品溶液是用ph＝7.4的pbs緩衝液為溶劑，配製的濃度分別為0、0.064、0.32、1.6、8、40和200μg/l的溶液。
優選地，人myo系列梯度標準品溶液是用ph＝7.4的pbs緩衝液為溶劑，配製的濃度分別為0、0.16、0.8、4、20、100和500μg/l的溶液。
三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液用下述方法製成：
(1)取濃度為2mg/ml的ctni單抗原液100μl，加ph＝7.4的pbs緩衝液，配成濃度為150μg/ml的ctni單抗溶液；
(2)取濃度為1mg/ml的ck-mb單抗原液100μl，加ph＝7.4的pbs緩衝液，配成濃度為150μg/ml的ck-mb單抗溶液；
(3)取濃度為1mg/ml的myo單抗原液100μl，加ph＝7.4的pbs緩衝液，配成濃度為150μg/ml的myo單抗溶液；
(4)各取等體積步驟(1)、(2)和(3)獲得的單抗溶液，混合，得到人ctni單抗溶液濃度為50μg/ml，人ck-mb單抗溶液濃度為50μg/ml，人myo單抗溶液濃度為50μg/ml的三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液；4℃儲存。
優選地，100×稀釋的鏈黴親和素藻紅蛋白中的稀釋劑為ph＝7.4的pbs緩衝液。
優選地，200×稀釋的生物素化鼠抗人二抗igg中的稀釋劑為ph＝7.4的pbs緩衝液。
本發明的試劑盒建立了ami生物標誌物的高通量檢測，可對ctni、ck-mb和myo同時進行快速檢測，時間小於2h，適用於ami的早期診斷、發現，提高對ami的診斷率，並可在ami早期篩查、病情監測、療效觀察與復發判斷預測等各階段都具有較高的臨床檢驗應用價值。
附圖說明
圖1為懸浮晶片檢測三種ami標誌物標準曲線方程圖。
具體實施方式
人ctni標準品(fitzgeraldbiotech公司，貨號:30r-at033，100μg，5mg/ml溶於150mmnacl，5mmcacl2，20mmtris，ph7.5的緩衝液，來源:人類心肌)。
人ck-mb標準品(fitzgeraldbiotech公司，貨號：30-1082，250μg，純度>90％，5mg/ml溶於50％甘油、tris緩衝液，ph6.3-7.2，來源：人類心肌)。
人myo標準品(fitzgeraldbiotech公司，貨號：30-1005，1mg，純度>95％，2mg/ml溶於50％甘油、150mmnacl、10mm磷酸鈉、0.05％疊氮化鈉，ph值7的緩衝液，來源：人類心肌)
鏈黴親和素藻紅蛋白(lifescience公司，貨號：s866，1mg/ml，純度>99％)
生物素化鼠抗人二抗igg(武漢博士德公司，貨號：bm2001，生物素標記抗體含1mg左右親和純化特異性抗體，1：20的生物素標記，0.01mpbs,1％bsa,0.01％硫柳汞)
人ctni單克隆抗體(fitzgeraldbiotech公司，貨號：10r-t123m，1mg，2mg/ml溶於pbs、0.1％nan3緩衝液，ph7.5，來源：小鼠p45-10igg1)。
ck-mb單克隆抗體(fitzgeraldbiotech公司，貨號：10r-3127-af，1mg，1mg/ml溶於pbs緩衝液，ph7.3，來源：小鼠m120222igg1κ)。
myo單克隆抗體(fitzgeraldbiotech公司，貨號：10-m50c，1mg，1mg/ml溶於pbs、0.1％nan3緩衝液，ph7.5，來源：小鼠igg1m0110519)。
在各實施例中：
edc為1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的簡稱；
s-nhs為n-羥基琥珀醯亞胺磺酸鈉鹽的簡稱；
ctni為肌鈣蛋白的簡寫；ck-mb為肌酸激酶同工酶的簡寫；myo為肌紅蛋白的簡寫；
封閉緩衝液為：pbs中含有1wt％bsa,0.05wt％疊氮鈉，ph7.4；
儲備緩衝液為pbs中含有0.1wt％bsa,0.02wt％吐溫-20,0.05wt％疊氮鈉,ph7.4。
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1
一種聯合檢測急性心肌梗死生物標誌物的試劑盒，包括：工作微球探針溶液、人ctni系列梯度標準品溶液、人ck-mb系列梯度標準品溶液、人myo系列梯度標準品溶液，三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液；100×稀釋的鏈黴親和素藻紅蛋白溶液和200×稀釋的生物素化鼠抗人二抗igg溶液；
所述工作微球探針溶液用下述方法製成：
(1)取編碼為35,42和52號的羧基螢光編碼微球分別置於三支的離心管中，用100μlph7.4的pbs重懸後，使所述羧基螢光編碼微球的濃度為1.25×107個微球/ml，分別加入100μlph8.00.1mol/l的pbs，分別加入新鮮配製的10μl濃度為50mg/ml的edc水溶液和10μl濃度為50mg/ml的s-nhs水溶液，室溫下攪拌20min，使羧基螢光編碼微球活化；
(2)在裝有活化後的35號羧基螢光編碼微球的離心管中加入10μgctni；在裝有活化後的42號羧基螢光編碼微球的離心管中加入10μgck-mb；在裝有活化後的52號羧基螢光編碼微球的離心管中加入10μgmyo；分別加ph7.4的pbs使終體積到500μl，室溫下以700rpm旋渦混勻3h，以14,000g離心5min，棄去上清液；分別加入100μl封閉緩衝液重懸並封閉交聯微球保持20min；離心，棄上清，用ph7.4的pbs清洗；
(3)分別用150μl儲備緩衝液重懸步驟(2)獲得的微球，用血球計數器確定濃度，用儲備緩衝液稀釋到3000個/μl，分別得到偶聯有ctni探針微球溶液、偶聯有ck-mb探針微球溶液和偶聯有myo探針微球溶液；
(4)分別取偶聯有ctni探針微球溶液、偶聯有ck-mb探針微球溶液和偶聯有myo探針微球溶液50μl，混合，得工作微球探針溶液，工作微球探針溶液中偶聯有ctni探針微球的濃度為1000個/μl，偶聯有ck-mb探針微球的濃度為1000個/μl，偶聯有myo探針微球的濃度為1000個/μl，4℃儲存；
人ctni系列梯度標準品溶液是用ph＝7.4的pbs緩衝液為溶劑，配製的濃度分別為0、0.013、0.064、0.32、1.6、8和40μg/l的溶液。
人ck-mb系列梯度標準品溶液是用ph＝7.4的pbs緩衝液為溶劑，配製的濃度分別為0、0.064、0.32、1.6、8、40和200μg/l的溶液。
人myo系列梯度標準品溶液是用ph＝7.4的pbs緩衝液為溶劑，配製的濃度分別為0、0.16、0.8、4、20、100和500μg/l的溶液。
三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液用下述方法製成：
(1)取濃度為2mg/ml的ctni單抗原液100μl，加ph＝7.4的pbs緩衝液，配成濃度為150μg/ml的ctni單抗溶液；
(2)取濃度為1mg/ml的ck-mb單抗原液100μl，加ph＝7.4的pbs緩衝液，配成濃度為150μg/ml的ck-mb單抗溶液；
(3)取濃度為1mg/ml的myo單抗原液100μl，加ph＝7.4的pbs緩衝液，配成濃度為150μg/ml的myo單抗溶液；
(4)各取567μl的步驟(1)、(2)和(3)獲得的單抗溶液，混合，得到人ctni單抗溶液濃度為50μg/ml，人ck-mb單抗溶液濃度為50μg/ml，人myo單抗溶液濃度為50μg/ml的三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液；4℃儲存。
100×稀釋的鏈黴親和素藻紅蛋白中的稀釋劑為ph＝7.4的pbs緩衝液。
200×稀釋的生物素化鼠抗人二抗igg中的稀釋劑為ph＝7.4的pbs緩衝液。
實施例2
一種聯合檢測急性心肌梗死生物標誌物的試劑盒，包括：工作微球探針溶液、人ctni系列梯度標準品溶液、人ck-mb系列梯度標準品溶液、人myo系列梯度標準品溶液，三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液；100×稀釋的鏈黴親和素藻紅蛋白溶液和200×稀釋的生物素化鼠抗人二抗igg溶液；
所述工作微球探針溶液用下述方法製成：
(1)除室溫攪拌時間為10min外，其它同實施例1的工作微球探針溶液製備方法中的步驟(1)；(2)在裝有活化後的35號羧基螢光編碼微球的離心管中加入10μgctni；在裝有活化後的42號羧基螢光編碼微球的離心管中加入10μgck-mb；在裝有活化後的52號羧基螢光編碼微球的離心管中加入10μgmyo；分別加ph7.4的pbs使終體積到500μl，室溫下以500rpm旋渦混勻4h，以12,000g離心6min，棄去上清液；分別加入100μl封閉緩衝液重懸並封閉交聯微球保持20min；離心，棄上清，用ph7.4的pbs清洗；
(3)、(4)同實施例1的工作微球探針溶液製備方法中的步驟(3)、(4)。
人ctni系列梯度標準品溶液是用ph＝7.4的pbs緩衝液為溶劑，配製的濃度分別為0、0.013、0.064、0.32、1.6、8和40μg/l的溶液。
人ck-mb系列梯度標準品溶液是用ph＝7.4的pbs緩衝液為溶劑，配製的濃度分別為0、0.064、0.32、1.6、8、40和200μg/l的溶液。
人myo系列梯度標準品溶液是用ph＝7.4的pbs緩衝液為溶劑，配製的濃度分別為0、0.16、0.8、4、20、100和500μg/l的溶液。
三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液的製備同實施例1的三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液的製備。
100×稀釋的鏈黴親和素藻紅蛋白中的稀釋劑為ph＝7.4的pbs緩衝液。
200×稀釋的生物素化鼠抗人二抗igg中的稀釋劑為ph＝7.4的pbs緩衝液。
實施例3
一種聯合檢測急性心肌梗死生物標誌物的試劑盒，包括：工作微球探針溶液、人ctni系列梯度標準品溶液、人ck-mb系列梯度標準品溶液、人myo系列梯度標準品溶液，三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液；100×稀釋的鏈黴親和素藻紅蛋白溶液和200×稀釋的生物素化鼠抗人二抗igg溶液；
所述工作微球探針溶液用下述方法製成：
(1)除室溫攪拌時間為30min外，其它同實施例1的工作微球探針溶液製備方法中步驟(1)；(2)在裝有活化後的35號羧基螢光編碼微球的離心管中加入10μgctni；在裝有活化後的42號羧基螢光編碼微球的離心管中加入10μgck-mb；在裝有活化後的52號羧基螢光編碼微球的離心管中加入10μgmyo；分別加ph7.4的pbs使終體積到500μl，室溫下以800rpm旋渦混勻2h，以16,000g離心3min，棄去上清液；分別加入100μl封閉緩衝液重懸並封閉交聯微球保持20min；離心，棄上清，用ph7.4的pbs清洗；
(3)、(4)同實施例1的工作微球探針溶液製備方法中的步驟(3)、(4)。
人ctni系列梯度標準品溶液是用ph＝7.4的pbs緩衝液為溶劑，配製的濃度分別為0、0.013、0.064、0.32、1.6、8和40μg/l的溶液。
人ck-mb系列梯度標準品溶液是用ph＝7.4的pbs緩衝液為溶劑，配製的濃度分別為0、0.064、0.32、1.6、8、40和200μg/l的溶液。
人myo系列梯度標準品溶液是用ph＝7.4的pbs緩衝液為溶劑，配製的濃度分別為0、0.16、0.8、4、20、100和500μg/l的溶液。
三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液的製備同實施例1的三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液的製備。
100×稀釋的鏈黴親和素藻紅蛋白中的稀釋劑為ph＝7.4的pbs緩衝液。
200×稀釋的生物素化鼠抗人二抗igg中的稀釋劑為ph＝7.4的pbs緩衝液。
實施例4
檢測實驗(使用實施例1試劑盒)
(1)取試劑盒中人ctni系列梯度標準品溶液、人ck-mb系列梯度標準品溶液、人myo系列梯度標準品溶液，以10μl/孔分別加入96孔微滴定板的反應孔中，每孔分別加入10μl三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液，再每孔再加入2μl工作微球探針溶液，ph＝7.4的pbs補足50μl反應體系，在37℃下，中速振蕩1h。然後加入200×稀釋的生物素化鼠抗人二抗igg溶液50μl/孔，再次漩渦振蕩器上37℃中速振蕩1h。然後進行磁分離，再加入ph＝7.4的pbs，重複磁分離三次。最後加入100×稀釋的鏈黴親和素藻紅蛋白溶液50μl/孔，37℃中速振蕩反應0.5h，用luminex懸浮晶片檢測系統進行測定，獲得ctni、ck-mb和myo系列標準品溶液各個不同濃度的中位螢光強度值，由這些中位螢光強度值獲得ctni、ck-mb和myo的檢測標準曲線，見圖1。
(2)對10例ami住院患者和5例健康體檢人員，抽取每名患者靜脈血5ml，並編號，將血樣以5000rpm/min4℃離心10min，取上清後置於-20℃保存。檢測時各取10μl加入到96孔微滴定板的反應孔中；
(3)用移液器分別吸取ph＝7.4的pbs緩衝液28μl，對每孔加入的血清進行吹打混勻；
(4)用移液器分別於每孔加入10μl三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液，再用移液器分別取工作微球探針溶液2μl加入到上述孔中，在漩渦振蕩器上37℃中速振蕩1h。反應後加入200×稀釋的生物素化鼠抗人二抗igg50μl/孔，再次漩渦振蕩器上37℃中速振蕩1h。然後進行磁分離，pbs清洗三次，棄上清；
(5)加入100×稀釋的鏈黴親和素藻紅蛋白溶液，50μl/孔，37℃中速振蕩反應0.5h；
(6)懸浮晶片系統讀取100個微球/孔，獲得中位螢光強度值，代入獲得的標準曲線中，計算10例ami住院患者和5例健康體檢人員血清中樣品ctni、ck-mb和myo的檢測值，具體檢測結果如表1所示。從表1可以看出，針對10例ami住院患者血清樣品，檢出ctni、ck-mb和myo值分別為12.27±3.47、19.83±3.37和547.74±121.22μg/l，全部超過陽性限值標準；對5例健康體檢人員檢測的三種ami標誌物分別為：0.40±0.05、2.88±1.51和23.37±9.51μg/l，未發現有超過陽性限值標準。經過配對t檢驗發現，ami患者與健康體檢人員血清樣品ctni、ck-mb和myo檢測值有顯著性差異(p<0.01)。
表110例ami住院患者和5例健康體檢人員血清ctni、ck-mb和myo檢測值
實施例5
檢測實驗(使用實施例1試劑盒)
(1)抽取1名疑似患者靜脈血5ml，將血樣以5000rpm/min4℃離心10min，取上清後置於-20℃保存。檢測時取10μl加入到96孔微滴定板的反應孔中；
(2)用移液器吸取ph＝7.4的pbs緩衝液28μl，對該孔加入的血清進行吹打混勻；
(3)用移液器在該孔加入10μl三聯急性心肌梗死生物標誌物單抗溶液，再用移液器取工作微球探針溶液2μl加入到該孔中，在漩渦振蕩器上37℃中速振蕩1h。反應後加入200×稀釋的生物素化鼠抗人二抗igg50μl，再次漩渦振蕩器上37℃中速振蕩1h。然後進行磁分離，pbs清洗三次，棄上清；
(4)加入100×稀釋的鏈黴親和素藻紅蛋白溶液，50μl，37℃中速振蕩反應0.5h；
(5)懸浮晶片系統讀取100個微球，獲得中位螢光強度值，代入實施例4步驟(1)獲得的標準曲線中，得到該疑似患者的ctni、ck-mb和myo值分別為：11.3,15.5和236.7μg/l。獲得檢測值跟正常參考範圍(ctni、ck-mb和myo的正常參考範圍分別是0～0.5μg/l，0～5.0μg/l和0～80μg/l)相比，可確認該患者是ami患者。
實驗證明，實施例2和實施例3的試劑盒也可以用於檢測急性心肌梗死生物標誌物。