一種含可溶性二硫化鉬的微生物菌劑及其應用的製作方法

2023-06-14 15:31:06

本發明屬於生物
技術領域：
或者環境治理
技術領域：
，涉及一種微生物菌劑的製備及應用該微生物菌劑進行土壤重金屬的脫除。
背景技術：
：隨著染料、電鍍等工業的發展，以及人們對金屬礦藏的不合理開採，越來越多的重金屬進入水體。重金屬具有致突變、致癌、致畸作用。重金屬很難被生物體降解，且能通過食物鏈傳遞並富集，可經多種途徑進入人體，嚴重危害人體健康。常見的土壤重金屬汙染治理方法主要包括物理法、化學法和生物法。物理法和化學法見效相對較快，但成本偏高，容易產生二次汙染。生物法主要是利用植物和微生物對重金屬的吸附和鈍化作用。其中微生物治理重金屬汙染，具有成本低、高效率、對環境破壞小、無二次汙染、適合於大面積修復等優點，應用潛力巨大。將微生物製備成微生物菌劑並用作土壤修復劑，在土壤重金屬汙染治理已初見成效。然而微生物的生存和繁殖對環境有一定要求，在實際應用過程中死亡率高，極大限制了微生物在土壤汙染治理中的應用，因此急需開發一種新型的高存活率土壤治理菌劑。技術實現要素：本發明的技術目的在於提供一種含可溶性二硫化鉬材料的新型微生物菌劑，能顯著耐受並吸附重金屬的細菌，可用於重金屬汙染的土壤的治理。具體的，本發明的技術方案如下：一種含可溶性二硫化鉬的微生物菌劑，所述微生物菌劑包含巨大芽孢桿菌xj06-26和可溶性二硫化鉬材料；所述巨大芽孢桿菌xj06-26保藏編號為gdmccno：60094，所述可溶性二硫化鉬材料由二硫化鉬與殼聚糖複合而成。本發明的方法，所述微生物菌劑具體製備方式為：將巨大芽孢桿菌xj06-26菌種擴培後，接種至發酵罐中，菌種達到對數生長期時，向發酵液中添加可溶性二硫化鉬材料，繼續培養後收集發酵液；發酵液離心後收集菌體，並加入保護劑，隨後冷凍乾燥得到凍幹菌粉；根據凍幹菌粉實際活菌數，以腐殖酸和膨潤土的混合物為載體，配製成所述微生物菌劑。其中，所述保護劑為脫脂奶粉、甘油、海藻糖中任一種或幾種的組合。本發明的方法，所述可溶性二硫化鉬材料添加量為0.03-0.08ppm；優選0.08ppm。添加0.03-0.08ppm可溶性二硫化鉬材料能使存活率提高5.9％-8.9％，提高微生物菌劑對重金屬鉛的耐受性和吸附性。進一步的，所述可溶性二硫化鉬材料具體製備方法為：二硫化鉬加上殼聚糖在研缽中研磨，後加入bmipf6離子溶液於研缽中繼續研磨；收集研磨的混合物，然後分別用丙酮，dmf，乙酸清洗後得到。採用這一製備方法容易大規模製備可溶性二硫化鉬，同時所得材料中包含大顆粒二硫化鉬，更有利於吸附重金屬離子。本發明所述的微生物菌劑在常溫下存放半年後，檢測其活菌數和存活率，同時發現添加可溶性二硫化鉬材料能提高微生物菌劑的耐鉛性能、鉛吸附能力。本發明的另一目的在於提供所述微生物菌劑在重金屬汙染土壤治理中的應用。本發明中提供了一種具體的應用方法：將菌劑接種到重金屬鉛汙染土壤樣品中，置於25℃恆溫培養箱中培養待測。相比於未接種土樣、接種不含可溶性二硫化鉬材料的菌劑土樣，接種含可溶性二硫化鉬材料的菌劑土樣中的可交換態鉛含量顯著降低。本發明的作用機理可能在於：經殼聚糖修飾後的可溶性二硫化鉬材料，具有高比表面積、高吸附性，促進巨大芽孢桿菌的孢子形成和健壯，使得菌劑存活率和復活速度提高；同時二硫化鉬對重金屬離子有一定吸附能力，減緩重金屬離子對微生物的影響，最終增強微生物菌劑對環境耐受力的活力，更好發揮治理土壤重金屬汙染的作用。本發明的有益效果在於：以殼聚糖修飾二硫化鉬，製得可溶性二硫化鉬材料，該材料在水溶液中有良好分散性，將該材料加入前期篩選得到的一株耐重金屬的巨大芽孢桿菌xj06發酵液中製得微生物菌劑。添加0.03-0.08ppm可溶性二硫化鉬材料能使存活率提高5.9％-8.9％，提高微生物菌劑對重金屬鉛的耐受性和吸附性，顯著增強對土壤中有害價態。附圖說明圖1殼聚糖修飾前後的二硫化鉬在水相中分散性比較(左：修飾前；右：修飾後)；圖2殼聚糖修飾後的可溶性二硫化鉬材料的掃描電鏡觀察；圖3殼聚糖修飾後的可溶性二硫化鉬材料的拉曼光譜；圖4殼聚糖(cs)、未修飾二硫化鉬(mos2)、殼聚糖修飾後二硫化鉬(cs-mos2)紅外吸收光譜。具體實施方式實施例1：本實施例說明本發明使用到的可溶性二硫化鉬材料的製備方法將250mg二硫化鉬加上100mg殼聚糖在研缽中研磨10分鐘；再加入0.5mlbmipf6離子溶液於研缽中，研磨50分鐘；收集研磨的混合物，然後分別用丙酮，dmf，0.5％乙酸清洗以去掉離子溶液和多餘的殼聚糖，循環清洗3次後，收集沉澱並懸浮於無菌水中，儲存於4℃冰箱。上述製備方法涉及的具體步驟可參考相關文獻(zhangetal.,(2015)aone-stepapproachtothelarge-scalesynthesisoffunctionalizedmos2nanosheetsbyionicliquidassistedgrinding.nanoscale7:10210-10217)，本發明的製備方法基於本發明菌劑製備的需求作了進一步改進，文獻中採用的方法可以獲得小顆粒二硫化鉬，但產率較低。本發明需要可溶性二硫化鉬的量較大，因此在本發明中，省略後續的離心步驟。本發明改進後的方法容易大規模製備可溶性二硫化鉬，同時所得材料中包含大顆粒二硫化鉬，更有利於吸附重金屬離子。與未處理的二硫化鉬相比，經殼聚糖修飾的二硫化鉬在水相中具有更好的分散性(圖1)，掃描電鏡觀察結果顯示所製備的可溶性二硫化鉬材料為層狀結構(圖2)，拉曼結果顯示該可溶性二硫化鉬材料為約包含10層二硫化鉬(圖3)，紅外吸收光譜結果顯示修飾後的可溶性二硫化鉬材料含有殼聚糖與二硫化鉬的特徵吸收峰，表明該材料為殼聚糖與二硫化鉬的複合物(圖4)。實施例2：微生物菌劑的製備在前期工作中，我們篩選誘變得到該巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)xj06-26，於2016年10月17日保藏於廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏編號為：gdmccno：60094(該部分內容已在申請號為201610986212.0的專利中詳細闡述)。巨大芽孢桿菌xj06-26菌種擴培後，接種至發酵罐中，在8-10h菌種達到對數生長期時，向發酵液中添加0.03-0.08ppm可溶性二硫化鉬材料，繼續培養21h後收集發酵液。發酵ph值為6-7.5，溫度33-38℃，攪拌速度150rpm。在-6℃-4℃下，將發酵液5500rpm離心後收集菌體，並加入保護劑(保護劑由10％脫脂奶粉、5％甘油及2％海藻糖組成，三者體積比為1:1:0.1)，隨後冷凍乾燥得到含水率約為1％的凍幹菌粉。根據菌劑實際活菌數，以腐殖酸和膨潤土(兩者重量比1.5:1)的混合物為載體，配製成活菌數為5.2億/g的菌劑。實施例3：可溶性二硫化鉬材料對微生物菌劑存活率的影響按照前述微生物菌劑的製備方法，在對照組中不添加可溶性二硫化鉬材料，在實驗組1中添加未經殼聚糖修飾的可溶性二硫化鉬材料0.08ppm，實驗組2中添加經現有文獻方法製備的殼聚糖修飾的可溶性二硫化鉬材料0.08ppm，在實驗組3、實驗組4、實驗組5中分別在發酵過程中添加經本發明方法製備的0.03ppm可溶性二硫化鉬材料、0.05ppm可溶性二硫化鉬材料、0.08ppm可溶性二硫化鉬材料。將不同實驗組製得的微生物菌劑常溫下存放半年，分別檢測其活菌數和存活率，並與對照組比較。其結果如表1所示：表1可溶性二硫化鉬材料對微生物菌劑存活率的影響如表1所示，對照組、實驗組1、實驗組2、實驗組3、實驗組4、實驗組5的存活率分別是85.1％、87％、86.7％、91％、92％、94％，由此可見採用本發明方法製備的可溶性二硫化鉬，更能保持菌種存活率。與對照組相比，添加0.03-0.08ppm可溶性二硫化鉬材料能使存活率提高5.9％-8.9％。實施例4：可溶性二硫化鉬材料對微生物菌劑耐重金屬性能的影響將實施例3中實驗組3-5製備的不同含量可溶性二硫化鉬材料的微生物菌劑(活菌總數均為5億)加入50ml含不同濃度鉛(5、10、20、30、40、50、60mg/l)的發酵培養基中，搖瓶搖床培養(25℃，225rpm)一周。隨後將發酵培養基中的巨大芽孢桿菌塗布於分離培養基平板上，25℃培養6-7天。結果顯示，對照組菌劑在暴露於含鉛濃度高於30mg/l的發酵培養基中一周後，平板上無菌落生長；而實驗組3、實驗組4、實驗組5在暴露於含鉛濃度高於40mg/l的發酵培養基中一周後，平板上無菌落生長，可見可溶性二硫化鉬材料能提高微生物菌劑對重金屬鉛的耐受性。實施例5：可溶性二硫化鉬材料對微生物菌劑重金屬鉛吸附的影響將實施例3中實驗組3-5製備的不同含量可溶性二硫化鉬材料的微生物菌劑(活菌總數均為5億)加入50ml含鉛(0.3mg/l)的生理鹽水溶液中，搖瓶搖床培養(25℃，225rpm)一周後，取上清測定吸附前後溶液中鉛離子濃度的變化。結果顯示如下表2所示：表2可溶性二硫化鉬材料對微生物菌劑重金屬鉛吸附的影響組別鉛離子濃度對照組0.21實驗組30.18實驗組40.145實驗組50.1如表2所示，對照組、實驗組3、實驗組4、實驗組5中的鉛離子濃度分別為0.21mg/l、0.18mg/l、0.145mg/l、0.1mg/l，可見可溶性二硫化鉬材料的添加有助於微生物菌劑對重金屬鉛的吸附。實施例6：可溶性二硫化鉬材料對微生物菌劑轉變土壤中鉛價態性能的影響向風乾過篩的土壤中加入硝酸鉛溶液，噴施去離子水保持其含水量為田間土壤持水量的70％，在室溫下保持兩個月後，風乾過2mm篩，製成鉛汙染濃度為10mg/kg的土壤樣品。隨後將實施例3中實驗組3-5製備的不同含量可溶性二硫化鉬材料的微生物菌劑(活菌總數均為5億)分別加入50g所製得的鉛汙染土壤樣品中，置於25℃恆溫培養箱中分別培養待測。以同樣方法製備的相同鉛汙染濃度的土壤樣品為對照組，進行同樣的檢測。30天後取上述幾種土樣測定其不同形態鉛的含量。檢測方法參考文獻「張漢萍等.土壤中鉛的含量及其化學形態分析，理化檢驗-化學分冊，2006,42(9):705-708」中公布的方法。上述幾種土樣中可交換態鉛、碳酸鹽結合態鉛、鐵錳氧化態鉛、有機質結合態鉛的含量如表3所示；表3可溶性二硫化鉬材料對微生物菌劑轉變土壤中鉛價態性能的影響從表3可以看出，接種含可溶性二硫化鉬材料微生物菌劑經30天的菌種繁殖作用後，土壤中可交換態鉛含量顯著降低，與未接種土樣及接種不含可溶性二硫化鉬材料微生物菌劑土樣相比，接種含0.3ppm可溶性二硫化鉬材料微生物菌劑土樣中可交換態鉛分別降低51％和43.5％，同時接種含0.8ppm可溶性二硫化鉬材料微生物菌劑土樣中可交換態鉛分別降低55％和47.7％，此外接種含可溶性二硫化鉬材料微生物菌劑土樣中碳酸鹽結合態、鐵錳氧化物結合態、有機質結合態等非活性形態的鉛含量均顯著上升，說明接種含可溶性二硫化鉬材料微生物菌劑能有效降低土壤中可交換態等有效態鉛的含量。當前第1頁12