檢測等位基因、基因組和轉錄物組的方法和基因型分析譜的製作方法

2023-09-17 01:38:35

專利名稱：檢測等位基因、基因組和轉錄物組的方法和基因型分析譜的製作方法
技術領域：
本發明屬於檢測兩種個體混合物中等位基因、基因組和轉錄物組的方法和基因型分析譜領域。
背景技術：
產前診斷方法的主要目標是獲得胎兒或胚胎的遺傳信息。在臨床實踐中使用的產前遺傳診斷方法主要涉及侵入性技術，如羊水診斷、絨毛膜絨毛取樣和胎兒血液取樣或活組織檢查。那些技術涉及直接從胎兒或間接從雌性生殖結構中獲取樣品。由於那些方法的高度侵入性性質，它們易於對母體或胎兒引起併發症。可以在羊水診斷情況下引證的這樣的併發症的例子是感染的風險、伴隨可能的異源免疫的胎兒-母體出血、羊水損失和腹痛。不同的研究已經評估羊水診斷後流產風險是0.06% -2. 1%，高於對照組的風險 (Eddleman, Obstet Gynecol 2006 108(5) 1067-1072)。結果，羊水診斷僅被推薦給那些生產具有臨床上顯著的遺傳變異的孩子的風險高於醫源性流產的風險的女性，並且許多內科醫生更喜歡引證與他們的經驗相當的風險(代表性地1/300-1/500)。為了限制引起上述併發症風險和通常是令人厭惡和/或成為母親壓力來源的侵入性產前診斷技術的使用，非侵入性方法的發展構成了現代產科學的主要目標。特別是，在母親血液中循環的胎兒細胞構成了作為產前遺傳診斷潛在應用的遺傳物質來源(Bianchi，Br J Haematol 1999 105 :574-583 ；Fisk,Curr Opin Obstet Gynecol 1998 10:81-83)。在懷孕期間，胎兒來源的不同細胞類型穿過胎盤並在母親血液中循環 (Bianchi，Br J Haematol 1999 105 :574-583)。這樣的細胞類型包括淋巴樣細胞和類紅細胞、髓系前體和滋養層上皮細胞(細胞滋養層和合胞滋養層)。已經描述了以產前診斷為目的的用於分析在母親血液中循環的胎兒細胞的基因組的方法，但是它們仍然相對地限制了診斷的靈敏度和特異性(Di Naro等，Mol Hum Reprod 2000 6 :571-574 ；Watanabe φ, Hum Genet 1998 102 :611-615 ；Takabayashi φ, Prenat Diagn 1995 15 :74-77 fekizawa 等，Hum Genet 1998 102:393-396)。開發非侵入性的高度特異的產前診斷方法的優勢來自於使用其以減少在最終該結果是陰性的孕婦中實施的侵入性診斷方法的比例的可能性。作為例子，在21三體情況下(涉及1/700女性)，在法國，通常僅當母親是38歲時才提供產前診斷，而能夠檢測60 %的21三體病例、 價格是羊水診斷價格的5%的生化分析實驗被推薦給較年輕的女性。但是，40%的21三體病例不能由目前可利用的實驗檢測出。已經描述了使用FISH技術在分離自母親血漿的胎兒細胞中進行21三體的產前檢測。這個方法是有趣的，但是由於胎兒細胞在血漿中很少(1/500-1/2000)並經常包括凋亡細胞，可靠的診斷將需要在非常大量的細胞上實施所述方法，導致其不能常規地完成。此外，整倍體胎兒細胞不能通過該方法鑑別。該方法的一個局限性源自於在血液中循環的胎兒細胞以非常低的濃度存在。基於沒有提前挑選的血液樣品中Y染色體的PCR檢測的研究已經確定要被檢測的胎兒細胞的平均數是大約每毫升血液1個胎兒淋巴細胞(Bianchi，J Perinat Med 1998 26 =175-85) 最近，由於改進的富集技術產生更多細胞，該胎兒細胞的平均數已經向上修訂。一個新近的研究發現平均值是每毫升血液37個胎兒淋巴細胞(HuangJrenatal Diagnosis 2008 28 892-899)。因此，需要改進檢測胎兒細胞等位基因和胎兒遺傳變異的方法和手段。

發明內容
本發明的實施方式涉及檢測胎兒等位基因和胎兒遺傳變異的方法和基因型分析譜。本發明的一個實施方式是一種檢測胎兒標識符的方法，包括獲得包含母本細胞和胎兒細胞混合物的樣品；將所述樣品分成子樣品；篩選或基因型分析子樣品中胎兒標識符的存在；及從至少一個子樣品的胎兒細胞中鑑定至少一個胎兒標識符的存在。本發明的實施方式可以和可能包括以下的一種或多種一種方法，進一步包括在至少一個子樣品上實行子樣品擴增以提供擴增產物；一種方法，進一步包括將擴增產物分成等份，其中篩選或基因型分析子樣品中至少一個胎兒標識符的存在包括篩選等份中胎兒標識符的存在；一種方法，其中子樣品擴增包括一種選自以下方法的方法全基因組擴增、 全轉錄物組擴增、目標核酸擴增、非胎兒標識符的核酸序列的擴增、核酸序列代理(proxy) 的產生和細胞分裂；一種方法，其中預擴增包括全基因組擴增或全轉錄物組擴增；一種方法，其中預擴增包括目標核酸擴增、非胎兒標識符的核酸序列的擴增、核酸序列代理的產生和細胞分裂；一種方法，進一步包括測定母本細胞的遺傳物質在一系列目標基因座上是純合的或雜合的，以測定母本基因型，其中篩選或基因型分析等份或子樣品中胎兒標識符包括篩選或基因型分析等份或子樣品中在至少一個目標基因座上不同於母本基因型的基因型，其中不同於母本基因型的基因型的存在顯示了在擴增的產物中提供信息的父本等位基因的存在，和其中鑑定至少一個胎兒標識符的存在包括在至少一個等份或子樣品中鑑定提供信息的父本等位基因；一種方法，進一步包括在測定母本細胞的遺傳物質是純合的或雜合的之前選擇目標基因座；一種方法，進一步包括從目標基因座中選擇實驗基因座，其中篩選包括篩選等份中實驗基因座上不同於母本基因型的基因型；一種方法，其中實驗基因座的選擇包括篩選混合的母本核酸和胎兒核酸的樣品中在目標基因座上不同於母本基因型的基因型，並在混合的母本核酸和胎兒核酸的樣品中選擇具有非母本基因型的目標基因座作為實驗基因座；一種方法，進一步包括分析被鑑定為含有提供信息的父本等位基因的等份或子樣品以檢測遺傳變異；一種方法，進一步包括採集一部分被鑑定為含有提供信息的父本等位基因的等份或子樣品，其中分析被鑑定為含有提供信息的父本等位基因的等份或子樣品以檢測遺傳變異包括分析採集的部分等份或子樣品；一種方法，其中採集的部分是等份或子樣品的同質部分；一種方法，其中採集的部分是等份的非同質部分；一種方法，進一步包括在分析擴增的產物之前從至少兩個子樣品中採集被鑑定為含有提供信息的父本等位基因的等份並合併等份；一種方法，其中遺傳變異是選自染色體重排、拷貝數變異和多態性的胎兒遺傳變異；一種方法，其中分析包括測定包含提供信息的父本等位基因的等份中母系遺傳的等位基因和父系遺傳的等位基因的比例，分析所述比例以測定遺傳變異的存在；一種方法，其中分析包括測定包含提供信息的父本等位基因的等份中等位基因的拷貝數，分析等位基因的拷貝數以測定遺傳變異的存在；一種方法，進一步包括從至少兩個子樣品中分析被鑑定為含有提供信息的父本等位基因的擴增產物以檢測嵌合性或異卵雙胞胎的存在；一種方法，其中分析的等份或子樣品不是篩選或基因型分析胎兒標識符的存在的等份或子樣品，而是來自於與作為篩選或基因型分析胎兒標識符的存在的等份相同的子樣品；一種方法，其中所述目標基因座對於母本基因型全部是純合的，對於母本基因型全部是雜合的，或者包含對於母本基因型的純合基因座和雜合基因座的混合物；一種方法，其中所述目標基因座對於母本基因型全部是純合的；一種方法，其中擴增的產物包括基因組DNA 或互補DNA ；—種方法，其中測定母本基因型包括使用SNP譜以基因型分析母本遺傳物質的樣品，其中母本遺傳物質來自作為母本細胞來源的同一個個體；一種方法，其中母本遺傳物質的來源選自血液、血清、血漿、尿液、宮頸拭子、眼淚、唾液、口腔拭子或皮膚；一種方法，其中母本遺傳物質的來源選自血液或口腔拭子；一種方法，其中母本核酸和胎兒核酸的混合物是無細胞核酸混合物；一種方法，其中母本和胎兒無細胞核酸樣品的來源是孕婦的血液、 血清、血漿、尿液、宮頸拭子、宮頸灌洗、子宮灌洗或後穹窿穿刺；一種方法，包括在單一等份或子樣品中選擇和篩選或基因型分析多於一個實驗基因座，在多於一個等份或子樣品中選擇和篩選或基因型分析多於一個實驗基因座，或在多於一個等份或子樣品中選擇和篩選或基因型分析一個實驗基因座；一種方法，包括在第一等份或子樣品中鑑定提供信息的父本等位基因之後，在至少第二子樣品中選擇和篩選或基因型分析第二目標基因座；一種方法， 其中劃分所述樣品以產生具有細胞泊松分布或非泊松分布的子樣品；一種方法，其中每一個子樣品包含至多一種細胞；一種方法，進一步包括在篩選或基因型分析之前匯集來自兩個或更多個子樣品的等份；一種方法，其中匯集包括含有等份的排和列的孔的索引系統的應用；一種方法，進一步包括在分成子樣品之前富集樣品的胎兒細胞；一種方法，其中富集包括胎兒細胞超過母本細胞的差異擴增；一種方法，其中同質部分的擴增產物被分成等份； 以及一種方法，其中非同質部分的擴增產物被分成等份。本發明的另一種實施方式是用於檢測胎兒等位基因的單核苷酸多態性(SNP)譜， 包括至少一個包含大約5個至大約100個特異於單一染色體的獨特SNP的染色體特異譜， 其中在所有主要群組中測量的每一個SNP的頻率範圍在大約30% -大約50% ；且其中SNP 譜中SNP的總數是在大約5個至大約100個SNP之間。
具體實施例方式本發明的實施方式涉及檢測胎兒等位基因(即，非母本等位基因/提供信息的父本等位基因)和胎兒遺傳變異的方法和基因型分析譜。本發明的實施方式涉及胎兒等位基因和胎兒遺傳變異的檢測，不管胎兒的性別且不需要父本核酸序列作為參考樣品。通過區別母本細胞和胎兒細胞，優選地逐一細胞地，本發明的實施方式克服了由母本血液中胎兒細胞的低豐度施加的資源限制並保護了胎兒基因組或轉錄物組的完整性以用於比目前可利用的方法更廣泛的分析。此外，通過逐一細胞地區分胎兒細胞，本發明的實施方式涉及嵌合性和異卵雙胞胎的檢測。
在本發明的一種優選實施方式中，對母本樣品進行基因型分析以鑑定純合的目標基因座，隨後對這些純合的目標基因座進行基因型分析以檢測包含胎兒細胞的樣品中胎兒雜合的基因座的存在。本領域技術人員將理解，在本文描述的任何一個實施方式中，可選擇性地對母本樣品進行基因型分析以鑑定雜合的目標基因座，隨後對這些雜合的目標基因座進行基因型分析以檢測包含胎兒細胞的樣品中胎兒的純合基因座的存在。在一些實施方式中，獲得並富集母本細胞和胎兒細胞的混合物以產生相對於母本細胞的胎兒細胞濃縮的樣品。然後將所述濃縮的樣品分成子樣品使得每一個子樣品中優選地僅包含一個細胞。然後將這些子樣品的每一個進行擴增以生產相應於每一個子樣品的擴增產物，假設接近於基因組相對於細胞。然後將擴增產物分成等份。然後將這些等份單獨地在至少一個基因座上篩選非母本等位基因，所述至少一個基因座之前在母本樣品中被鑑定為純合的；或者在至少一個基因座上進行基因型分析，所述至少一個基因座之前在母本樣品中被鑑定為雜合的； 分別伴隨著雜合基因型或純合基因型的檢測，顯示了在等份中非母本等位基因和因此的胎兒基因組或轉錄物組的存在。檢測雜合基因型可以通過僅在選擇的基因座上篩選非母本等位基因來完成。然後對相應的未篩選的等份進行進一步分析以檢測胎兒遺傳變異，其中至少一個等份包含完整的胎兒基因組或轉錄物組。在本發明的另一種優選實施方式中，如上所述的對母本樣品進行基因型分析，獲得母本細胞和胎兒細胞的混合物，濃縮樣品的胎兒細胞並將樣品分成子樣品。選擇至少一個目標基因座的譜用於篩選或基因型分析子樣品，在所述至少一個目標基因座處，所述母本樣品是純合的。在至少一個這些基因座上對每一個子樣品單獨地進行篩選或基因型分析，其中雜合基因型的檢測再次顯示子樣品中非母本等位基因的存在。然後分析雜合的子樣品中等位基因的比例以檢測胎兒拷貝數變異。如本文中所使用的，核酸指脫氧核糖核酸(如DNA、mtDNA、gDNA或cDNA)、核糖核酸(如RNA或mRNA)或本領域已知的任何其它的核酸變異體。如本文中所使用的，目標基因座指基因組基因座或轉錄物組基因座，其中包含母本遺傳物質的樣品在此處具有可檢測的基因型。在具有多於一個目標基因座的一些實施方式中，所述目標基因座由完全的純合基因座、完全的雜合基因座或純合基因座和雜合基因座的混合物組成。目標基因座譜也可以包含完全純合的基因座、完全雜合的基因座或純合基因座和雜合基因座的混合物。如本文中所使用的，實驗基因座指選擇的用於在包含胎兒遺傳物質的樣品中進一步進行基因型分析的目標基因座。如本文中所使用的，胎兒標識符指樣品或部分樣品是胎兒來源的任何指示物。胎兒標識符可以包括任何遺傳變異或其它信息。胎兒標識符的一個例子是胎兒等位基因。如本文中所使用的，胎兒等位基因指提供鑑定如同胎兒的遺傳來源性能的父本等位基因。父本等位基因是在父本樣品中存在的任何等位基因。但是，如本文中所使用的，提供信息的父本等位基因是與非母本等位基因(如本文中所使用的)或胎兒等位基因(如本文中所使用的)等同的任何等位基因。如本文中所使用的，遺傳變異指核酸序列中的任何變異。遺傳變異的範圍從單鹼基對變異到染色體變異，或者本領域已知的任何其它變異。遺傳變異可以是簡單序列重複、 短串聯重複、單核苷酸多態性、易位、倒位、缺失、重複或任何其它拷貝數變異。在一些實施方式中，染色體變異是染色體異常。例如，染色體變異可以是非整倍性、倒位、易位、缺失或重複。遺傳變異可以是嵌合的。例如，遺傳變異可以與遺傳狀況或遺傳狀況的風險因子(如囊腫性纖維化、泰-薩克斯病、亨廷頓病、阿爾茨海默病和多種癌症)關聯。遺傳變異還可以包括任何突變、染色體異常或在上述引用的優先權文件中公開的其它變異(如非整倍性、 微缺失或微重複)。遺傳變異在表型上可以具有正效果、負效果或中性效果。例如，染色體變異可以包括有利的、有害的或中性變異。在一些實施方式中，所述遺傳變異是疾病或失調的風險因子。在一些實施方式中，所述遺傳變異編碼期望的表型形狀。獲得樣品(如，包含母本細胞和胎兒細胞的混合物)在本發明的實施方式中所述的母本樣品、混合母本細胞和胎兒細胞的樣品和混合母本和胎兒無細胞核酸的樣品可以從血液中獲得。在一些實施方式中，抽取大約20-40mL 的孕婦的血液。可以在懷孕期間的任何時間點採集血液樣品。例如，在一些實施方式中，在第一個三個月期間採集母本樣品。在其它實施方式中，在第二個三個月期間採集母本樣品。 在優選的實施方式中，在10-18周孕齡時採集血液。但是，可以在懷孕早期或18周孕齡後採集血液。可以根據尋求的信息或產前護理的標準改變採集的時間。也可以在一天間任何時間採集血液樣品。在一些實施方式中，在早上採集血液。在其它實施方式中，在下午採集血液。可以從身體的任何合適區域採集血液，包括胳膊、腿，或通過中心靜脈導管易取得的血液。在一些實施方式中，在處理或活動後採集血液。例如，可以在盆骨檢查後採集血液。 也可以協調採集的時機以增加樣品中存在的胎兒細胞數。例如，可以在鍛鍊或誘導血管擴張處理後採集血液。在採集之後，血液可以與多種成分結合以保存或製備用於後續技術的樣品。例如， 在一些實施方式中，採集之後，血液用抗凝血劑、細胞固定劑、或DNA或RNA保護劑處理。在優選的實施方式中，使用包含抗凝血劑如EDTA或肝素的真空採集管通過靜脈穿刺採集血液。同樣可以使用塗覆有肝素的注射器和皮下注射器針頭採集血液。血液還可以與將用於細胞培養的成分結合。例如，在一些實施方式中，血液與細胞培養基或補充的細胞培養基 (如細胞因子)結合。同樣可以從本領域已知的其它來源獲得母本樣品，所述其它來源包括血清、血漿、 尿液、宮頸拭子、眼淚、唾液、口腔拭子、皮膚或其它組織。混合的母本細胞和胎兒細胞的樣品和混合的母本和胎兒無細胞核酸的樣品同樣可以從本領域已知的其它來源獲得，所述其它來源包括血清、血漿、尿液、宮頸拭子、宮頸灌洗、子宮灌洗、後穹窿穿刺、淋巴結或骨髓。 例如，在一些實施方式中，混合的母本和胎兒無細胞核酸樣品的來源是宮頸拭子。在一種優選的實施方式中，胎兒無細胞核酸包含DNA。在另一種實施方式中，胎兒無細胞核酸包含 RNA 或 cDNA。富集胎兒細胞為了解決母本細胞和胎兒細胞的混合樣品中胎兒細胞的低豐度問題，可以富集這些樣品的胎兒細胞。由於紅血球在成熟時是無核的，而在未成熟時是有核的，這些性質可以被用於區分樣品中母本紅血球和胎兒紅血球。可以通過正選擇、負選擇或正選擇和負選擇的結合富集樣品中胎兒細胞。在一些實施方式中，直接捕獲胎兒細胞。在其它實施方式中， 捕獲母本細胞並從剩餘樣品中採集胎兒細胞。
可以基於細胞物理性質的差異富集樣品中的胎兒細胞。例如，可以基於密度、細胞膜結構或形態富集樣品中的胎兒細胞。在一些基於密度的實施方式中，使用如FIC0LL (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) >PERC0LL (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway，NJ)、碘克沙醇(Axis Shield, Oslo,Norway) ,NYCODENZ (Axis Shield, Oslo, Norway)或蔗糖的密度梯度。在一些基於細胞膜結構的實施方式中，使用裂解試劑(如氯化銨)。在一些基於形態的實施方式中，使用流式細胞術或過濾器。還可以基於本領域已知的其它物理性質富集樣品中的胎兒細胞。例如，可以基於介電性能或磁性富集樣品中的胎兒細胞。此外，可以通過採集骨髓富集樣品中的胎兒細胞。還可以基於細胞生化性質的差異富集樣品中的胎兒細胞。例如，可以基於抗原、核酸、代謝作用、基因表達或表觀遺傳差異富集樣品中的胎兒細胞。在一些基於抗原差異的實施方式中，使用磁場梯度中的偶聯抗體的磁珠或順磁珠或連同流式細胞術的螢光標記的抗體。在一些基於核酸差異的實施方式中，使用流式細胞術。在一些基於代謝作用差異的實施方式中，使用通過流式細胞術或另一種分類技術測量的染料吸收/排除。在一些基於基因表達的實施方式中，使用具有細胞因子的細胞培養。在一些基於表觀遺傳差異的實施方式中，使用細胞培養。還可以基於本領域已知的其它生化性質富集樣品中的胎兒細胞。例如，可以基於PH或運動力富集樣品中的胎兒細胞。此外，在一些實施方式中，使用多於一種方法富集胎兒細胞。 在本發明的一些實施方式中，通過使用如氯化銨的裂解試劑去除紅血球或通過使用如 FIC0LL (Sigma-Aldrich，St. Louis, MO)、PERC0LL (GE Healthcare Life Sciences Piscataway, NJ)或蔗糖的密度梯度分離而富集樣品中的胎兒細胞。密度梯度還可以用於減少白細胞級分。得到的外周血單核細胞(「PBMC」)可以使用來自如Miltenyi Biotec (Gladbach,德國)、Stemcell Technologies (Vancouver, BC,力口拿大)禾口 Dynal Biotech/Invitrogen (Carlsbad, CA)的生產商的磁珠分離技術被進一步富集胎兒細胞。正富集或負消耗或兩者的結合可以用於富集PBMC中的胎兒級分。儘管目前已知沒有胎兒特異表面標記物，已經顯示有多種標記物正富集胎兒細胞至1，000-100，000個母本細胞中1個胎兒細胞。在一些實施方式中，⑶71、⑶34、CD45或 CD235a細胞表面標記物被用於富集胎兒細胞。在一些實施方式中，在胎兒細胞群體中沒有發現的細胞表面標記物通過耗盡成人細胞群體被用於負富集胎兒細胞。在一些實施方式中，CD2、CD3、CDllb, CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123 和 CD61 的結合被用於耗盡成人細胞。使用細胞表面標記物或偶聯螢光標記的細胞內標記物，流式細胞術分類同樣可以用於進一步富集胎兒細胞。細胞內標記物可以包括核染色或抗優先在胎兒細胞中表達的細胞內蛋白(如胎兒血紅蛋白)的抗體。血紅蛋白的氧化已經被鑑定為使用磁場梯度優先富集有核的紅血球(NRBC)的一種途徑(Zborowski，Biophys J 2003 84(4) =2638-2645) 此外，便於從白細胞中分離紅細胞或從PBMC中富集胎兒細胞的微流體裝置已經開發(Huang，I^renatal Diagnosis 2008 28 :892-899)。在本發明的一些實施方式中，通過在培養中差異擴增胎兒細胞超過母本細胞來富集樣品中的胎兒細胞。差異擴增可以通過本領域已知的許多方法實施，包括在如 W02008/048931中描述的在含有幹細胞因子(SCF)的無血清培養基中孵育來自含有母本和胎兒來源的⑶34+細胞的母本血液樣品的細胞，W02008/048931通過參考的方式全部結合
至本文。在本發明的一些實施方式中，母本細胞和胎兒細胞的混合物中胎兒細胞被富集至胎兒細胞母本細胞為大約1 2、大約1 5、大約1 10、大約1 100、大約1 1000、 大約1 10000或大約1 100000，或任意兩個前述值所限定的範圍。分成子樣品在子樣品擴增(優選地使用全基因組擴增(WGA)或全轉錄物組擴增(WTA))、篩選或基因型分析純合或雜合基因座之前，所述樣品可以被分成幾乎沒有足夠細胞的子樣品使得甚至在子樣品擴增(如WGA或WTA)之後所述樣品的染色體拷貝數保持在子樣品中。樣品可以被分成與泊松分布或非泊松分布一致的子樣品。在一些實施方式中，繼續劃分樣品。 例如，可以連續地劃分樣品。在其它實施方式中，平行地劃分樣品。在一些實施方式中，樣品被分成的子樣品體積是小於或小於大約100yL、50yL、 10μ L、1000nL、500nL、400nL、300nL、200nL、100nL、50nL、30nL、10nL、3nL 或 InL,或任意兩個前述值限定的範圍。優選地，每一個子樣品包含的體積不多於lOOnL。在一些實施方式中，每一個子樣品包含不多於大約500、400、300、200或100個細胞，或任意兩個前述值所限定的範圍。優選地，每一個子樣品包含不多於大於50、40、30、20或10個細胞，或任意兩個前述值所限定的範圍。更優選地，每一個子樣品包含不多於大約5、4、3或2個細胞。在一些實施方式中，每一個子樣品包含不多於1個細胞。在一些實施方式中，每一個子樣品包含平均或大約500、400、300、200或100個細胞，或任意兩個前述值所限定的範圍。優選地，每一個子樣品包含平均大約50、40、30、20或 10個細胞，或任意兩個前述值所限定的範圍。更優選地，每一個子樣品包含平均或大約5、 4、3或2個細胞，或任意兩個前述值所限定的範圍。在一些實施方式中，每一個子樣品包含平均小於大約1個細胞、大約1個細胞、或大約1至2個細胞、或任意兩個前述值限定的範圍。樣品的劃分通過本領域已知的任何方法完成，包括使用油塞以造成微流體裝置中單獨細胞的油分離，沉澱至孔中，或由表面張力錨定至平的基底的單體滴狀物。此外，子樣品可以懸浮在將適於後續反應的緩衝液中。例如，子樣品可以懸浮在包含裂解緩衝液和PCR 緩衝液的溶液中，所述裂解緩衝液和PCR緩衝液將使得單步細胞裂解，然後在沒有對子樣品進一步處理下擴增。擴增子樣品為抵補單一細胞或子樣品中有效量的遺傳物質，可以任選地實施子樣品擴增。例如，可以實施核酸複製或細胞分裂。樣品被分成幾乎沒有足夠細胞的子樣品，使得在子樣品擴增之後所述樣品的染色體拷貝數保持在子樣品中。在一種優選的實施方式中，對包含單細胞的子樣品實施子樣品擴增，使得得到的擴增產物表現了母本細胞或胎兒細胞的基因組或轉錄物組。例如，子樣品擴增可以在定位在微孔或通過如本文描述的油塞分離的滴狀物中的單獨細胞上實施。可以使用用於產生額外拷貝的核酸、預示核酸的額外信號或本領域已知的其它核酸代理(如蛋白表達)的任何方法實施核酸複製。在一些實施方式中，使用WGA、WTA或目標核酸擴增技術實施核酸複製。在其它實施方式中，使用產生預示核酸序列的信號的方法實施核酸複製，如INVADER. (Hologic,Inc. ,Bedford,ΜΑ) 在一些實施方式中，僅一部分擴增的序列與核酸模板互補。例如，在一些實施方式中，連續擴增產物包含一部分核酸模板和一部分信號序列。用於核酸複製的常規技術可以包括等溫複製或熱循環(thermocycled) 複製。在一些實施方式中，在SNP基因型分析之前實施核酸複製。但是，核酸複製也可以在 SNP基因型分析之後實施。同樣可以使用本領域已知的任何方法實施細胞複製。在一些實施方式中，在培養基和添加物中培養細胞以產生在本文描述的方法中使用的額外的核酸拷貝。在其它實施方式中，培養細胞且一個或多個細胞完整保留以用於後續的分析。在一些實施方式中，在分成子樣品之前實施細胞複製。優選地，在分成子樣品之後實施細胞複製。分成等份子樣品擴增之後，擴增的產物可以分成等份。這些等份可以用於多種實驗。例如， 在一個實施方式中，擴增產物的一個或多個等份用於檢測胎兒等位基因的存在，而一個或多個其它等份用於檢測包含胎兒基因組或轉錄物組的擴增產物中胎兒遺傳變異的存在。在一些實施方式中，通過陣列檢測被鑑定為包含胎兒基因組或轉錄物組的等份的遺傳變異。 例如，等份可以用於檢測與遺傳環境相關的遺傳變異(如威廉斯症候群、沃爾夫-赫塞豪恩症候群、米-迪症候群、史密斯-馬吉尼斯症候群、天使症候群、迪喬治症候群、普拉德-威利症候群、雅各布森症候群、貓叫症候群、夏科-馬裡-圖思病、微小重複22qll. 2症候群、 囊腫性纖維化、泰-薩二氏病、亨廷頓病、阿爾茨海默病和多種癌症)。可以挑選同質或非同質部分的擴增產物用於分成等份。在一些實施方式中，同質部分的擴增產物被順序分開(如連續地)。在其它實施方式中，同質部分的擴增產物被平行地分開。可選地，可以選擇非同質部分的擴增產物，使用正選擇、負選擇或正選擇和負選擇的組合來分成等份。例如，在一些實施方式中，珠結合(bead-bound)捕獲寡聚物被用於靶定期望部分的用於分成等份的擴增產物。在其它實施方式中，表面結合寡聚物用於排除不期望部分的擴增產物。可基於本領域已知的任何物理或生化性質(包括本文描述的那些) 選擇非同質部分的擴增產物。例如，挑選具有特定電荷、大小或染色體特性的擴增產物部分用於分成等份。在子樣品擴增的可選步驟沒有完成的一些實施方式中，可以移除子樣品的一部分或等份用於後續分析。在一些實施方式中，等份被匯集成兩個或多個等份的組。這使得基於SNP或本文描述的其它反應的數量減少了多達因子N，其中N是每一個匯集中的等份的數量。來自陽性匯集(即具有至少一個與母本基因型不同的基因型的匯集)的等份然後可以逐一等份地重複實驗以鑑定包含胎兒等位基因的等份。在一些實施方式中，在一種實驗基因座處檢測每一個匯集的非母本等位基因。在一些實施方式中，在兩種或更多種實驗基因座處檢測每一個匯集的非母本等位基因。在一些實施方式中，使用索引系統匯集等份，所述索引系統使得鑑定陽性匯集中的陽性等份的來源。例如，可以從每一擴增產物中取兩個或更多個等份以形成NXM擴增等份的索引的匯集。包含至少一個胎兒等位基因的孔可以通過在正交坐標系中定位陽性 N和M匯集的交叉點來鑑定。在一些實施方式中，N(即，在NXM索引中的列數)和M(即， 在NXM索引中的行數)分別是在大約2和大約100之間。優選地，N和M分別在大約8和大約100之間。在一些實施方式中，N是、是大約、是至少、是至少大約、是不多於、是不多於大約 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、32、36、40、 48、50、56、60、64、70、72、80、84、88、90、96、100、192、288、384、480、576、672、768、864、960、 1000，或任意兩個前述值所限定的範圍。在一些實施方式中，M是、是大約、是至少、是至少大約、是不多於、是不多於大約 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、30、32、36、40、48、50、56、60、64、70、72、80、84、88、90、96、100、192、288、384、480、 576、672、768、864、960、1000，或任意兩個前述值所限定的範圍。在優選的實施方式中，同質或非同質部分的擴增產物被索引以使得鑑定陽性等份的來源。獲得或推斷親本基因型可以獲得或推斷親本基因型以幫助非母本等位基因的鑑定。關於非母本等位基因的信息可以依次用於篩選或基因型分析等份或子樣品、或直接分析胎兒基因組的遺傳變異。例如，可以通過直接地基因型分析父本或母本樣品獲得父本或母本基因型，或通過基因型分析來自遺傳相關的家庭成員的樣品推斷父本或母本基因型。但是，在一種優選的實施方式中，沒有必要獲得或推斷父本基因型。例如，在一種優選的實施方式中，僅獲得母本基因型。在一些實施方式中，通過基因型分析遺傳物質獲得父本或母本基因型，所述遺傳物質來自血液、血漿、血清、尿液、口腔拭子、唾液、眼淚、皮膚或父本核酸的任何其它來源 (包括本文描述的那些)。在一些實施方式中，使用無細胞核酸或從源自這些來源之一的細胞中提取的核酸獲得父本或母本基因型。同樣優選地在DNA上實施父本或母本基因型分析，但是也可以在RNA、cDNA或本領域已知的任何其它核酸上實施。在一些實施方式中，擴增和檢測(如，使用基於PCR的方法)父本或母本樣品的模板。但是，在一些實施方式中， 不擴增(如，使用本文描述的方法)父本或母本樣品的模板。還可以通過獲得在在前的遺傳實驗中產生的信息來獲得父本和母本基因型，所述信息如資料庫中的信息、實驗報告中的信息，或來自實施本文描述的方法的在前的懷孕的信息。通過可以使用血緣關係的親屬的基因型推斷父本或母本基因型。例如，遺傳相關的父母、兄弟姐妹、祖父母、姑媽姨媽(aunts)、伯父叔父(uncles)或孩子的基因型可以用於推斷父本或母本基因型。本領域已知的任何多態性可以用於基因型分析親本樣品。例如，可以基因型分析 SNP、單體型、短串聯重複(STR)或其它序列變異。其它遺傳或表觀遺傳標記物同樣可以用於基因型分析親本樣品。例如，可以評估拷貝數變異(CNV)或甲基化模式。在母本核酸和胎兒核酸的混合物中可選地鑑定至少一個非母本等位基因在純合的目標基因座已經在母本樣品中鑑定的實施方式中，母本核酸和胎兒核酸的混合物可選地被用於鑑定相同基因座處的雜合基因型，其表示胎兒的存在(即非母本等位基因/提供信息的父本等位基因)。該可選步驟優選地在篩選或基因型分析單獨等份或子樣品之前實施。通過在母本核酸和胎兒核酸的混合樣品中篩選非母本等位基因並從而鑑定雜合的基因座(和因此胎兒等位基因)，可以更有效地篩選所述等份和子樣品中已知的提供信息的SNP。在一種優選的實施方式中，胎兒無細胞DNA用於篩選非母本等位基因並鑑定雜合基因座。在另一種實施方式中，胎兒無細胞RNA或cDNA用於鑑定雜合基因座。無細胞核酸可以從本領域已知的任何來源獲得，所述來源包括孕婦的血液、血清、血漿、尿液、宮頸拭子、宮頸灌洗、子宮灌洗或後穹窿穿刺。同樣可以從母本細胞和胎兒細胞的混合樣品中提取核酸以鑑定雜合基因座。優選地，從母本細胞和胎兒細胞的混合樣品中提取DNA。但是，RNA或cDNA可以從母本細胞或胎兒細胞的混合樣品中提取。可以從本領域已知的任何來源，包括血液、宮頸拭子、宮頸灌洗、子宮灌洗、後穹窿穿刺、淋巴結或骨髓獲得的細胞中提取核酸。在其它實施方式中，全血被用於鑑定雜合基因型而不必(或提前) 將全血分成細胞部分、血漿部分或血清部分。在一些實施方式中，擴增和檢測來自母本核酸和胎兒核酸的混合樣品的等份的核酸模板以鑑定雜合基因座(如使用基於PCR的方法)。但是，在一些實施方式中，不用擴增來自混合樣品的等份的核酸模板以鑑定雜合的基因座。例如，可以使用在其中僅擴增與模板相關的信號的方法(如，在美國專利號7，226，798,7,473, 775和7，468，261中描述的 ABSCRIPTI0N 方法(Ribomed Biotechnologies, Inc. ,Carlsbad,CA)或涉及 INVADER .化學(Hologic，Inc.)的方法)。同樣可以使用在其中檢測核酸模板而不需要擴增信號或模板的方法(如，涉及如在WO 2005/01122中描述的DNA結合的化學檢測的方法(Adnavance Technologies, Inc.，San Diego, CA))。此外，可以使用在其中測序核酸模板而不需要擴增的方法(如在Eid等，科學2009323 (5910) :133-38中描述的測序方法)。本領域技術人員將理解，用於非母本等位基因鑑定的模板的來源可以包括血清、血漿、尿液、宮頸拭子或本領域已知的任何其它核酸的來源。一偉·雜口口口帕
的存在其次的步驟是篩選或基因型分析子樣品或等份以鑑定非母本等位基因。一旦已經產生SNP譜(如本文中更詳細描述的)及已經鑑定一系列對於母本遺傳樣品是純合的(或可選地，雜合的)基因座，可以選擇一個或多個實驗基因座以篩選或基因型分析子樣品或等份中胎兒等位基因的存在。為檢測胎兒等位基因的存在，篩選或基因型分析實驗基因座中非母本等位基因的存在(即，通過鑑定實驗基因座處的雜合的或可選地純合的基因型)。 在一些實施方式中，逐個等份地篩選或基因型分析擴增產物的等份以檢測雜合的(或可選地，純合的)基因座。在一些實施方式中，等份包含來自單一細胞的擴增材料。可以在在母本樣品中在前鑑定為純合的基因座處基因型分析子樣品或等份。在一些實施方式中，在母本樣品中在前鑑定為純合的基因座處的基因型通過篩選非母本等位基因的存在而測定。優選地，如本文描述的，在篩選等份或子樣品的非母本等位基因之前，混合母本和胎兒核酸(優選地，無細胞)的樣品用於鑑定混合的核酸中非母本等位基因的存在，表示在胎兒材料中相同基因座處雜合基因型的存在。在其它實施方式中，在在母本樣品中在前鑑定為雜合的基因座處基因型分析子樣品或等份。在等份或子樣品中同樣基因座處的純合基因型的鑑定表示了非母本(即胎兒) 等位基因的存在。本領域技術人員將理解，在本文中描述的任何實施方式中的篩選或基因型分析方法可以使用等份或子樣品實施。可以使用本領域已知的許多方法，包括本文提到的那些，篩選或基因型分析等份和子樣品中的胎兒等位基因。例如，使用分子信標或其它基於核酸的 SNP檢測方法篩選或基因型分析等份。在一些實施方式中，擴增和檢測等份中的核酸模板 (如，使用基於PCR的方法)。但是，在一些實施方式中，不用擴增核酸模板(如，使用本文描述的方法)。此外，本領域已知的任何標記物可以用於篩選或基因型分析等份和子樣品。在優選的實施方式中，使用SNP、單體型、短串聯重複(STR)、其它序列變異、拷貝數變異(CNV) 或在母本樣品中基因型分析的表觀遺傳標記物。由於在一些實施方式中，子樣品包括不多於一個細胞，可以逐一細胞地篩選或基因型分析子樣品或等份。同樣可以使用本領域已知的多種方法，包括本文提到的那些，篩選或基因型分析子樣品或等份。優選地，使用具有TAQMAN 系統(Foster City, CA)的定量 PCR(qPCR)篩選子樣品的雜合等位基因。可以篩選預定數量的子樣品或細胞以檢測雜合等位基因。例如，如表1中所示，為檢測富集至胎兒母本細胞為1 10，000的樣品中7個基因座，其中期待每個基因座大約5個胎兒細胞，所述樣品或細胞的預定數量是350，000。在一些實施方式中，每個基因座的胎兒細胞數是、是大約、是至少、是至少大約、是不多於、是不多於大約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、 175、200、225、250、275或300，或任意兩個前述值所限定的範圍。表 權利要求
1.一種檢測胎兒標識符的方法，包括獲得包含母本細胞和胎兒細胞混合物的樣品；將樣品分成子樣品；篩選或基因型分析子樣品中胎兒標識符的存在；和從至少一個子樣品的胎兒細胞中鑑定至少一個所述胎兒標識符的存在。
2.根據權利要求1的方法，進一步包括對至少一個所述子樣品實施子樣品擴增以提供擴增產物。
3.根據權利要求2的方法，進一步包括將所述擴增產物分成等份，其中所述篩選或基因型分析子樣品中至少一個胎兒標識符的存在包括篩選或基因型分析等份中胎兒標識符的存在。
4.根據權利要求3的方法，其特徵在於，所述子樣品擴增包括選自以下的一種方法全基因組擴增、全轉錄物組擴增、目標核酸擴增、非胎兒標識符的核酸序列的擴增、產生核酸序列的代理和細胞分裂。
5.根據權利要求3的方法，其特徵在於，所述子樣品擴增包括目標核酸擴增、非胎兒標識符的核酸序列的擴增、產生核酸序列的代理和細胞分裂。
6.根據權利要求1或4的方法，進一步包括在一系列目標基因座處測定所述母本細胞的遺傳物質是純合的或雜合的以測定母本基因型，其中所述篩選或基因型分析等份或子樣品的胎兒標識符包括在至少一個目標基因座處篩選或基因型分析所述等份或子樣品中不同於所述母本基因型的基因型，其中所述不同於所述母本基因型的基因型的存在表示了在所述擴增產物中提供信息的父本等位基因的存在，和其中所述鑑定至少一個所述胎兒標識符的存在包括在至少一個等份或子樣品中鑑定提供信息的父本等位基因。
7.根據權利要求6的方法，進一步包括在測定所述母本細胞的遺傳物質是純合的或雜合的之前選擇所述的目標基因座。
8.根據權利要求7的方法，進一步包括從所述目標基因座中選擇實驗基因座，其中所述篩選或基因型分析包括在所述實驗基因座處篩選或基因型分析等份或子樣品中不同於所述母本基因型的基因型。
9.根據權利要求8的方法，其特徵在於，所述實驗基因座的所述選擇包括在目標基因座處篩選混合的母本核酸和胎兒核酸的樣品中不同於所述母本基因型的基因型，和在所述混合的母本核酸和胎兒核酸的樣品中選擇具有非母本基因型的目標基因座作為所述實驗基因座。
10.根據權利要求6或9的方法，進一步包括分析被鑑定為含有所述提供信息的父本等位基因的等份或子樣品以檢測遺傳變異。
11.根據權利要求10的方法，進一步包括採集被鑑定為含有所述提供信息的父本等位基因的部分所述等份或子樣品，其中所述分析被鑑定為含有所述提供信息的父本等位基因的等份或子樣品以檢測遺傳變異包括分析所述等份或子樣品的採集部分。
12.根據權利要求11的方法，其特徵在於，所述採集部分是所述等份或子樣品的同質部分。
13.根據權利要求11的方法，其特徵在於，所述採集部分是所述等份或子樣品的非同質部分。
14.根據權利要求10的方法，進一步包括從至少兩個子樣品中採集被鑑定為含有所述提供信息的父本等位基因的等份並在分析所述擴增產物之前結合所述等份。
15.根據權利要求10的方法，其特徵在於，所述遺傳變異是選自染色體重排、拷貝數變異和多態性的胎兒遺傳變異。
16.根據權利要求10的方法，其特徵在於，所述分析包括測定包含所述提供信息的父本等位基因的等份中母系遺傳等位基因和父系遺傳等位基因的比例，其中分析所述比例以測定遺傳變異的存在。
17.根據權利要求10的方法，其特徵在於，所述分析包括測定包含所述提供信息的父本等位基因的等份中等位基因的拷貝數，其中分析所述等位基因的拷貝數以測定遺傳變異的存在。
18.根據權利要求6或9的方法，進一步包括分析來自至少兩個所述子樣品的被鑑定為包含所述提供信息的父本等位基因的擴增產物以檢測嵌合性或異卵雙胞胎的存在。
19.根據權利要求10-18任一項的方法，其特徵在於，所述被分析的等份不是被篩選或基因型分析所述胎兒標識符的存在的等份，而是來自與被篩選或基因型分析所述胎兒標識符的存在的等份相同的子樣品。
20.根據權利要求6的方法，其特徵在於，所述目標基因座對於所述母本基因型全部是純合的，對於所述母本基因型全部是雜合的，或包括對於所述母本基因型是純合基因座和雜合基因座的混合物。
21.根據權利要求9的方法，其特徵在於，所述目標基因座對於所述母本基因型全部是純合的。
22.根據權利要求6或9的方法，其特徵在於，所述擴增產物包括基因座DNA或互補DNA。
23.根據權利要求6或9的方法，其特徵在於，所述測定母本基因型包括使用SNP譜以基因型分析母本遺傳物質的樣品，所述母本遺傳物質來自與所述母本細胞的來源相同的個體。
24.根據權利要求23的方法，其特徵在於，所述母本遺傳物質的來源選自血液、血清、 血漿、尿液、宮頸拭子、眼淚、唾液、口腔拭子或皮膚。
25.根據權利要求23的方法，其特徵在於，所述母本遺傳物質的來源選自血液或口腔拭子。
26.根據權利要求9的方法，其特徵在於，所述母本核酸和胎兒核酸的混合物是無細胞核酸的混合物。
27.根據權利要求沈的方法，其特徵在於，所述母本和胎兒無細胞核酸樣品的來源是孕婦的血液、血清、血漿、尿液、宮頸拭子、宮頸灌洗、子宮灌洗或後穹窿穿刺。
28.根據權利要求8或9的方法，包括在單一等份或子樣品中選擇和篩選或基因型分析多於一個實驗基因座，在多於一個等份或子樣品中選擇和篩選或基因型分析多於一個實驗基因座，或在多於一個等份或子樣品中選擇和篩選或基因型分析一個實驗基因座。
29.根據權利要求6或9的方法，包括在第一等份或子樣品中鑑定提供信息的父本等位基因之後，在至少第二子樣品中選擇和篩選或基因型分析第二目標基因座。
30.根據權利要求6或9的方法，其特徵在於，劃分所述樣品以產生具有細胞泊松分布或非泊松分布的子樣品。
31.根據權利要求6或9的方法，其特徵在於，每一個所述子樣品包括不多於1個細胞。
32.根據權利要求6或9的方法，進一步包括在所述篩選或基因型分析之前匯集來自兩個或更多個子樣品的等份。
33.根據權利要求32的方法，其特徵在於，所述匯集包括包含所述等份的行和列的孔的索引系統的應用。
34.根據權利要求6或9的方法，進一步包括在所述分成子樣品之前富集所述樣品中的所述胎兒細胞。
35.根據權利要求34的方法，其特徵在於，所述富集包括所述胎兒細胞超過母本細胞的差異擴增。
36.根據權利要求6或9的方法，其特徵在於，所述擴增產物的均質部分被分成所述等份。
37.根據權利要求6或9的方法，其特徵在於，所述擴增產物的非均質部分被分成所述等份。
38.一種用於檢測胎兒等位基因的單核苷酸多態性(SNP)譜，包括至少一個包含大約 20個至大約100個特異於單一染色體的獨特SNP的染色體特異譜，其中在所有主要群組中測量的每一個所述SNP的頻率範圍是大約30%至大約50%;其中每一個所述SNP是處於哈迪-溫伯格平衡；及其中SNP譜中SNP的總數是在大約5個SNP和大約100個SNP之間。
全文摘要
本發明公開了檢測兩種個體混合物中等位基因、基因組和轉錄物組的方法和基因型分析譜。
文檔編號C12Q1/68GK102325901SQ200980157313
公開日2012年1月18日 申請日期2009年12月22日 優先權日2008年12月22日
發明者安德魯·S·卡茨, 庫爾特·A·克魯梅爾, 張海川, 阿諾德·R·奧利芬特 申請人:賽盧拉有限公司