一種用於治療腦梗塞的含有人尿激肽原酶的藥物組合物的製作方法

2023-09-17 08:10:05

專利名稱：：一種用於治療腦梗塞的含有人尿激肽原酶的藥物組合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物化學和藥物化學領域。具體而言，本發明涉及單一組分的人尿激肽原酶(HumanUrinaryKallidinogenase)的製備和酶學性質，以單一組分的人尿激肽原酶為活性組分的藥物組合物及該藥物組合物在治療急性腦梗塞的應用研究。
背景技術：
：1909年，Abelous和Bardier觀察到將人尿中一種水不溶成分注射到麻醉的犬中，其血壓下降，1929年，Frey和Kraut從尿液中分離出該物質，還發現其在胰腺中有較高的濃度，認為胰腺為其主要合成場所，被命名為"kallikrein"。1937年發現kallikrein的蛋白酶功能，認為其為一種新蛋白，不是單獨起作用，而是一個系統的一部分(Werleeta1.,1937)。研究表明，從人尿中來源的該物質為組織型的激肽原酶。眾多研究者從人尿中分離製備了人尿激肽原酶，並進行了大量研究，但其多為兩個或者兩個以上組分的混合物。現有技術純化的人尿激肽原酶採用十二垸基硫酸鈉(SDS)—聚丙烯醯胺凝膠(PAGE)電泳(即SDS-PAGE電泳)測定有兩條帶，一條約43，000Da，一條約39,000Da。(根據電泳的條件或計算方法的不同，得到的兩個SDS-PAGE電泳條帶分子量也有所不同，有40000Da和34000Da;41000Da和31000Da等，實際上是相同的人尿激肽原酶人兩種組分)這兩種組分的理化性質非常相似，分離十分困難，無論用抑肽酶或慈燕蛋白酶抑制劑作配基的親和層析,還是用離子交換層析，均無法將兩個組分完全分離；當兩個組分混合在一起時HPLC圖譜顯示出一個單峰，所以用凝膠過濾的方法也無法將兩個組分分開。在以前的純化人尿激肽原酶方法中，一些研究未提及有兩個組分。用HPLC的方法或不敏感的電泳方法無法分辨兩個組分。人尿激肽原酶具有激活人血漿激肽原轉化為激肽、擴張血管增加血流量、改善血液循環的作用，促進缺血區新生血管生成，並且還有增加紅細胞的變形性和抑制血小板聚集、延長再鈣化時間改善血液粘稠的作用。本申請人的在先專利申請"ZL02116783.4人尿激肽原酶在製備治療和預防腦梗塞藥物中的應用"、"ZL200410088441.8人尿激肽原酶在製備膿毒症藥物中的應用"、"ZL200410088440.3人尿激肽原酶在製備急性冠脈疾病藥物中的應用"公開了它的三種醫藥用途。在"ZL200410096060.4—種用於提高人尿激肽原酶穩定性的藥物組合物"中公開了它製備藥物製劑的一種方法。由於以上的研究均採用抑肽酶或慈菇蛋白酶抑制劑作配基的親和層析，得到的人尿激肽原酶產品為兩種以上蛋白組分的混合物，對研究和應用帶來很多限制。臨床研究表明含有SDS-PAGE電泳兩條帶的人尿激肽原酶藥品會引起血壓的明顯下降，即用現有技術獲得的表明含有SDS-PAGE電泳單兩條帶的人尿激肽原酶藥品臨床使用是會有更大的副作用。藥品的活性成份如果含有兩個組分，而這兩個組分的比例無法控制，對於藥品的療效和安全性也就無法控制。因此，生產SDS-PAGE電泳單一條帶的藥品活性成份是非常重要的。日本株式會社三和化學研究所是世界上最先將人尿激肽原酶用於人的臨床研究的公司，他們的人尿激肽原酶藥物仍然含有SDS-PAGE電泳測定的兩個條帶；比活性不低於5PNA單位/毫克蛋白(PNAU/mgprotein)。他們的人尿激肽原酶藥物最終沒能獲得批准。(特開平5—163158.人尿性^二乂7於一七全有効成分t十^皮膚潰瘍0予防及"治料劑.)能夠發現人尿激肽原酶SDS-PAGE電泳測定有兩條帶，並且能有效地將這兩種物質分離，得到SDS-PAGE電泳單一條帶的人尿激肽原酶的研究未見報導。本發明用特定的分離方法製備SDS-PAGE電泳單一條帶的人尿激肽原酶，並配以一種或多種製藥可接受的載體組成的藥物組合物，含有單一條帶的人尿激肽原酶藥物組合物用於治療腦梗塞，副作用更小。
發明內容本發明的目的是從人尿中分離出SDS-PAGE電泳單一條帶的人尿激肽原酶，提供一種含有SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶的藥物組合物。本發明含有SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶的藥物組合物可有效用於治療和/或預防腦梗塞。這種組合物在臨床使用時副作用更小。本發明的目的是通過以下技術方案實現一種含有單一條帶人尿激肽原酶的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的單一條帶人尿激肽原酶和可藥用輔料，活性成分與藥用輔料重量比例為1:11:15000，其中所述單一條帶人尿激肽原酶含有238個胺基酸；含有5對S-S鍵；含有3個糖基化位點，N—末端和C一末端胺基酸殘基分別為異亮氨酸和絲氨酸，並具有以下特徵1.SDS-PAGE電泳測定的分子量為43000士3000Da(見附圖l);2.高效液相層析(HPLC)僅得到單一峰(見附圖2);3.比活性不低於8PNA單位/毫克蛋白(PNAU/mgprotein)，其主要活性成分的胺基酸序列Ile-Val-Gly-Gly-T卬-Glu-Cys-Glu-Gin-His-Ser-Gin-Pro-Trp-Gin-Ala-Ala-Leu-Tyr-His-3040Phe-Ser-Thr-Phe-Gln-Cys-Gly-Gly-Ile-Leu-Val-His-Arg-Gln-Trp-Val-Leu-Thr-Ala-Ala-5060His-Cys-Ile-Ser-Asp-Asn-Tyr-GlrrLeu-Trp-Leu-Gly-Arg-His-Asn-Leu-Phe-Asp-Asp-Glu-70CHO80Asn-Thr-Ala-Gln-Phe-Val-His-Val-Ser-Glu-Ser-Phe-Pro-His-Pro-Gly-Phe-Asn-Met-Ser-CHO90100Leu-LeirGlu-Asn-His-Thr-Arg-Gln-Ala-Asp-Glu-Asp-Tyr-Ser-His-Asp-Leu-Met-Leu-Leu-110120Arg-Leu-Thr-Glu-Pro-Ala-Asp-Thr-Ile-Thr-Asp-Ala-Val-Lys-Val-Val-Glu-Leu-Pro-Thr-130140Gln-Glu-Pro-Glu-Val-Gly-Ser-Thr-Cys-Leu-Ala-Ser-Gly-Trp-Gly-Ser-Ile-Glu-Pro-Glu-CH0150160AsrrPhe—Ser—Phe-Pro—Asp-Asp—Leu—Gln—Cys-Val—Asp—Leu-Lys—Ile—Leu-Pro—Asn—Asp—Glu—Glu170180Cys--Lys-Ala-His-Val-Gln-Lys-Val-Thr-Asp-Phe-Met-Leu-Cys-Val-Gly-His-Leu-Glu-ILys_^_|_i190200Gly-Gly-Lys-Asp-Thr-Cys-Val-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Met-Cys-A印-Gly-Val-Leu-210220Gin-Gly-Val-Thr-Ser-Trp-Gly-Tyr-Val-Pro-Cys-Gly-Thr-Pro-Asn-Lys-Pro-Ser-Val-Ala-_I230Val-Arg-Val-Leu-Ser-Tyr-Val-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser本發明通過一種層析材料，並結合其他層析技術，從人尿中分離出SDS-PAGE電泳單一條帶的人尿激肽原酶。發明人採用苯扎嘧啶交聯瓊脂糖凝膠(BenzamidineS印harose)親和層析的方法。人尿激肽原酶是一種絲氨酸蛋白水解酶，能夠與苯扎嘧啶(Benzamidine)、抑肽酶、慈菇蛋白酶抑制劑等配基結合，抑肽酶、慈菇蛋白酶抑制劑等配基與人尿激肽原酶的結合力較強，洗脫條件劇烈，無法達到分離兩個組分的目的，而苯扎嘧啶是小分子化合物，空間位阻小，人尿激肽原酶與其結合後，還會受到介質上其他電荷的影響，結合力較弱，洗脫條件溫和，在此條件下兩個組分有所差別。利用這一差別，我們用電導值較低的溶液將高分子組分洗脫下，低分子組分仍結合在介質上。用電導值較高的溶液將低分子組分洗脫下。這樣可以獲得SDS-PAGE電泳單一條帶的人尿激肽原酶。這種SDS-PAGE電泳單一條帶的人尿激肽原酶具體製備方法如下1.新鮮的男性尿液中加入3%脫乙醯甲殼素吸附，調節pH至4.55.5，用125%的硫酸銨溶液，調節pH至5.013.0洗脫，優選用812%的硫酸銨溶液,調節pH至79洗脫，加入50%硫酸銨，沉澱蛋白，得到人尿激肽原酶粗品；此步驟的特點是洗脫條件溫和，得到的粗品質量好，有利於後面的純化.2.將人尿激肽原酶溶解，經擴張床強陰離子交換(StreamlineQXL，GEHealthcare公司)柱層析；再經苯基交聯瓊脂糖快速流凝膠(phenylS印harose6FastFlow,GEHealthcare公司)柱層析；人尿激肽原酶溶液60。C恆溫加熱10小時，得到純度較高的、去除病毒的人尿激肽原酶中間體。3.將上述人尿激肽原酶中間體溶液上親和層析柱，作為親和層析的介質為苯扎嘧啶交聯瓊脂糖凝膠(BenzamidineS印harose6B，GEHealthcare公司)，用平衡緩衝溶液衝洗柱子，去除雜蛋白，使用的平衡緩衝溶液包括Tris-HCl緩衝溶液、磷酸鹽緩衝溶液、醋酸鹽緩衝溶液、檸檬酸鈉緩衝溶液，優選，Tris-HCl緩衝溶液；緩衝溶液的pH值為3—11，優選，7—9。利用不同濃度的鹽洗脫液，分別將人尿激肽原酶的兩個組分洗脫下來，洗脫是在電導值5-50ms/cm和20—80ms/cm分別進行；分別洗脫得到高分子組分和低分子組分，高分子組分即本發明的人尿激肽原酶。研究表明，含有SDS-PAGE電泳兩條帶的人尿激肽原酶藥品會引起血壓的明顯下降，即用現有技術獲得的表明含有SDS-PAGE電泳兩條帶的人尿激肽原酶藥品臨床使用是會有更大的副作用。本發明採用的製備方法所獲得SDS-PAGE電泳單一條帶的人尿激肽原酶，其也是一種混合物，但幾乎不引起血壓下降，其同現有技術獲得的含有SDS-PAGE電泳兩條帶的人尿激肽原酶藥品相比副作用明顯降低。本發明的含有SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶一般以藥物組合物的形式使用，這種組合物含有治療有效量的作為活性成分的SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶和可藥用輔料，活性成分與藥用輔料重量比例為1:11:15000，其中優選比例為1:11:2500。這種藥物組合物優選以靜脈注射途徑給藥，主要劑型包括凍乾粉針劑和注射液劑。經靜脈注射給藥的SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶組合物，一般是固體的滅菌組合物形式，即凍乾粉針劑。這些組合物還可以含有藥用輔料，特別是甘露醇、右旋糖苷、水解明膠、檸檬酸鈉、甘氨酸或聚乙二醇等中的一種或其任意混合物，在使用時可以溶解於滅菌注射用水或各種其它注射用滅菌介質中。經靜脈注射給藥的SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶組合物也可以是水溶液形式，即注射液劑、輸液劑。組合物還可以含有藥用輔料，特別是甘露醇、氯化鈉、葡萄糖或聚乙二醇等中的一種或其任意混合物。SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶凍乾粉針的製備方法取過濾滅菌的SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶150PNA單位，加15克甘露醇、2克右旋糖酑40和5克檸檬酸鈉(枸櫞酸鈉)溶解，調節PH至中性，加注射用水至500毫升，無菌過濾，分裝1000個安瓿中，無菌條件下冷凍乾燥，即得。SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶注射液的製備方法取過濾滅菌SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶水溶150PNA單位，調節TO至中性，加注射用水至500毫升，加氯化鈉調節等滲，無菌過濾，分裝1000個安瓿中，即得。應用SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶組合物治療腦梗塞的劑量根據病情的嚴重程度、治療時間而定，一般靜脈注射給藥量是每天給藥1_3次，每次0.005—2.5PNA單位。優選，藥物的給藥量是每天1次，每次0.1—0.2PNA單位。PNA的定義為在37°C、pH8.0條件下，1分鐘水解底物Val-Leu-Arg-PNA釋放lumol游離PNA，即為1PNA單位。對本發明所進行的試驗研究表明，含有SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶的藥物組合物對腦梗塞患者的療效顯著，副作用極小。附圖1:SDS-PAGE電泳圖。圖中1為高分子人尿激肽原酶和低分子人尿激肽原酶的混合物，(採用現有的技術方法製備，即慈菇蛋白酶抑制劑方法製備的人尿激肽原酶，詳見實施例8);2為低分子人尿激肽原酶(含有部分高分子人尿激肽原酶)；3為分子量標準品；4為高分子人尿激肽原酶(釆用本發明方法製備，即苯扎嘧啶親和層析法，詳見實施例1)。高分子和低分子人尿激肽原酶分子量分別約為43000Da和39000Da。附圖2:SDS-PAGE電泳單一條帶(高分子)的人尿激肽原酶HPLC圖。附圖3:人尿激肽原酶對大鼠腦血栓24h後的神經功能障礙的影響。圖中1為假手術組，2為對照組，3為人尿激肽原酶17.5X10-3PNAU/kg組，4為人尿激肽原酶8.75X10-3PNAU/kg組，5為人尿激肽原酶3.50X10-3PNAU/kg組，6為維腦路通50mg/kg組。附圖4:人尿激肽原酶對大鼠腦血栓24h後的腦梗塞面積的影響。圖中1為對照組，2為人尿激肽原酶17.5X10-3PNAU/kg組，3為人尿激肽原酶8.75X10-3PNAU/kg組，4為人尿激肽原酶3.50X10-3PNAU/kg組，5為維腦路通50mg/kg組。具體實施方式下面用具體實施例對本發明作進一步說明。實施例1SDS-PAGE電泳測定顯示單一條帶的人尿激肽原酶的製備其由以下步驟製備(苯扎嘧啶親和層析法)得到1.將10噸新鮮的男性尿液泵入攪拌池中，調節pH至4.55.5，加入300kg脫乙醯甲殼素吸附，用10X的硫銨溶液調節pH至7.09.0洗脫；洗脫液用硅藻土作過濾介質，進行抽濾，將鹽析溶液全部抽乾，抽乾產品lkg為人尿激肽原酶粗製品；2.將150kg人尿激肽原酶粗品倒入攪拌罐中，加入750L的0.15MEDTA溶液溶解，將pH調至9.0，攪拌至粗品完全溶解即可；3000轉/分離心20分鐘，取上清，過濾0.45um的膜，超濾得到超濾液45L，從中取樣品A(人尿激肽原酶粗品溶解掖)；3.將超濾液調pH8.0，上擴張床強陰離子交換柱(StreamlineQXL，GEHealthcare公司)，用含0.15MNaCl及0.02mol/LTris緩衝液衝洗柱子至0D28(K0.2;用含0.3MNaCl及0.02mol/LTris緩衝液洗脫柱子；收集洗脫溶液20L;4.洗脫收集液加入1800g(NH4)2S04，用HC1調整pH7.0±0,1，上苯基交聯瓊脂糖快速流凝膠(phenylS印harose6FastFlow,GEHealthcare公司)柱，用0.7M(NH4)2S04緩衝液衝洗柱子，用0.4M(NH4)2S04緩衝液進行洗脫柱子，收集洗脫液40L，用IOOOO麗CO膜超濾至3L;5.將超濾後加入90g檸檬酸鈉，用HCl調pH值至7.0土0.2，然後60。C恆溫加熱10小時，得到加熱後人尿激肽原酶溶液；6.將加熱後溶液調pH8.0±0.1，上苯扎嘧啶交聯瓊脂糖凝膠(BenzamidineS印haroseTM6B，GEHealthcare公司)柱，用含0.1MNaCl及0.02mol/LTris緩衝進行衝洗，用含0.4MNaCl及0.02mol/LTris緩衝進行洗脫，收集洗脫峰；7.將洗脫收集液調pH7.0，用IOOOO麗CO膜超濾至體積溶液1L，從中取樣品B(SDS-PAGE電泳單一條帶的人尿激肽原酶)。將樣品液A、B進行活性檢測，結果如下表l。表1樣品液A、B活性檢測結果。tableseeoriginaldocumentpage11樣品B各項檢測指標結果如下表2。表2樣品B(SDS-PAGE電泳單一條帶的人尿激肽原酶)的檢査結果tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12實施例2人尿激肽原酶結構確定人尿激肽原酶的胺基酸組成分析1.儀器名稱及型號日立835—50型高速胺基酸分析儀2.樣品製備準確量取樣品入水解管中，加入6mol/L鹽酸，於110。C水解24小時，冷卻定容，過濾，蒸發去掉過量的鹽酸，用0.02mol/L定容，上機分析。3.測定條件離子交換柱2.6X150誦；樹脂規格No.2619;柱溫53°C;泵流速0.225ml/min;泵壓力90kg/cm2,洗脫液Iffl—l，2,3，4;分析時間72min;進樣體積50W。4.測定結果與理論推導值基本一致(表3)。表3胺基酸組成分析結果tableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage13對一級結構的研究證明，人尿激肽原酶的初級結構為含有238個胺基酸殘基的單鏈，分別在Cys7-Cysl50、Cys26-Cys42、Cysl29-Cysl96、Cysl61-Cysl75和Cysl86-Cys211有五對二硫鍵，在Asn78、Asn84及Asnl41處存在糖基化，糖組成為甘露糖3%、半乳糖1.7%、巖藻糖0.8%、N-乙醯葡萄糖胺5.0%，另外還檢出少量唾液酸(0.4%)，人尿激肽原酶的總糖含量約為14.4%。用TSK-GELG3000SW凝膠測定本品分子量約54，OOODa，呈單峰(如附圖2)，電泳測定主要組分分子量約43，000Da，為單一條帶(如附圖1)。實施例3人尿激肽原酶酶學性質研究取小試管(2X20cm)2支，各加入人尿激肽原酶溶液0.2ml，分別加入0.2mol/LTris緩衝液(pH8.0)4.Oml，混勻，置37。C保溫5分鐘，於第1管中加入50%醋酸溶液0.4ml，第2管中加入底物溶液(S-2266(HD-Val-Leu-Arg-PnA2HC1)，1.5mM)0.4ml，混勻，於37±0.5'C水浴中反應15分鐘，然後在第1管中加入底物溶液0.4ml，第2管中加入50%醋酸溶液0.4ml，在405nm波長處測定，以第l管為空白，測定吸收值A，A值應控制在0.10.2之間。將A值代入下式計算PNAU/ml=173.6XAXT/1000(T為稀釋倍數)1PNAU(p-nitroaniline單位)相當於37°C，pH8.0條件下以H-D-Val-Leu-Arg-p-nitronilide為底物，1分鐘水解產生1Pmolp-nitroaniline時的人尿激肽原酶的酶量。結果顯示，上述人尿激肽原酶製品其比活大於8PNAU/mg蛋白。實施例4人尿激肽原酶的藥物組合物的製備1.1500PANU人尿激肽原酶(按實施例1的方法製備)，甘露醇150克，枸櫞酸鈉50克，加注射用水至5000毫升，經混合，除菌過濾，灌裝到10000瓶中，得到人尿激肽原酶水針。2.1500PANU人尿激肽原酶(按實施例1的方法製備)，甘露醇150克，枸櫞酸鈉50克，加注射用水至5000毫升，經混合，除菌過濾，灌裝到10000個瓶中，凍幹，得到人尿激肽原酶凍乾粉針。3.1500PANU人尿激肽原酶(按實施例1的方法製備)，甘露醇150克，枸櫞酸鈉50克，加生理鹽水至2500000毫升，經混合，除菌過濾，灌裝到10000瓶中，得到人尿激肽原酶輸液。實施例5人尿激肽原酶藥效學性質研究1.大鼠大腦中動脈血栓模型試驗用雄性大鼠腹腔注射水合三氯乙醛350mg/kg麻醉，仰臥位固定在鼠板上，切開頸部皮膚、肌肉，分離頸總動脈做動脈插管聯接壓力換能器、二導生理記錄儀(測定給藥前、給藥中及給藥後血壓變化)。再將大鼠左側位固定在鼠板上，於手術顯微鏡下沿外耳道與眼眥連線中點切開皮膚，暴露出顴弓，用小牽張器將磷狀骨和下頜骨間距撐開，於顱骨底開一2cmX2cm的骨窗，撕開硬腦膜，暴露出右側位於嗅束和大腦下靜脈之間的一段大腦中動脈，置一小片塑料薄膜保護血管周圍組織，將吸有50%三氯化鐵溶液(1mol/L鹽酸)10ul的小片定量濾紙(2X2mm)敷在此段大腦中動脈上，30min後取下濾紙，用生理鹽水衝洗局部組織，逐層縫合，回籠飼養。術中術後室溫嚴格控制在2425'C。假手術組除在大腦中動脈敷生理鹽水外，其餘同對照組。給藥組在手術30min後由舌下靜脈給人尿激肽原酶(由實施例1的方法製備)，24h後參照文獻方法判斷神經症狀，然後斷頭取腦，測定腦梗塞面積。2.大腦中動脈血栓及腦組織形態學觀察取栓塞側大腦中動脈及腦組織，按常規固定、包埋、染色、切片，在光學顯微鏡下觀察並攝片。3.神經症狀的評分判斷標準a)提起鼠尾，觀察兩前肢情況，正常動物兩前肢向前伸直並且對稱。手術後，腦缺血半球的對側前肢肩內旋和內收，觀察其程度不同評為04分。b)牽拉兩肢，正常大鼠肌力對稱，手術後腦缺血半球的對側前肢肌無力，觀察其程度不同評為03分。C)推兩肩，正常大鼠雙側肩阻力對稱，手術後腦缺血半球的對側肩阻力下降，觀察其程度不同評為03分。根據以上標準，滿分為10分，分數越高，說明腦功能障礙越嚴重，以此作為腦功能障礙的指標。4.腦梗塞面積的測定動物經本次行為評分後，斷頭取腦。剔除嗅腦、低位腦幹及小腦，剩餘部分立即稱取溼重，在冰上將腦沿冠狀面切成厚度基本相同的5片，於37'CTTC染料中溫浴30min，正常腦組織呈玫瑰紅，梗塞區呈白色。然後將腦片置10%的甲醛中固定，將白色組織仔細挖下稱重，以梗塞重量佔總腦重量的百分比作為梗塞面積。實驗結果1.人尿激肽原酶對行為缺陷程度的影響對照組大鼠麻醉清醒後即有偏癱樣症狀出現，主要表現為手術對側前肢內收、肩內旋、前肢肌張力下降，向手術對側推動時抵抗阻力下降。人尿激肽原酶17.5X10—3、8.75X10—3、3.5X10—3PNAU/kg可劑量依賴地改善神經症狀。維腦路通50rag/kg的改善神經症狀的作用與大劑量人尿激肽原酶(17.5XIO,NAU/kg)的作用相比，二者無顯著差異(P>0.05)(如附圖3)。2.人尿激肽原酶對腦梗塞範圍的影響如附圖4示，人尿激肽原酶17.5X10—3、8.75X10—3、3.5X10—3PNAU/kg可劑量依賴地縮小大鼠腦栓塞24h後的腦梗塞面積，與對照組比較有顯著差異。維腦路通50mg/kg的縮小腦梗塞面積的作用與人尿激肽原酶8.75Xl(TPNAU/kg的作用相比，二者無顯著差異(P〉0.05)。3.人尿激肽原酶對大鼠腦組織形態學變化的影響對照組大鼠中腦動脈血栓形成24小時後，病灶側大腦中動脈皮層供血區蒼白、無光、軟化，腦表面血管較對側充血，受損段大腦中動脈顏色變暗，光鏡下觀察此段血管切片，其內有血栓形成。血栓成分主要是血小板、紅細胞、白細胞和纖維蛋白，呈混合血栓特性，且形成的血栓堅實、緻密，血管壁及周圍有大量白細胞浸潤。人尿激肽原酶17.5X10-3、8.75X10-3PNAU/kg組經大腦中動脈血栓形成24h後，病灶側腦表面未見明顯的蒼白、無光，肉眼可見受損段大腦中動脈較對照組明顯紅潤，光鏡下觀察，此段血管及周圍匯聚大量的白細胞，表明血管表面受化學物質的損傷，血管內血栓溶解、斷裂，溶解後殘留的血栓成空洞狀、峰窩狀，白色血栓及纖維蛋白成分明顯減少。維腦路通50mg/kg能部分溶解、斷裂大鼠大腦中動脈內血栓，殘留的血栓成空洞狀、峰窩狀，腦組織缺血病變較輕，其作用強度與人尿激肽原酶中劑量的作用相當。光鏡下觀察腦組織切片，對照組大腦皮層大片淺染，神經細胞崩潰解體，神經細胞變稀疏，出現大片軟化灶。人尿激肽原酶17.5X10—3、8.75X10—3PNAU/kg組未出現明顯的大腦皮層大片淺染，軟化灶明顯變小，表明腦缺血程度明顯輕於對照組。4.人尿激肽原酶對麻醉大鼠血壓的影響大鼠頸總動脈插管，人尿激肽原酶17.5X10—3PNAU/kg於4050秒內從舌下靜脈給予，測定給藥前、給藥中及給藥後(觀察10min)血壓的變化。結果顯示，大鼠給藥前、給藥中及給藥後的血壓分別為104±22、101±26及102土20鵬Hg(n:7)。這表明，人尿激肽原酶17.5X10—3PNAU/kg於4050秒內從舌下靜脈給予，對麻醉大鼠血壓無明顯影響。試驗結論1.本實驗用三氯化鐵局部塗抹損傷血管，從腦梗塞範圍、行為障礙、腦組織病理改變為觀察指標判斷，形成了大鼠大腦中動脈血栓模型。2.人尿激肽原酶17.5X10—3、8.75X10—3PNAU/kg於術後30min靜脈注射，能明顯縮小腦栓塞24h的腦梗塞範圍，改善行為障礙。腦組織病理檢査顯示，大腦中動脈內血栓溶解、斷裂，溶解後殘留的血栓成空洞狀、峰窩狀，白色血栓及纖維蛋白成分明顯減少，腦組織缺血病變較輕。維腦路通50mg/kg能部分溶解、斷裂大鼠大腦中動脈內血栓，殘留的血栓成空洞狀、峰窩狀，腦組織缺血病變較輕，其作用強度與人尿激肽原酶中劑量的作用相當。3.人尿激肽原酶可能通過抑制腦血栓形成，從而減輕血栓形成所致的局部腦缺血性損傷。實施例6人尿激肽原酶對血壓的影響試驗藥品1.人尿激肽原酶樣品1(由實施例1的方法製備，即苯扎嘧啶親和層析法製備，43KD組分大於99X)2.人尿激肽原酶樣品2(由慈菇蛋白酶抑制劑方法製備，43KD組分約60X，39KD組分約40%)3.氯化鈉注射液。人尿激肽原酶樣品2製備方法(慈菇蛋白酶抑制劑方法製備)如下人尿激肽原酶粗製品的提取將新鮮尿泵入攪拌池中，調節pH至4.55.5，加入3%甲殼素吸附，用10X的硫銨溶液調節pH至7.09.0洗脫。洗脫液用硅藻土作過濾介質，進行抽濾，將鹽析溶液全部抽乾。抽乾產品為人尿激肽原酶粗製品。粗製品的溶解取lkg人尿激肽原酶粗品。加入1:3的0.15mol/LEDTA溶液溶解，3000轉/分離心20分鐘，取上清。溶解液上清每升加5mol/LZnC12溶液30ml，調節pH至57，用95%預冷酒精處理好的溶解液上清為l:1.2的比例，加95%預冷酒精沉澱。陰離子交換層析酒精沉澱用0.15mol/LEDTA-O.2mol/LNaOH溶液溶解，超濾調pH8.0，超濾液上擴張床強陰離子交換柱(StreamlineQXL，GEHealthcare公司)，用含0.15mol/LNaCl及0.02mol/LTris緩衝衝洗柱子至0D28(K0.2;用含0.3mol/LNaCl及0.02mol/LTris緩衝洗脫柱子；收集洗脫溶液蛋白峰。疏水層析洗脫收集液加入(NH4)2S04使其終濃度為1.3mol/L，用HC1調整pH7.0±0.1，上苯基交聯瓊脂糖快速流凝膠(phenylS印harose6FastFlow,GEHealthcare公司)柱。用0.7mol/L(NH4)2S04緩衝液衝洗柱子。用0.4mol/L(NH4)2S04緩衝液進行洗脫柱子，收集洗脫蛋白峰。用10000MWC0膜超濾至3L。將超濾後加入90g檸檬酸鈉，用HC1調pH值至7.0±0.2，然後6(TC恆溫加熱10小時。得到加熱後人尿激肽原酶溶液。慈菇蛋白酶抑制劑為配體的親和層析用溴化氰法將300mg慈菇蛋白酶抑制劑與50gS印harosCL_4B填料偶聯，裝柱。將超濾液調整pH8.0上已平衡的親和柱，用含0.05mol/L磷酸緩衝液及0.5mol/LNaCl進行平衡衝洗。再用0.05mol/L磷酸緩衝液及20%乙醇及0.4mol/L鹽酸胍進行洗脫。收集洗脫蛋白峰。凝膠過濾用S叩erdex200填料裝柱，用含0.05mol/L磷酸緩衝液及0.15mol/LNaCl，pH7.0±0.1的溶液進行平衡衝洗，收集蛋白峰。將洗脫蛋白峰調pH7.0，用IOOOOMWCO膜超濾濃縮。得到純化的人尿激肽原酶。試驗動物紐西蘭大白兔，體重1.82.5kg。在光照充足、通風和空調設備良好動物室飼養，室溫控制在20-25。C，溼度為40-65%。將紐西蘭大白兔隨機分為4組，每組6隻兔子(雌雄各半)。用烏拉坦(1000mg/kg)靜脈注射麻醉後，切開氣管，插入氣管套管。一側頸動脈插管並與壓力換能器相連，經AP-601G放大器測量股動脈血壓。在血壓指標穩定後記錄5分鐘作初始對照，然後靜脈注射給藥(2ml/Kg),對照組給予等體積氯化鈉注射液，靜脈注射給藥用定時勻速推注器在20分鐘注完。分別記錄給藥前及給藥後在5、15、30、45、60min時間點的平均動脈壓。注射前將樣品l一3按照每Kg試驗動物一次注射量為2ml，一次注射人尿激肽原酶劑量0.0065PNA/Kg，用氯化鈉注射液注射液進行稀釋。對照組按照每Kg試驗動物一次注射氯化鈉注射液為2ml。結果各組不同時間點平均動脈壓值如下表3，其中0組為氯化鈉注射液對照組，1組為人尿激肽原酶樣品1組，2組為人尿激肽原酶樣品2組。數據顯示0組和1組，從注射開始到注射結束的整個觀察時間內，平均動脈壓較穩定，未出現明顯波動，而組2則在給藥5分鐘即出現血壓明顯下降，給藥結束後40分鐘恢復注射前的平均動脈壓。表4不同人尿激肽原酶製品對平均動脈壓(Kpa)的影響(X±SD，n=6)tableseeoriginaldocumentpage18注*和**分別表示各組內各時間點壓力與初始壓力比較，P<0.05和P<0.01上述結果顯示人尿激肽原酶樣品1組和樣品2組之間對血壓的影響有明顯200710123537.7差異，樣品1組在上述給藥條件下對血壓沒有明顯影響，而樣品2組則表現出短期的對血壓的下降作用。實施例7人尿激肽原酶治療急性腦梗死臨床療效和安全性研究選擇起病48小時以內的輕度和中度頸動脈系統首發性完全型血栓性腦梗死患者(大於等於18歲的住院病人，性別不限；NIHSS評分》4分，《22分，腦CT排除出血可能)隨機分為人尿激肽原酶(由實施例1的方法製備，即苯扎嘧啶親和層析法製備，43KD組分大於99X)治療組和維腦路通對照組，對照組用維腦路通針0.6g加入生理鹽水500ml靜滴，每日1次連用14d。試驗組採用人尿激肽原酶製劑治療(由實施例4的方法製備，0.15PNAU靜脈滴注l次/日，在30分鐘一60分鐘內滴完)，療程14天。療效評價指標(1)神經功能缺損(NDS)指標採用美國國立衛生研究院腦卒中量表(NIHSS);(2)生活質量採用牛津病殘量表(OHS)(ModifiedRankinScale)。本研究共入組60例臨床試驗，藥物試驗組共30例，對照組30例。比較其0天、7天、14天臨床NDS及mRS評分，並觀察用藥前及用藥後血常規、尿常規、肝腎功能變化。結果兩組比較治療組14天的神經功能缺損及mRS評分改善均優於維腦路通組，有顯著性差異(結果如下表5和表6)。兩組用藥前後血常規、尿常規及肝功能比較均無統計學意義。tableseeoriginaldocumentpage19結果顯示人尿激肽原酶治療急性腦梗死有效、安全，臨床神經功能缺損及社會參與能力改善方面均明顯優於對照組。綜上所述，尤瑞克林用於急性腦梗塞的治療是安全有效的。權利要求1.一種含有SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶和可藥用輔料，活性成分與藥用輔料重量比例為1∶1～1∶15000，其中所述SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶是由238個胺基酸殘基組成一條單鏈，N-末端和C-末端胺基酸殘基分別為異亮氨酸和絲氨酸，同時具有下列特徵1)SDS-PAGE電泳測定的分子量為43000±3000Da；2)高效液相層析(HPLC)僅得到單一峰；3)比活性不低於8PNA單位/毫克·蛋白(PNAU/mg·protein)，其主要活性成分的胺基酸序列為2.根據權利要求1所述的含有SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶的藥物組合物，所述的SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶分子中含有5對S—S鍵，分別為Cys7—Cys150，Cys26—Cys42，Cys29—Cysl96，Cysl61—Cysl75以及Cysl86—Cys211，等電點約為4.0，分子中含有14.4%的糖，結合位點分別位於Asn78、Asn84及Asnl41。3.根據權利要求2所述的含有SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶的藥物組合物，其中所述的SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶是由以下步驟製備得到1)新鮮的男性尿液中加入3%脫乙醯甲殼素吸附，調節pH至4.55.5，用125%的硫酸銨溶液，調節pH至5.013.0洗脫，優選用812%的硫酸銨溶液，調節pH至79洗脫，加入50%硫酸銨,沉澱蛋白，得到人尿激肽原酶粗品；此步驟的特點是洗脫條件溫和，得到的粗品質量好，有利於後面的純化；2)將人尿激肽原酶溶解，經擴張床強陰離子交換(StreamlineQXL，GEHealthcare公司)柱層析；再經苯基交聯瓊脂糖快速流凝膠(phenylS印harose6FastFlow,GEHealthcare公司)柱層析；人尿激肽原酶溶液6(TC恆溫加熱10小時，得到純度較高的、去除病毒的人尿激肽原酶中間體；3)將上述人尿激肽原酶中間體溶液上親和層析柱，作為親和層析的介質為苯扎嘧啶交聯瓊脂糖凝膠(BenzamidineS印harose6B，GEHealthcare公司)，用平衡緩衝溶液衝洗柱子，去除雜蛋白，使用的平衡緩衝溶液包括Tris-HCl緩衝溶液、磷酸鹽緩衝溶液、醋酸鹽緩衝溶液、檸檬酸鈉緩衝溶液，優選，Tris-HCl緩衝溶液；緩衝溶液的pH值為3—11，優選，7_9。利用不同濃度的鹽洗脫液，分別將人尿激肽原酶的兩個組分洗脫下來，洗脫是在電導值5-50ms/cm和20—80ms/cm分別進行；分別洗脫得到高分子組分和低分子組分，高分子組分即本發明的SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶。4.根據權利要求3所述的含有SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶的藥物組合物，其中SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶和可藥用輔料的重量比例為1:11:2500。5.根據權利要求4所述的含有SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶的藥物組合物，其為凍乾粉針劑，可藥用輔料為甘露醇、右旋糖苷、水解明膠、檸檬酸鈉、甘氨酸或聚乙二醇中的一種或其任意混合物。6.根據權利要求4所述的含有SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶的藥物組合物，其為注射液劑，可藥用輔料為甘露醇、氯化鈉、葡萄糖或聚乙二醇中的一種或其任意混合物。7.根據權利要求5—6任意一項權利要求所述的含有SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶的藥物組合物，所述藥物的規格為0.10.2PNA單位/支或瓶。8.根據權利要求7所述的含有SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶的藥物組合物，其是由SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶150PNA單位，加15克甘露醇、2克右旋糖酐40和5克檸檬酸鈉(枸櫞酸鈉)溶解，調節ra至中性，加注射用水至500毫升，無菌過濾，分裝1000個安瓿中，無菌條件下冷凍乾燥，即得。9.權利要求1的含有SDS-PAGE電泳單一條帶人尿激肽原酶的藥物組合物用於製備預防和/或治療腦梗塞的藥物的用途。全文摘要本發明涉及SDS-PAGE電泳單一條帶的人尿激肽原酶作為活性成分在製備治療急性腦梗塞藥物組合物的應用研究。本發明的人尿激肽原酶為首次從人尿中分離的SDS-PAGE電泳單一條帶的人尿激肽原酶，對急性腦梗塞有明顯的治療作用。本發明的人尿激肽原酶通常以藥物組合物如凍乾粉針劑或注射液的形式使用。文檔編號A61K38/49GK101134106SQ20071012353公開日2008年3月5日申請日期2007年7月2日優先權日2007年7月2日發明者傅和亮,王曉巖,苗丕渠,許文勤,鄭少亮申請人:廣東天普生化醫藥股份有限公司