一種血清碘定量測定試劑盒的製作方法

2023-10-11 15:56:29

本發明涉及一種定量測定試劑盒，特別涉及一種血清碘定量測定試劑盒，屬於應用技術領域中的定量檢測類產品。

背景技術：

目前，尋求檢測個體碘營養水平的人群日益增多，臨床上暫時採用的方法是評價一次隨意尿樣來檢測碘水平，但尿碘只能反映體內碘的排出量，並不能代表被甲狀腺利用的具有生物活性的碘離子水平，血清碘濃度才能真實地反映機體的碘營養狀況。

目前，文獻中描述的血清碘定量測定方法有很多，如溫和酸消化法測血清總碘含量(胡梅，澤仁擁西等，中國地方病學雜誌.2000，19(1)：71-72.)，該方法利用硝酸和氯酸於110℃-115℃消化血清2.5h，然後利用碘對砷鈰氧化還原反應的催化作用，通過測定反應體系中吸光度值的變化，利用碘濃度與吸光度值的對數呈線性關係求出碘含量；氯酸法用於血清碘測定的方法學研究(王欣，劉源，孫曉軍等，中國衛生檢驗雜誌.2006，16(8)：916-918.)，該方法利用氯酸先於100℃預熱10min後升溫至130℃消化血清1h,後利用碘對砷鈰氧化還原反應的催化作用，通過測定反應體系中吸光度值的變化，利用碘濃度與吸光度值的對數呈線性關係求出碘含量；ICP-MS分析人血清中微量元素(沈雅珍,徐子剛,華偉民等，廣東微量元素科學，1996，3(6)：51-55.)，該方法採用多元素內標法校正基體效應引起的誤差,加入內標元素Sc、In，分別校正質量數<100和100～180的元素測定，並對一些元素選取其同位素峰測定，以避開多原子離子等的質譜幹擾，樣品製備為血清樣2ml，加入內標元素，用1％稀硝酸稀釋至5ml，其中包括血清碘測定。目前，國內外有部分大醫院採用ICP-MS方法測定血清碘含量。

這些方法存在以下問題：

(1)溫和酸法消化血清需要用到硝酸，硝酸消化後的分解產物對下一步測定存在一定的幹擾。

(2)溫和酸法、氯酸法測血清碘均需用到氯酸，但是氯酸配製過程較為複雜、易受到汙染，如果不嚴格按照方法配製，氯酸濃度可能達不到要求，並且存放過程易分解，而且氯酸配製過程對於實驗人員的健康有損害。

(3)前述兩種方法在配製亞砷酸溶液時所需有毒試劑三氧化二砷較多。

(4)ICP-MS法測血清碘所需實驗儀器較為昂貴，實驗操作及數據分析需相關專業技術人員進行，難於在基層推廣應用；血清用量較大，一般為0.5-2ml。

本項目組自主研製了一種新的血清中碘的酸消化定量測定方法，該方法具有易於操作、檢測數據可信度高、穩定性好、汙染低、血清用量少等優點。鑑於市場上沒有血清碘定量檢測的相關產品，本項目組在自主研製的血清碘定量測定方法的基礎上，研發了一種血清碘定量測定試劑盒。

技術實現要素：

針對現有問題，本發明所要解決的技術問題是提供了一種用於測定血清中碘含量的試劑盒。本發明的目的在於通過該試劑盒，對血清進行消化，然後利用碘對砷鈰氧化還原反應的催化作用,通過測定反應體系中Ce4+吸光度值的變化，利用碘濃度與吸光度值的對數呈線性關係計算碘含量，克服了現有血清碘定量測定方法試劑配製複雜、易汙染、易分解、危險性試劑用量多、實驗儀器昂貴、所需血清量較多的缺點。

為了達到上述目的，本發明所採用的技術手段為：

一種血清碘定量測定的試劑盒，其特徵在於，包括以下組分：100μg/mL的碘標準儲備溶液、70％～72％的高氯酸(消解液R1)、2.0mol/L氯酸鈉溶液(消解液R2)、0.025mol/L的亞砷酸溶液(還原劑R3)及Ce4+濃度為0.025mol/L的硫酸鈰銨溶液(氧化劑R4)。

所述的血清碘定量測定的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒用於檢測人體或動物體血清中碘含量。

所述的血清碘定量測定的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒用於血清碘含量測定的方法為：

(1)採集不少於2mL血液，室溫靜置0.5h，於3000r/min離心10min，分離出血清，嚴密封口，保存；

(2)利用100μg/mL的碘標準儲備溶液製備不同濃度的碘標準使用系列溶液；

(3)取0.1mL不同濃度的碘標準使用系列溶液及血清樣於玻璃試管，各管分別加入70％～72％的高氯酸和2.0mol/L氯酸鈉溶液，混勻後，置於消化控溫加熱裝置中，消化，冷卻至室溫；

(4)向各管分別加入0.025mol/L的亞砷酸溶液，充分混勻後，靜置15min，使其溫度達到平衡；

(5)秒表計時，依序每管間隔相同時間，向各管分別加入Ce4+濃度為0.025mol/L的硫酸鈰銨溶液，立即混勻；

(6)待標準系列中碘濃度最高的管的吸光度值達到0.10左右，依序每管間隔相同時間，於400nm波長下，以純水作參比，測定各管吸光度值；

(7)以碘濃度為橫坐標，吸光度值的對數為縱坐標繪製標準曲線；

(8)用最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程。

所述的血清碘定量測定的試劑盒，其特徵在於，步驟(3)中，消化控溫加熱裝置溫度為130℃±2℃；步驟(5)及步驟(6)中間隔的時間為20～30s。

本試劑盒應用過程中所涉及的化學方程式如下：

消化階段：

加入亞砷酸溶液：

IO3-+3AsO33-→I-+3AsO43-

加入硫酸鈰銨溶液：

本發明所用高氯酸為直接購買的試劑，氯酸鈉溶液配製簡單，存放時間較長並較為穩定；測定過程所需亞砷酸溶液及硫酸鈰銨溶液濃度相對現有技術均有較大程度降低，減少了對環境的汙染以及對實驗人員的危害；檢測所需血清量較少；檢測結果準確度較高；適合大批量血清樣品的檢測。

本試劑盒的研發，滿足了臨床上個體碘營養評價以及疾病預防控制部門中血清碘定量測定的需求，為進一步制定血清碘正常值標準提供定量測定基礎，進而解決碘缺乏病防治的重要問題，逐步實現因地制宜、分類指導、科學補碘的防治策略，助力實現因人而異、知情選擇的補碘方式。同時，本試劑盒也可以用於科研工作中動物血清碘含量的檢測，為科研工作中有關血清碘定量檢測提供便捷的方法。因此，本產品的研發具有較大的社會效益。

附圖說明

圖1為本發明血清中碘定量測定試劑盒的示意圖。

圖2為本發明標準曲線圖，橫坐標為碘的濃度(μg/L)，縱坐標為吸光度值的對數。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。

本產品試劑配製用純水符合GB/T 6682中二級水規格。

實施例1一種血清碘定量測定的試劑盒製備

1、100μg/mL的碘標準儲備溶液的配製

準確稱取經105～110℃烘乾至恆重的碘酸鉀0.1686g於燒杯中，用純水溶解後定量轉移入1000mL容量瓶中，用純水定容至刻度，避光保存。

應用碘標準儲備溶液配製的標準系列溶液，在檢測時有較好的線性關係及吸光度值範圍，能夠滿足人體及動物血清碘含量的檢測。

2、70％～72％的高氯酸(消解液R1)及2.0mol/L氯酸鈉溶液(消解液R2)的配製

2.1消解液選擇

血清與其他樣品相比，其基底成分複雜，無機離子含量廣泛，蛋白質含量高。因此消解液的選擇對產品的研發尤為重要。通過查閱有關文獻及相關知識，本項目組人員試驗了多種消解液，包括過硫酸銨和硫酸鋅、鹽酸與雙氧水和過硫酸銨、硝酸和雙氧水、硝酸和高氯酸、氯酸鈉和鹽酸、氯酸鈉和硫酸、氯酸鈉與硫酸和氯化鈉、氯酸鈉與硫酸和硫酸鋅、氯酸鈉與高氯酸和硫酸鋅、氯酸鈉與硝酸和硫酸鋅、氯酸鈉和高氯酸等10餘種組合消化劑。

經過對各種試劑的濃度及用量、消化溫度及時間的綜合調整，以消化得到清亮無色溶液為消化終點，對整個消解過程進行探究。發現採用70～72％的高氯酸(消解液R1)0.5ml、2.0mol/L的氯酸鈉溶液(消解液R2)0.6ml於130℃條件下對血清進行消化2h，得到的消化效果最好。

2.2消解液配製

消解液R1(高氯酸)：直接購買，70％～72％，優級純；

消解液R2(氯酸鈉溶液)[c(NaClO3)＝2.0mol/L]：稱取106.5g分析純的氯酸鈉，加入450mL純水溶解，再加純水稀釋至500mL，避光保存。

3、0.025mol/L的亞砷酸溶液(還原劑R3)及0.025mol/L的硫酸鈰銨溶液(氧化劑R3)的配製

3.1還原劑與氧化劑的選擇

還原劑(亞砷酸溶液)、氧化劑(硫酸鈰銨溶液)的濃度及用量將影響所檢測血清碘含量的準確性，對實驗人員危害和環境汙染的大小。因此對亞砷酸、硫酸鈰銨溶液濃度及用量的要求是既要減少三氧化二砷的用量，又要得出較好的檢測結果。在其他條件相同的情況下，砷鈰催化反應的程度受反應溫度和時間的影響，溫度太高，使反應速度過快而影響結果的準確度；溫度過低，反應速度又太慢，使檢測效率降低。

在15℃～30℃的穩定溫度下，經過對亞砷酸、硫酸鈰銨溶液濃度及用量的調整，得出：還原劑R3(亞砷酸溶液)3.0ml，氧化劑R4(硫酸鈰銨溶液)0.6ml，待標準系列溶液中300μg/L濃度試管吸光度值達到0.10左右時，400nm波長處測定。該反應體系滿足要求。

3.2還原劑R3與氧化劑R4的配製

還原劑R3(亞砷酸溶液)[c(H3AsO3)＝0.025mol/L]：稱取2.5g分析純的三氧化二砷、3.0g分析純的氫氧化鈉於1L的燒杯中，加純水約30mL攪拌至全部溶解，向燒杯中加純水約500mL，並加入40.0g優級純的氯化鈉，攪拌至完全溶解，再緩慢加入200mL硫酸溶液(2.5mol/L)，至室溫後用純水稀釋至1L，儲於棕色瓶，避光保存。加入氯化鈉的目的在於，使測定體系有較高濃度的Cl-，以掩蓋和抑制血清樣中Cl-及其量的變異，包括樣品管血清基體成分氯化物鹽量與標準管之間的差異，對測定結果的影響，保障血清碘定量測定的準確度和精密度

硫酸溶液[c(H2SO4)＝2.5mol/L]：取140mL優級純濃硫酸緩慢加入到700mL純水中，邊加邊攪拌，冷卻後用純水稀釋至1L。

氧化劑R4(硫酸鈰銨溶液)[c(Ce4+)＝0.025mol/L]：稱取14.9g分析純的硫酸鈰銨[Ce(NH4)4(SO4)4]或16.7g四水合硫酸鈰銨[Ce(NH4)4(SO4)4·4H2O]溶於700mL已經配置好的2.5mol/L硫酸溶液，用純水稀釋至1L，儲於棕色瓶，避光保存。

製備所得試劑盒如圖1所示。

實施例2實驗儀器與設備

1、恆溫消解儀(控溫點精度130℃±2℃，孔間溫差≤1℃)

2、分光光度計

3、玻璃試管：15mm×100mm或15mm×120mm

4、秒表

實施例3試劑盒性能指標考察

依據《GB/T 210.5-2008職業衛生標準制定指南第5部分：生物材料中化學物質的測定方法》對本發明的血清中碘的定量測定的試劑盒的方法特性進行測定，測定結果如下：

1.製備如實施例1所述的試劑盒。

2.樣品採集和保存

使用一次性真空採血管採集不少於2mL血液，室溫靜置0.5h後，於3000r/min離心10min,分離出血清置於具塞聚乙烯塑料管中，嚴密封口以防水分蒸發。在室溫(20℃)下可保存7天，在4℃下可保存2個月，密封后冷凍(-20℃)至少可保存3個月。血液樣品或血清樣品在現場採集、運輸和保存過程中應避免與加碘物品接觸。

3.標準使用系列溶液的配製

3.1碘標準中間溶液(10μg/mL)：吸取10.00mL碘標準儲備溶液置於100mL容量瓶中，用純水定容至刻度，此溶液1mL含碘10mg。儲於具塞嚴密的棕色瓶，可保存1個月。

3.2碘標準使用系列溶液(0μg/L～300μg/L)：吸取碘標準中間溶液0，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00mL分別置於100mL容量瓶中，用純水定容至刻度，此標準系列溶液的碘濃度分別為0，50，100，150，200，250，300μg/L。於400nm波長下，用1cm比色杯，以純水作參比，測定各管的吸光度值A。

4.標準曲線線性範圍及相關性

本方法標準曲線的橫坐標為碘標準液的濃度(μg/L)，縱坐標為吸光度A的對數，線性範圍為0～300μg/L，在此範圍內，標準曲線連續平行測定6次，分別計算每條曲線各點測得的平均吸光度、變異係數及相關係數，最終製得一條標準曲線，測定結果見表1及圖1。

表1標準曲線線性範圍及相關性

5.檢出限

根據國際理論化學與應用化學聯合會(IUPAC)的規定，用式CL＝CD+3σ計算檢出限，以空白值測定不少於10次所得的σ值，乘以3倍得出檢出限。本方法取樣量0.10ml，重複檢測空白管的吸光度值(n＝10)，檢出限為4.7μg/L。

6.精密度

在標準曲線範圍內，測定低、中、高3種碘濃度的血清樣品，每次測定3個平行樣，重複測定6次，其變異係數均<5％，符合生物樣品的測定要求。測定結果見表2。

表2血清中碘的測定精密度實驗結果

7.準確度

對低、中、高3種濃度的血清進行加標回收實驗，每次測定3個平行樣求平均值，重複測定3次，平均回收率分別為96.2％、98.9％、98.5％，其中，回收率＝(加標樣品測定值-樣品測定值)/加標量*100％，回收率範圍94.5％～101.5％，總平均回收率97.9％，符合生物樣品的測定要求。測定結果見表3。

表3血清中碘的測定加碘標回收率實驗結果

8.幹擾實驗

分別在100μg/L、200μg/L碘標準溶液中加入不同濃度的碘幹擾物質進行幹擾實驗。結果為，1L中分別含有11g/L NaCl，1.5g/L HPO42-，700mg/L KNO3，200mg/L Ca2+、365mg/L Mg2+、2mg/L F-、2mg/L Fe2+、2mg/L Zn2+、2mg/L Cu2+、0.05mg/L Hg2+、2g/L甘氨酸、10g/L葡萄糖、3g/L尿素、30mg/L抗壞血酸、100g/L蛋白時，均不幹擾測定，表明本方法具有較強的抗幹擾能力。

9.試劑穩定性

9.1取同一批次生產的「血清碘定量檢測試劑盒」6盒，於常溫保存；

9.2每個月取一盒本產品，對近期(7天內)採集的血清進行測定，同時進行方法特性實驗驗證；

9.3結果顯示：常溫保存6個月內檢測血清碘結果準確且方法特性測定實驗數據一致並符合《GB/T 210.5-2008職業衛生標準制定指南第5部分：生物材料中化學物質的測定方法》中的測定要求。

實施例4試劑盒用於血清中碘含量定量測定

1.製備如實施例1所述的試劑盒。

2.樣品採集和保存

使用一次性真空採血管採集不少於2mL血液，室溫靜置0.5h後，於3000r/min離心10min,分離出血清置於具塞聚乙烯塑料管中，嚴密封口以防水分蒸發。在室溫(20℃)下可保存7天，在4℃下可保存2個月，密封后冷凍(-20℃)至少可保存3個月。血液樣品或血清樣品在現場採集、運輸和保存過程中應避免與加碘物品接觸。

3.標準使用系列溶液的配製

3.1碘標準中間溶液(10μg/mL)：吸取10.00mL碘標準儲備溶液置於100mL容量瓶中，用純水定容至刻度，此溶液1mL含碘10mg。儲於具塞嚴密的棕色瓶，可保存1個月。

3.2碘標準使用系列溶液(0μg/L～300μg/L)：吸取碘標準中間溶液0，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00mL分別置於100mL容量瓶中，用純水定容至刻度，此標準系列溶液的碘濃度分別為0，50，100，150，200，250，300μg/L。

4.血清碘含量的檢測分析步驟

4.1分別取0.10mL碘標準使用系列溶液及血清樣(如果血清樣的碘濃度超過標準曲線的碘濃度範圍，則純水稀釋後取樣)各置於玻璃試管中，各管加入0.5mL消解液R1、0.6mL消解液R2，混勻後置於130℃的消化控溫加熱裝置中，消化120min，取下冷卻至室溫。以下分析4.2～4.4，可在15℃～30℃之間一個穩定的溫度環境下(室溫或控溫)進行，要求溫度波動不超過±0.3℃。

4.2各管加入3.0mL還原劑R3，充分混勻後放置15min，使其溫度達到平衡，將標準系列管按碘濃度由高至低順序排列。

4.3秒表計時，依順序每管間隔30s向各管準確加入0.60mL氧化劑R4，立即混勻。

4.4待第一管(即標準系列中加300μg/L碘濃度管)的吸光度值達到0.10左右時，依順序每管間隔同樣時間30s於400nm波長下，用1cm比色杯，以純水作參比，測定各管的吸光度值。

4.5標準曲線繪製：以碘濃度為橫坐標，吸光度值對數為縱坐標繪製標準曲線。

5.結果計算

5.1標準曲線法：

以測得的血清樣品管的吸光度值在標準曲線上查得所測樣品的碘濃度C，再按(5.3)計算血清中的碘濃度。

5.2回歸方程法：

碘質量濃度C(μg/L)與吸光度值A的對數值成線性關係：見式(1)，按式(1)求出標準曲線的回歸方程，將樣品管的吸光度值代入式(1)，求出所測樣品中碘質量濃度，再按(5.3)式(2)計算血清中碘的質量濃度。

C＝a+b lgA(或C＝a+b lnA)……………(1)

式中：

C—碘標準使用系列溶液(或所測樣品)中碘的質量濃度，單位為微克每升(μg/L)；

A—碘標準使用系列溶液(或所測樣品)測定的吸光度值；

a—標準曲線回歸方程的截距；

b—標準曲線回歸方程的斜率。

5.3血清中碘濃度：

按式(2)計算：

ρ(I)＝C×K………………………………………(2)

式中：

ρ(I)—血清中碘濃度，單位為微克每升(μg/L)；

C—由標準曲線查得的或由標準曲線回歸方程計算得的所測樣品中碘濃度，單

位為微克每升(μg/L)；

K—血清樣稀釋倍數。

血清樣品檢測時，按照4.5進行標準曲線作圖，如圖2所示，碘質量濃度C(μg/L)與吸光度值A的對數值的線性方程為：C＝53.307-264.43lgA。採集185例人體血清樣品，利用如實施例1所述的試劑盒採用上述使用方法進行檢測，依照5.1或5.2所示的計算方法，檢測結果為：血清碘含量範圍為36～97μg/L，與世界衛生組織、美國梅奧醫學中心和奎斯特診斷公司三家國際知名實驗室提供的電感耦合等離子體質譜法測定的碘代謝指標的參考值範圍基本一致，實驗結果見表4。

表4電感耦合等離子體質譜法測定的血清碘國際參考範圍

上述實施例僅用於說明本發明的原理及其功效，而非用於限制本發明。任何本領域技術人員在不違背本發明的精神及範疇下，對上述實施例進行的修飾或改變，仍由本發明的權利要求所涵蓋。