一種具有保肝護肝功能的促肝細胞生長素製備方法與流程
2023-10-11 20:56:14 1
本發明涉及一種具有保肝護肝功能的低分子量豬胎肝促肝細胞生長素製備方法，屬於功能肽提取加工領域。
背景技術：
目前我國B肝病毒攜帶者高達1.2億，慢性B型肝炎患者約3000萬例，其中10-20％可發展為肝硬化，1-5％可演變為肝癌。我國每年因肝癌死亡的人數約12萬，肝炎導致的死亡高達50萬。
肝硬化患者常伴有蛋白質-能量營養不良，與患者的預後和肝移植術後併發症密切相關，因此對肝硬化患者進行精準的營養治療具有重要的臨床意義。臨床研究表明，哺乳動物肝臟提取物可與其它藥物聯合治療重症肝炎、攀發性肝炎，有效減輕患者肝臟損傷，促進重症病人血液中腫瘤壞死因子活性的增加。
促肝細胞生長素(Hepatocyte Growth-promoting Factors，HGF)是從健康哺乳動物的新鮮肝臟中提取的具有生物活性的多肽物質。研究證明，HGF具有刺激DNA合成、肝細胞再生和保護肝臟等功能。作為提取物的主要活性物質，用於各種肝病的營養補充和聯合治療。HGF作為注射劑應用於臨床，儘管其在不同物種之間具有高度的同源性，但也偶見過敏反應，同時高分子量蛋白跨膜障礙較大，因此目前臨床使用的多為酶解的肽片段。目前報導的具備活性的HGF肽片段的分子量包括40kDa、20kDa、13kDa等說法不一。經過酶解後的低分子量HGF(HPN)片段具有免疫原性低、穩定性高、存儲要求低、存儲時間長等優點，且不易與其它蛋白質、多糖、胺基酸等物質發生反應，更適合作為肝病營養的功能組件。
技術實現要素：
本發明提供了一種具有保肝護肝功能的低分子量豬胎肝促肝細胞生長素製備方法，採用傳統的熱變性後酶解方法，結合色譜層析技術，從月齡乳豬新鮮肝臟中分離純化獲得高純度的分子量分別約為14kDa，8kDa，6kDa的HPN，在細胞水平上的促肝細胞生長的活性表明，8kDa的促肝細胞生長素小肽在1.5μg/mL和15μg/mL下，可有效促進HpG2肝癌細胞的增殖，當濃度達到150μg/mL時，可抑制肝癌細胞的生長。
一種具有保肝護肝功能的低分子量豬胎肝促肝細胞生長素製備方法，將健康乳豬肝筋膜去除，剪碎至1-1.5cm3；以豬胎肝∶生理鹽水＝2∶3比例加入0.85％生理鹽水，充分破碎、勻漿；將勻漿液於95℃熱變性20～60min；高速離心後，收集上清液，測蛋白濃度，加入總蛋白1/40～1/60的胰蛋白酶，37℃水解0.5～2h，離心收集上清液；以10kD超濾膜過濾，收集超濾液，75％終濃度丙酮沉澱，去離子水復溶後Sephadex G-50凝膠柱分離純化，收集蛋白峰；真空冷凍乾燥(3)，獲得低分子量豬胎肝促肝細胞生長素。
其中，胰蛋白酶最佳使用比例為1/50，最佳水解時間為1h，洗脫液採用去離子水。
經分離純化，獲得3種低分子量豬胎肝促肝細胞生長素，分子量分別約為14kDa，8kDa，6kDa，在細胞水平上的促肝細胞生長的活性表明，8kDa的促肝細胞生長素小肽活性最佳，對肝細胞生長具有雙向調節功能，在1.5μg/mL和15μg/mL下，可有效促進HpG2肝癌細胞的增殖，當濃度達到150μg/mL時，可抑制肝癌細胞的生長。
本發明方案的實施，至少具有以下優勢：
根據本發明方法，可有效分離獲得高活性的豬胎肝促肝細胞生長素，與目前報導的分子量大小顯著不同；該小肽對肝細胞生長具有雙向調節功能，低濃度時可促進肝細胞增殖，高濃度是可抑制腫瘤細胞生長，具有保肝護肝功效。
附圖說明
圖1是分離純化曲線；
圖2是促肝細胞生長素小肽細胞活性實驗，*代表具備顯著性差異。
具體實施方式
下面將結合具體實施例來進一步對本發明作詳細描述，以使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚。以下實施例僅用於舉例說明，並不對本發明構成任何限制。
實施例1
將新鮮豬肝200g，以0.85％(v/w)NaCl清洗並去除筋膜，剪碎至約1cm×1cm小塊，加入300mL 0.85％(v/w)NaCl，置於高速勻漿機中13，000rpm勻漿3min，收集勻漿液，於-20℃反覆凍融3次，融化後95℃水浴變性20min，4，500rpm離心20min，取上清，以BCA法測定蛋白濃度，tricine-SDS-PAGE凝膠分析；隨後加入1/50蛋白總量的胰蛋白酶，調pH至8.2，37℃消化60min後，以10kDa的超濾膜(millipore，德國)超濾，收集濾出液，以75％丙酮沉澱，復溶後以Sephadex G-50凝膠柱進行分離，以去離子水為洗脫液，收集並合併洗脫峰，測定蛋白濃度，並進行真空冷凍乾燥。獲得3個分子量促肝細胞生長素小肽，134mg、22.9mg、16.2mg；蛋白的收率分別為58.2％、9.9％、7.0％；對應分子量分別約為14kDa，8kDa，6kDa。
實施例2
將復甦的HpG2肝癌細胞於含10％FBS的DMEM培養基中，37℃5％CO2下培養24h，胰酶消化後以含10％FBS的DMEM培養基稀釋至104cell/mL，加入96孔細胞培養板，每孔0.1mL，37℃5％CO2培養至細胞完全貼壁，更換以培養基稀釋的待檢樣品(1.5、15和150μg/mL)，37℃5％CO2培養24h，經PBS充分洗滌後，使用MTT細胞增殖與細胞毒性檢測試劑盒測定活細胞數(n＝4)。14kDa小肽對HpG2細胞無顯著影響，8kDa小肽和6kDa小肽在1.5和15μg/mL時可促進HpG2細胞的生長，其中8kDa小肽的促生長活性高於6kDa小肽，在15μg/mL時8kDa小肽對細胞的促生長作用可達10％(p＜0.05)以上；同時，8kDa小肽和6kDa小肽在150μg/mL時，均可表現出一定的抑制HpG2細胞增殖活性。