一種利用畢赤酵母表達系統異源表達活性膜蛋白的方法

2023-08-06 00:29:36

專利名稱：一種利用畢赤酵母表達系統異源表達活性膜蛋白的方法
一種利用畢赤酵母表達系統異源表達活性膜蛋白的方法技術領域：
本發明涉及基因工程及酶技術領域，更具體地，本發明涉及一種膜蛋白的活性表達、酶學功能及其科研用途。
背景技術：
巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是一種能高效表達重組蛋白的酵母品種，與其它表達系統相比，畢赤酵母表達系統具有以下優勢1)特有的強有力的AOX (醇氧化酶基因)啟動子，甲醇可嚴格地調控外源基因的表達，且甲醇比一般用於大腸桿菌表達誘導使用的IPTG便宜；2)表達水平高，即可在胞內表達，又可分泌型表達；3)發酵工藝成熟，易放大；4)培養成本低，產物易分離；5)外源蛋白基因遺傳穩定。一般外源蛋白基因整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體複製而複製，不易丟失；6)作為真核表達系統，畢赤酵母具有真核生 物的亞細胞結構，具有糖基化、脂肪醯化、蛋白磷酸化等翻譯後修飾加工功能。畢赤酵母表達系統PichiaPink 相較於普通的巴斯德畢赤酵母系統多了以下的幾個優勢利用腺嘌呤營養缺陷型(敲除ADE2基因)進行篩選，避免了抗性篩選的繁瑣；敲除蛋白酶P印4和/或prbl基因，減少了目標蛋白的降解；針對不同的蛋白具有不同的載體進行選擇，有低拷貝載體、高拷貝載體，和一個帶有a-mating signal信號肽基因的高拷貝載體，其中帶有信號肽的高拷貝載體PPink a-HC特別適合於將可溶蛋白分泌至胞外，有利於後期的蛋白純化，另外也可以保證膜蛋白的定位，以保證其活性發揮，這也避免了將基因在大腸桿菌中重組表達時，因蛋白定位失敗而失活的情況。具有產共軛亞油酸(CLA)的乳酸菌已得到了廣泛報導，如羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、短雙歧桿菌和動物雙歧桿菌等產CLA的效率很高。動物雙歧桿菌ΒΒ-12是其中的一種細菌，該菌是現有技術已知的細菌(例如參見劉勇，張勇，包豔，張和平.4株益生菌的表面特性及抑制致病菌作用研究.中國食品學報.2010.第二期2;王記成，郭壯，聞I 雅，劉小鳴，陳衛，張和平·益生菌Lactobacillus casei Zhang與商業益生菌對胃腸轉運耐受性及發酵特性的比較.中國食品學報.2009.第5期)，可通過商業購買獲得。該菌可將50%的底物亞油酸(LA)轉化為CLA，且所產的CLA中具有生物活性的順9，反Il-CLA的含量超過50%。儘管乳酸菌產共軛亞油酸的國內外文獻報導已有很多，但乳酸菌產CLA的機理尚不明確，特別是在催化反應的酶很可能是膜蛋白的情況下，相關的研究進展十分緩慢，利用相關微生物進行大規模生產的進展目前幾乎為零，營養學家們正在想方設法擴大共軛亞油酸的產量以便用於醫療或保健食品。

發明內容本發明目的在於根據現有膜蛋白活性表達較困難的問題，對來自於動物雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(MCRA)提供一種重組的活性表達的方法，所述方法在PichiaPink 表達系統中表達動物雙歧桿菌BB-12的膜蛋白MCRA。在重組表達雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(MCRA)抗原的方法時以動物雙歧桿菌BB-12基因組為模板，以 5』 -CCGGATATCATGGACACTAGGGCGCCGAAAGTCG-3』，5』 -CGGGGTACCTCAGTGATGGTGATGGTGATGTTTCGCCGAATCATTCTCCCCCG-3』為引物，通過高保真PCR擴增的方法得到MCRA蛋白的編碼基因。在得到MCRA蛋白的編碼基因後，將編碼基因與具有信號肽的載體pPinka-HC連接得到pPink a -HC-MCRA質粒，然後用pPink a -HC-MCRA質粒轉化PichiaPink ，轉化成功的PichiaPink 菌表達動物雙歧桿菌BB-12的膜蛋白MCRA。本發明的另一目的還涉及一種重組表達雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(MCRA)抗原的宿主，該宿主為pPink a -HC-MCRA質粒轉化的PichiaPink 菌，其中的pP i nk a -HC-MCRA質粒是將雙歧桿菌BB-12的MCRA編碼基因與具有信號肽的載體pPinka-HC連接得到的。本發明另一個目的在於提供上述膜蛋白或活性表達系統的應用，可以將獲得的雙 歧桿菌BB-12肌球蛋白交叉反應(MCRA)抗原或宿主用於製備共軛亞油酸。本發明上述目的是通過以下技術方案予以實現本發明從動物雙歧桿菌BB-12中克隆獲得肌球蛋白交叉反應抗原(MCRA)基因，並實現對其的活性表達的方法為將動物雙歧桿菌BB-12的膜蛋白MCRA，以具有信號肽的載體pPink a -HC在PichiaPink 表達系統中表達，得到正確定位於細胞膜、具有活性的重組蛋白。上述製備方法步驟如下(I)以動物雙歧桿菌 BB-12 基因組為模板，以 5』-CCGGATATCATGGACACTAGGGCGCCGAAAGTCG-3，，5，-CGGGGTACCTCAGTGATGGTGATGGTGATGTTTCGCCGAATCATTCTCCCCCG-3，為引物，通過高保真PCR擴增的方法得到MCRA基因。PCR程序為95°C 30s, 55°C 30s, 68°C 2. 5min，30 個循環。PCR 反應體系5 μ L dNTPs(2mM)，5μ L10XK0D plus Buffer, I μ L KOD plus,2. 5μ L MgSO4 (25mM)，上遊及下遊引物各I μ L，模板2μ L ；(2)擴增得到的PCR產物經EcoR V和Kpn I 37°C消化3h後，與經Stu I和Kpn I酶切後的pPinka -HC質粒連接，轉化至E. coli T0P10感受態細胞並均勻塗布於LBA平板(含有100 μ g/mL氨苄青黴素的LB瓊脂平板)，37°C過夜培養後，挑選單克隆；(3)將正確的重組質粒轉化至PichiaPink 感受態細胞，塗布於不含腺嘌呤的PAD選擇性平板，挑選單克隆；(4)以甲醇誘導重組酵母菌，通過SDS-PAGE和Western Blot等方法驗證目標蛋白表達及定位情況，通過GC-MS對誘導後的菌體及培養基的脂肪酸組成進行鑑定以測定目標蛋白的活性。本發明動物雙歧桿菌BB-12的MCRA蛋白順利地定位至細胞膜。本發明雙歧桿菌BB-12的MCRA蛋白能夠在畢赤酵母表達系統PichiaPink 中表達，表達獲得的MCRA蛋白具有活性，能夠催化亞油酸轉變為羥基化衍生物。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(MCRA)蛋白在畢赤酵母中既實現了活性表達，又實現了定位至細胞膜。


圖I為MCRA基因PCR擴增結果圖。I為PCR產物，2為陰性對照；圖2為pPinka-HC-MCRA質粒驗證圖。I為以重組質粒作模板的PCR擴增，2為以基因組作陽性對照，3為以空pPink a -HC質粒作陰性對照；圖3為重組畢赤酵母PichiaPink pPink a -HC-MCRA重組子驗證圖。I為原始菌基因組作陰性對照，2為整合子基因組為模板，3為以相應質粒作陽性對照圖4 為重組 PichiaPinkTM 菌的 SDS-PAGE (A)和 Western Blot (B)圖。I 為畢赤酵母菌發酵液上清樣品，2為畢赤酵母菌菌體樣品；圖5為未添加底物時重組PichiaPink 菌的菌體及發酵液上清脂肪酸GC-MS檢測GC結果圖。A、B分別為對照菌的菌體及發酵液上清脂肪酸檢測結果，C、D分別為重組菌的菌體及發酵液上清脂肪酸檢測結果；
圖6為添加底物時重組PichiaPink 菌的菌體及發酵液上清脂肪酸GC-MS檢測GC結果圖。A、B分別為對照菌的菌體及發酵液上清脂肪酸檢測結果，C、D分別為重組菌的菌體及發酵液上清脂肪酸檢測結果；圖7為產物的MS實際及理論碎片。
具體實施方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。實施例I轉入動物雙歧桿菌BB-12的MCRA基因的PichiaPink 重組菌的建立。(I)試驗方法以動物雙歧桿菌BB-12的基因組為模板，根據動物雙歧桿菌BB-12的MCRA序列(GenBank ADC85468)設計引物，用高保真的KOD plus酶進行PCR擴增MCRA基因。以 5』 -CCGGATATCATGGACACTAGGGCGCCGAAAGTCG-3』，5』 -CGGGGTACCTCAGTGATGGTGATGGTGATGTTTCGCCGAATCATTCTCCCCCG-3』為引物，通過高保真PCR擴增的方法得到MCRA基因。PCR 程序為95V 30s, 55 °C 30s, 68 °C 2. 5min，30 個循環。PCR 反應體系5μ L dNTPs (2mM)，
5μ LlO X KOD plus Buffer, I μ L KOD plus, 2. 5μ L MgSO4 (25mM)，上遊及下遊引物各 I μ L，模板2yL。擴增得到的PCR產物經EcoR V和Kpn I37°C消化3h後，與經Stu I和Kpn I酶切後的pPinka-HC質粒以合適的比例連接。連接產物轉化E. coli T0P10感受態細胞，並均勻塗布於LBA平板(含有100 μ g/mL氨苄青黴素的LB瓊脂平板)，37°C過夜培養進行篩選。挑選轉化子，進行PCR驗證及測序驗證，獲得正確的重組質粒pPink a-HC-MCRA。用電轉化儀將經Spe I酶切後的線性化pPink a -HC-MCRA質粒轉化至PichiaPink 菌感受態細胞，通過PAD選擇性平板篩選陽性轉化菌株。挑取轉化子，以重組畢赤酵母菌的基因組為模板，進行PCR驗證，篩選出同源重組正確的重組菌和轉入空質粒的對照菌。同時保存篩選出的同源重組正確的重組菌，作為擴大培養的菌種。(2)結果PCR克隆片段的長度與MCRA基因本身的長度相匹配，表示成功克隆MCRA基因(見圖I)，MCRA基因成功連接到pPinka-HC質粒上(見圖2)，質粒後經上海桑尼生物有限公司進行測序，結果顯示MCRA基因完全正確(GenBank :ADC85468)。MCRA基因與pPink a -HC質粒連接所得到的pPink a -HC-MCRA質粒成功整合至PichiaPinkTM菌的基因組中，同時得到了整合了空質粒pPinka-HC的PichiaPinkTM對照菌(見圖3)，其中pPinka-HC質粒和PichiaPink 表達系統購自 Invitrogen。實施例2I動物雙歧桿菌BB-12的MCRA基因在PichiaPink 重組菌中表達的確定。I. I實驗方法重組菌及對照菌經甲醇誘導後，對菌體及培養基部分的蛋白進行SDS-PAGE 和 Wester Blot 檢驗。(I)溶液配製BMGY培養基1%酵母提取物，2%蛋白腖，IOOmM磷酸鉀緩衝液pH6. O, I. 34%YNB，O. 0004%生物素，1%甘油；將BMGY中的甘油用1%甲醇替代即得BMMY培養基；(2)重組菌和對照菌於BMGY培養基中28°C、250rpm條件下培養2天，後1500g離 心5min，去除BMGY培養基，用BMMY培養基重懸菌體，於28°C、250rpm誘導培養2天後，分別取發酵液、菌體進行SDS-PAGE和Western Blot分析，分離膠濃度為12%。(3) SDS-PAGE 及 Western Blot將10 μ g樣品在兩塊12%的聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳，80V濃縮25min，再150V分離6(T80min。其中一塊用考馬斯亮藍染色和醋酸-乙醇溶液脫色，在凝膠呈像系統上分析蛋白分布與濃度。將另一塊膠轉至PVDF膜，後依次結合一抗(抗His的抗體)和二抗(Horseradish peroxidase (HRP) -conjugated anti-mouse IgG),最後用增強型突光試劑盒進行處理及顯影。I. 2實驗結果SDS-PAGE及Western Blot分析顯示重組基因在PichiaPinkTM重組菌中得到表達，且定位於細胞膜，分子量為82kDa (見圖4)。2、動物雙歧桿菌BB-12的MCRA蛋白在PichiaPink 重組菌中活性的確定。(I)試驗方法重組菌及對照菌按上述方法誘導I天后，一組添加底物亞油酸，一組不添加亞油酸，繼續誘導I天后，收菌凍幹，菌體凍乾粉按文獻方法(Sakuradani E,Shimizu S.Gene cloning and functional analysis of a second Δ 6-fatty aciddesaturase from an arachidonic acid-producing Mortierella fungus. Biosci BiotechBioch 2003,67:704 - 711)進行脂質提取。向200mg菌體凍乾粉中加入十九烷酸內標和10%的鹽酸-甲醇溶液，600C，孵育3h。後加入正己烷和飽和NaCl，振蕩混勻，離心後上清於乾淨的瓶中；重複提取一次；N2吹乾後用重氮甲烷補充甲酯化，N2吹乾後用正己烷回溶，用於GC-MS檢測分析。ImL發酵後培養液也按相同方法進行脂質提取及甲酯化處理。GC-MS條件Finnigan Trance GC/Finnigan Trance MS (美國 Thermo),色譜柱Agilent DB-ffAX(30mX0. 250mm idXO. 25 μ m，美國安捷倫)。GC 升溫程序180°C保持 0. 5min，後以 5°C /min的升溫速率升至230°C,保持13min。載體流量He 8mL/min,載氣流量He 8mL/min,氣化室溫度250°C，進樣量10 μ L，分流比62:1。質譜檢測條件離子化方式ΕΙ，電離電壓70eV ;發射電流200 μ A ;柱上溫度250°C ;離子室溫度230°C ;檢測器電壓350V。(2)試驗結果僅在添加底物亞油酸時,重組菌的菌體內檢測到相應的產物,產物為10-羥基-順-12-十八碳烯酸，即10-H0E (見圖5，圖6，圖7)。結果表明重組菌表達的MCRA蛋白能夠將亞油酸轉化成共軛亞油酸10-羥基-順-12-十八碳烯酸的能力，而對照菌不具備這種能力。
權利要求
1.一種重組表達雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(MCRA)抗原的方法，其特徵在於在PichiaPink 表達系統中表達動物雙歧桿菌BB-12的膜蛋白MCRA。
2.根據權利要求I所述的重組表達雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(MCRA)抗原的方法，其特徵在於該方法還包括以動物雙歧桿菌BB-12基因組為模板，以5』-CCGGATATCATGGACACTAGGGCGCCGAAAGTCG-3』，5』 -CGGGGTACCTCAGTGATGGTGATGGTGATGTTTCGCCGAATCATTCTCCCCCG-3』為引物，通過高保真PCR擴增的方法得到MCRA蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的重組表達雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(MCRA)抗原的方法，其特徵在於該方法還包括在得到MCRA蛋白的編碼基因後，將編碼基因與具有信號肽的載體PPink a -HC連接得到pPink a -HC-MCRA質粒，然後用pPink a -HC-MCRA質粒轉化PichiaPink ，轉化成功的PichiaPink 菌表達動物雙歧桿菌BB-12的膜蛋白MCRA。
4.一種重組表達雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(MCRA)抗原的質粒，其特徵在於，該質粒為 pPink a -HC-MCRA。
5.一種重組表達雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(MCRA)抗原的宿主，其特徵在於，該宿主為pPink a -HC-MCRA質粒轉化的PichiaPink 菌，其中的pPink a -HC-MCRA質粒是將雙歧桿菌ΒΒ-12的MCRA編碼基因與具有信號肽的載體pPink a -HC連接得到的。
6.雙歧桿菌ΒΒ-12肌球蛋白交叉反應(MCRA)蛋白用於製備共軛亞油酸的用途。
7.權利要求4所述的質粒或權利要求5所述的宿主用於製備共軛亞油酸的用途。
全文摘要
本發明公開了一種利用畢赤酵母表達系統異源表達活性膜蛋白的方法。本發明涉及一種重組表達雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(MCRA)抗原的方法及以及在所述方法中使用的表達宿主，所述表達宿主是pPinkα-HC-MCRA質粒轉化的PichiaPinkTM表達系統。本發明還涉及雙歧桿菌BB-12肌球蛋白交叉反應(MCRA)抗原或表達宿主用於製備共軛亞油酸的用途。
文檔編號C12R1/84GK102876708SQ20121041448
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月26日 優先權日2012年10月26日 公開號201210414486.發明者陳海琴, 陳衛, 楊波, 田豐偉, 趙建新, 宋元達, 陳永泉, 張灝 申請人:江南大學