可活化構建體的製作方法

2023-10-10 06:01:24

專利名稱：可活化構建體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種構建體、編碼所述構建體的多核苷酸、表達所述構建體的細胞、所述構建體在治療與血管破裂相關的並存病中的用途以及治療凝血病、炎症和癌細胞轉移的方法。
背景技術：
血小板來源於其在骨髓中的細胞前體巨核細胞。當內皮完整時正常的 靜息血小板在血液循環各處自由流動。當單層內皮屏障受損時，靜息的血小板通過糖蛋白(GP)受體黏附於內皮下結構。例如，GPIaIIa和GPVI結合膠原；GPIcIIa結合纖連蛋白；GPIc*IIa結合層粘連蛋白而GPIb-V-IX結合von Willebrand因子(vWF)聚合體。血小板以該方式的黏附導致其改變形狀並釋放其a顆粒和緻密顆粒。反過來，這導致過多其它糖蛋白血小板受體例如GPIIbIIIa (其結合纖維蛋白原/纖維蛋白)、TLT-I和CREB-2的暴露；以及以下因子的釋放凝血因子I (纖維蛋白原)、V和XI ;其它前凝血劑例如ADP、Ca2+和血清素；抗凝血劑例如組織因子通道抑制劑(TFPI)和對血小板補充和癒合必需的化合物例如血小板衍生生長因子(TOGF)。活化的血小板以快速反應彼此結合併交聯纖維蛋白。活化的血小板還通過在其(細胞)膜上展示的選擇蛋白而在白細胞歸巢至血管損傷和炎症的部位中發揮重要作用。組織因子(TF)(—種跨膜糖蛋白)，是血液凝固的主要細胞引發物。其主要在內皮下細胞例如平滑肌細胞和成纖維細胞的表面上表達，並且當內皮的完整性被打斷時例如當血管被切斷時結合凝血因子VII (FVII)和凝血因子Vila (FVIIa)兩者。當TF結合FVII時，其促進FVII向FVIIa活化。TF還極大提高了因子VIIa對其生理學底物因子IX和因子X的蛋白水解活性。其通過提供用於最佳大分子外部位(exosite)的相互作用的支架並通過誘導因子VIIa的蛋白酶結構域的構象改變來如此進行，該構象改變導致活性位點區域的正確限定。因此，TF是傳統上被稱作血液凝固的外部途徑的起始複合體中FVIIa的輔因子。凝血級聯的後續步驟最終導致纖維蛋白聚合體的形成，該聚合體被活化的血小板結合併與FXIIIa交聯。因此，活化的血小板和凝血級聯的纖維蛋白聚合體產物一同形成穩定的血塊並促進組織癒合。在凝血病的受試者中，例如在患有A型血友病和B型血友病的人中，凝血級聯的許多步驟由於例如凝血因子的缺乏或存量不足而使得功能障礙。凝血的一部分的此類功能障礙導致血液凝固不足和潛在地危及生命的出血。本發明的一個目標是提供在此類受試者中適用作促凝血藥物的構建體。本發明的第二個目標是提供在血液凝固起始的所需物理點活化的構建體。本發明的第三個目標是提供在生理學上合適的微環境中上調血液凝固的構建體。本發明的另一個目標為將單克隆抗體或其生物學上有活性的片段或變體引導至活化的血小板或內皮細胞的表面。因此，所述目標是能夠在位於血管內或血管外的活化血小板的表面上引發血液凝固。這與正常和專有地內皮下典型地血管外血液凝固的引發相反。
已知涉及止血的一些過程/分子與組織癒合複雜交織，並因此還與病理過程例如炎症和癌細胞轉移複雜交織。因此本發明的ー個目標是提供一種構建體，其亦可用於治療與出血患者中血管破裂相關產生的並存病特別是炎性疾病以及自身免疫性疾病和癌細胞轉移。發明簡述
本發明涉及一種構建體，其包含(i)配體例如單克隆抗體(mAB)或其片段、(ii)可切割基序(CM)和(iii)包含(i)的表位基序(EM)的多肽序列。所述構建體還可包含組織因子(TF)或其生物學上有功能的變體或片段。所述構建體的所述mAB可能能夠結合細胞上的受體，所述細胞選自活化的血小板、活化的內皮細胞和白細胞。在ー個方面，所述mAB能夠結合活化的血小板上的受體。該受體可為選擇蛋白，例如E-選擇蛋白(CD62E)、P-選擇蛋白(⑶62P)或L-選擇蛋白(⑶62L)。在一個實施方案中，所述受體為P-選擇蛋白(⑶62P)。可工程改造所述構建體，使得所述CM的C端與所述單克隆抗體或其片段的重鏈的 N端共價連接。可工程改造所述構建體，使得所述可切割基序的C端與所述單克隆抗體或其片段的輕鏈的N端共價連接。所述表位基序的C端可與所述可切割基序的N端共價連接。本發明的構建體的CM可被酶切割。該酶可為選自以下的蛋白酶凝血酶、因子Vila (FVIIa)、因子 IXa (FIXa)、因子 Xa (FXa)、因子 XIa (FXIa)、因子 XIIa (FXIIa)、激肽釋放酶、活化蛋白C (APC)、纖溶酶、組織纖溶酶原激活劑(tPA)和尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)。CM可為蛋白酶的切割位點。在ー個特定的實施方案中，所述CM可為血纖肽A(FpA)或其片段；例如SEQ ID NO: 3的胺基酸40-49 (DFLAEGGGVR)。EM可包含與SEQ IDNO: 3的殘基20-39 (SVLQCLATGNWNSVPPECQA)對應的胺基酸序列。提供的構建體的mAB可包含SEQ ID NO: 8。所述構建體的mAB可包含SEQ ID NO: 9。所述構建體為這樣的如可利用FACS分析檢測的，其固有的mAB或其片段可在所述構建體的CM被切割時結合其靶標。本發明還提供了編碼本發明的構建體的多核苷酸和能夠表達本發明的構建體的分離的細胞。此外，本發明提供了一種治療有需要的受試者中與血管破裂相關的並存病即出血和炎症的方法，所述方法通過利用本發明的構建體來進行。附圖
簡述
圖 I:顯示了表示 A) EP-FpA-PBl. 3 HC-V、B) PBl. 3 H(M^PC) PBl. 3 LC-V 的核苷酸序列和胺基酸序列。斜體序列為信號肽序列，粗體序列表示PBl. 3 mAb結合表位(EP)、帶下劃線的序列表示凝血酶可切割的接頭序列。帶下劃線和斜體的序列表示限制性內切酶識別位點。圖 2 :顯示了 pIT-EP-FpA-PBl. 3 HC (2A)、pIT-PBl. 3 HC (2B)和 pTT-PBl. 3 LC(2C)的質粒圖譜。縮寫為以下AmpR :氨節青黴素抗性基因；pMBl ori :大腸桿菌(E. coli)的複製起點；pCMV :巨細胞病毒啟動子；TPL :三聯前導序列；enh MLP :腺主要晚期啟動子增強子；oriP EB病毒的複製起點；PolyA :多腺苷酸化位點；SP :信號肽；EP PB1. 3 mAb結合表位；FpA :凝血酶可切割的接頭。圖3 :顯示了 PBl. 3 (3A)和EP-FpA-PBl. 3 (3B)與活化和非活化的血小板的FACS結合實驗的結果。兩種實驗中包括了同種型匹配的對照抗體^APC。
序列描述
SEQ ID NO: I提供了人⑶62P的多肽序列(包括信號肽)。SEQ ID NO: 2-3提供了 EP-FpA-PBl. 3 HC-V構建體的多核苷酸序列和多肽序列。SEQ ID NO: 4_5提供了人源化抗⑶62P單克隆抗體PBl. 3的重鏈的可變域的多核苷酸序列和多肽序列。SEQ ID NO: 6_7提供了人源化抗⑶62P單克隆抗體PBl. 3的輕鏈的可變域的多核苷酸序列和多肽序列。SEQ ID NO: 8提供了能夠結合⑶62P的單克隆抗體的重鏈的多肽序列。SEQ ID NO: 9提供了能夠結合⑶62P的單克隆抗體的輕鏈的多肽序列。
SEQ ID NO: 10-11提供了組織因子的多核苷酸序列和多肽序列。SEQ ID NO: 12_13提供了 TF的胞外域的多核苷酸序列和多肽序列。發明詳述 CD62P
CD62P(P-選擇蛋白)為眾所周知且已良好表徵的受體分子，其已在活化的血小板和內皮細胞上被鑑定。CD62P存在於靜息血小板的a -顆粒和內皮細胞的懷布爾-帕拉德體中並且可在活化時迅速易位至細胞表面。在血小板的活化時，其a-顆粒與質膜融合，使CD62P膜蛋白易位至細胞表面。在血小板活化後數分鐘內P-選擇蛋白的表面表達增加40-50倍。CD62P屬於選擇蛋白黏附分子家族並在刺激時由血小板和內皮細胞表達。已證明⑶62P為與心血管病症、炎症和腫瘤轉移相關的可能的數種分子之一。例如，已知CD62P的結合經由配體例如P-選擇蛋白糖蛋白配體-1 (PSGL-I)活化白細胞和內皮細胞；血小板介導的白細胞滾旋依賴於CD62P並且內皮CD62P在免疫介導的疾病例如炎性腸病、多發性硬化、銀屑病或類風溼性關節炎中引發白細胞外滲。按照本發明，CD62P可來自任何脊椎動物，例如任何哺乳動物，例如小鼠、大鼠、免、豚鼠、豬、牛、猿或人。CD62P可從產生功能性蛋白的任何天然存在的基因型或等位基因翻譯。一種人⑶62P的非限制性實例為SEQ ID NO: I的多肽序列。組織因子
組織因子為263個胺基酸的膜內在糖蛋白受體。其由以下組成胞外部分(摺疊成兩個各自通過單個ニ硫鍵穩定的緊密的纖連蛋白III型樣結構域(1-219))、跨膜區段(220-242)和短的胞質尾部(243-263)。其與因子VII/FVIIa形成緊密的依賴Ca2+的複合體。按照本發明，「組織因子或其任何生物學上有功能的變體或片段」可為能夠結合因子VII/VII(a)使得引發血液凝固的任何多肽。「組織因子」可來源於任何脊椎動物，例如任何哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、豬、牛、猿或人。「組織因子或其任何生物學上有功能的變體或片段」可為人組織因子的胞外域。「組織因子或其任何生物學上有功能的變體或片段」可為與SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13的組織因子的多肽序列有至少90%、例如至少91%、例如至少92%、例如至少93%、例如至少94%、例如至少95%、例如至少96%、例如至少97%、例如至少98%、例如至少99%同一性的任何多肽。「組織因子或其任何生物學上有功能的變體或片段」可為與組織因子的胞外域的多肽序列有至少90%、例如至少91%、例如至少92%、例如至少93%、例如至少94%、例如至少95%、例如至少96%、例如至少97%、例如至少98%、例如至少99%同一性的任何多肽。「組織因子或其任何生物學上有功能的變體或片段」可為能夠作為FVII和FVIIa的輔因子發揮功能的任何多肽。因此，「組織因子或其任何生物學上有功能的變體或片段」可為能夠刺激FVIIa的醯胺水解活性(amidolytic activity)的任何多肽。所述「組織因子或其任何生物學上有功能的變體或片段」可為組織因子的胞外域AA1-219 (SEQ ID NO: 13)。「組織因子多肽」可為包含組織因子的可溶性胞外域，即胺基酸1-219(在以下被稱作sTF或sTF (1-219))，或其功能性變體或截短形式的多肽。優選地，所述組織因子多肽至少包含與組織因子的胺基酸序列6-209對應的片段。其實例為sTF (6-209)、sTF (1-209)和 sTF (1-219)。根據本發明，「組織因子或其任何生物學上有功能的變體或片段」可具有以上列出的任何一個或多個特徵。同一性 如本領域已知的術語「同一性」，是指如通過比較序列確定的兩條或更多條多肽的序列之間的關係。在本領域中，在本領域中，「同一性」亦意指多肽之間的序列相關程度，其通過兩個或更多個胺基酸殘基串之間匹配的數目來確定。「同一性」衡量由特定數學模型或電腦程式(即「算法」)得出的兩個或更多個具有空位比對(如果有的話)的序列中較小者之間的相同匹配百分比。可用已知方法容易地計算相關多肽的同一性。所述方法包括但不限於以下文獻中所闡述的方法Computational Molecular Biology (計算分子生物學)，Lesk, A. M.編輯，Oxford University Press, New York, 1988 ；Biocomputing:Informatics and Genome Projects (生物計算信息學和基因組項目)，Smith, D. W.編輯，Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data (序列數據的計算機分析)，第一部分，Griffin, A. M.,和 Griffin, H. G.編輯，Humana Press,New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology (分子生物學中的序列分析)，von Heinje, G. , Academic Press, 1987 ；Sequence Analysis Primer (序列分析引物)，Gribskov, M.和 Devereux, J.編輯，M. Stockton Press, New York, 1991 ;和Carillo 等，SIAM J. Applied Math. , 48, 1073, (1988)。設計確定同一性的優選方法以在待測序列之間獲得最大匹配。在可公開獲得的電腦程式中闡述了測定同一性的方法。在兩個序列之間測定同一性的優選電腦程式方法包括 GCG 程序包(包括 GAP) (Devereux 等，Nucl. Acid. Res. 12, 387，(1984)；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, ffis.)、BLASTP、BLASTN和 FASTA (Altschul 等，J. Mol. Biol. 215, 403-410，(1990))。BLASTX 程序可公開獲自國家生物技術信息中心(NCBI)和其它來源(BLAST Manual, Altschul等，NCB/NLM/NIHBethesda, Md. 20894 ;Altschul等，上述)。亦可使用眾所周知的Smith Waterman算法來測定同一性。例如，使用計算機算法GAP (Genetics Computer Group, University ofWisconsin, Madison, Wis.),比對待測定序列同一丨I"生百分比的兩條多肽以最佳匹配其各自的胺基酸(「匹配跨度(matched span)」，其由算法確定)。與算法一起使用空位開放罰分(其計算為3乘以平均對角線；「平均對角線」為待使用的比較矩陣的對角線的平均值；「對角線」為由特定比較矩陣分配給每個完全胺基酸匹配的評分或數字)和空位延伸罰分(其通常為{分數(1/10)}乘以空位開放罰分)以及比較矩陣例如PAM 250或BLOSUM62。算法亦使用標準比較矩陣(關於PAM 250比較矩陣參見Dayhoff等,Atlas of ProteinSequence and Structure (蛋白質序列和結構圖集)，第5卷，增補本3 (1978);關於BLOSUM 62 比較矩陣參見 Henikoff 等，Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919，(1992))。肽序列比較的優選參數包括以下算法Needleman等，J. Mol. Biol 48,443-453，(1970);比較矩陣來自 Henikoff 等，PNAS USA 89, 10915-10919，(1992)的BLOSUM 62 ;空位罰分12，空位長度罰分4，類似性閾值0。具有以上參數的GAP程序為有用的。前述參數為用GAP算法進行肽比較的默認參數(連同末端空位沒有罰分)。構建體
本發明提供了一種構建體，其包含配體例如單克隆抗體(mAB)或其片段、可切割基序(CM)和包含所述mAB或其片段的表位基序(EM)的多肽。所述構建體的所述配體組分可能 能夠結合選擇蛋白，例如CD62P。優選工程改造本發明的構建體使得其在其組分CM未被切割時是惰性的並且使得其組分mAB或其片段在CM被切割時能夠結合其靶標。本文所用術語「構建體」是指通過共價和可操作連接的元件表徵的多肽分子或多核苷酸分子。例如，構建體可指包含至少mAB、CM和EM的構建體以及編碼此類構建體的核酸，所述mAB、CM和EM可操作地連接以提供本文所述的可活化構建體。本發明的構建體還可包含其它元件，例如組織因子或其片段。配體
術語「配體」是指能夠結合生物分子並與生物分子形成複合體以用於生物學目的的任何物質。在該術語的一個含義中，其為通過分子間カ例如離子鍵、氫鍵和範德華カ結合靶蛋白上的位點的信號觸發分子。配體與所述生物分子的締合通常可逆。天然存在的配體與其對應物受體的結合改變受體蛋白的化學構象。本發明的配體可為任何天然存在或合成的配體，其結合活化的內皮細胞、血小板或白細胞上的選擇蛋白，或者所述配體可為針對選擇蛋白產生的抗體或其片段。本發明的配體可導致或不可導致所述選擇蛋白的化學構象的改變。此外，本發明的配體可由於結合其靶選擇蛋白，導致或不導致胞內信號轉導。因此，本發明的配體利用天然存在的受體以便實現本發明獨特的且由本發明所提供的作用。本發明的配體可不結合選擇蛋白以獲得模擬其天然配體的生物作用的作用。因此CD62P的配體的類似物PSGL-I可為本發明的配體，前提是其阻斷CD62P的活化而非引起⑶62P的活化。或者，本發明的配體可為能夠結合選擇蛋白例如CD62P的單克隆抗體或其片段。抗體
本文提及的術語「抗體」包括完全抗體和其任何抗原結合片段(即「抗原結合部分」)或單鏈。抗體是指包含通過ニ硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白或其抗原結合部分。各重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。各輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。重鏈和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合域。VH區和VL區還可細分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，其散布著更保守的稱為框架區(FR)的區域。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，所述宿主組織或因子包括免疫系統的各種細胞(例如效應細胞)以及經典補體系統的第一組分(Clq)。本發明的抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體。在一個實施方案中，本發明的抗體為單克隆抗體。本發明的抗體可為嵌合抗體，CDR-移植抗體、人抗體或人源化抗體或其任一種的抗原結合部分。對於單克隆抗體和多克隆抗體兩者的生產，實驗動物合適地為哺乳動物例如山羊、兔、大鼠或小鼠。多克隆抗體為來源於不同B細胞系的抗體。多克隆抗體可包含針對特定抗原的不同免疫球蛋白分子的混合物。多克隆抗體可包含不同免疫球蛋白分子的混合物，所述免疫球蛋白分子結合抗原分子內的一種或多種不同表位。多克隆抗體可通過常規方法生產，例如用目標抗原對合適的動物免疫。隨後可從所述動物中移出血液並純化免疫球蛋白級分。單克隆抗體為彼此相同並且對於特定表位具有單一結合特異性和親和力的免疫球蛋白分子。本發明的單克隆抗體(mAb)可通過多種技術產生，包括常規單克隆抗體方法(例如Kohler和Milstein (1975) Nature 256: 495的標準體細胞雜交技術)或B淋巴細 胞的病毒轉化或致癌轉化。製備雜交瘤的優選動物系統為鼠系統。小鼠中的雜交瘤生產是非常良好確立的程序。免疫方案和用於融合的免疫脾細胞的分離的技術為本領域已知。還已知融合配偶體(例如鼠骨髓瘤細胞)和融合程序。為產生產本發明的單克隆抗體的雜交瘤，可從免疫小鼠中分離脾細胞和/或淋巴結細胞並融合至合適的永生化細胞系例如小鼠骨髓瘤細胞系中。可針對抗原特異性抗體的生產篩選所得雜交瘤。可將分泌抗體的雜交瘤再鋪板，再次篩選，並且若仍對合適的IgG呈陽性，可通過有限稀釋將單克隆抗體亞克隆至少兩次。接著可將穩定的亞克隆在體外培養以在組織培養基中產生少量抗體用於表徵。術語抗體的「抗原結合部分」是指保留特異性結合抗原(例如本文所述的CD62P或另一種靶蛋白)的能力的抗體的一個或多個片段。已顯示抗體的抗原結合功能可通過全長抗體的片段來進行。術語抗體的「抗原結合部分」中涵蓋的結合片段的實例包括=Fab片段、F(ab』)2片段、Fab』片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段和分離的互補決定區(⑶R)。單鏈抗體例如scFv和重鏈抗體例如VHH和駱駝抗體也旨在涵蓋在術語抗體的「抗原結合部分」之內。這些抗體片段可利用本領域技術人員已知的常規技術獲得，並且所述片段可以與完整抗體相同的方式針對效用進行篩選。本發明的抗體可通過重組的方式製備、表達、產生或分離，例如(a)從針對目標免疫球蛋白基因轉基因或轉染色體的動物(例如小鼠)中分離的抗體，或從所述動物製備的雜交瘤中分離的抗體，(b)從轉化以表達目標抗體的宿主細胞例如從轉染瘤中分離的抗體，(C)從重組的、組合抗體文庫中分離的抗體和(d)通過任何其它方法製備、表達、產生或分離的抗體，所述方法涉及免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列。本發明的抗體可為人抗體或人源化抗體。本文所用術語「人抗體」意指包括具有可變區的抗體，其中框架區和CDR區兩者來源於人種系免疫球蛋白序列。此外，若抗體包含恆定區，所述恆定區也來源於人種系免疫球蛋白序列。本發明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如通過體外隨機誘變或定點誘變或通過體內體細胞突變引入的突變)。但是，本文所用術語「人抗體」意指不包括其中來源於另一種哺乳動物物種例如小鼠的種系的CDR序列已移植至人框架序列上的抗體。
此類人抗體可為人單克隆抗體。此類人單克隆抗體可通過雜交瘤產生,所述雜交瘤包括與永生化細胞融合的從轉基因非人動物例如轉基因小鼠中獲得的B細胞，其具有包含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。人抗體可通過人淋巴細胞的體外免疫接著用EB病毒轉化所述淋巴細胞來製備。術語「人抗體衍生物」是指人抗體的任何修飾形式，例如抗體與另ー種物質或另一種抗體的綴合物。術語「人源化抗體」意指這樣的抗體，其中來源於另ー種哺乳動物物種例如小鼠的種系的CDR序列已移植至人框架序列上。在人框架序列內可進行另外的框架區修飾。本發明的抗體可通過例如標準的ELISA或蛋白印跡針對與靶蛋白的結合測試。 ELISA測定還可用於篩選對靶蛋白呈陽性反應性的雜交瘤。抗體的結合特異性還可通過監控抗體與表達靶蛋白的細胞的結合例如通過流式細胞術來確定。本發明的抗體對靶蛋白的特異性可進ー步通過確定抗體是否結合其它蛋白來研究。例如，當需要產生特異性結合CD62P或CD62P的特定部分例如表位的抗體時，抗體的特異性可通過確定抗體是否也結合其它分子或缺少目標部分的CD62P的修飾形式來評價。本發明的多肽或抗體「片段」可通過截短，例如通過從多肽的N端和/或C端移除一個或多個胺基酸來製備。以該方式可從N端和/或C端移除多至10個、多至20個、多至30個、多至40個或更多個胺基酸。片段還可通過ー個或多個內部缺失來產生。形成本發明的構建體的部分的抗體可具有結合活化的內皮細胞、血小板或白細胞的表面上的選擇蛋白的能力。所述抗體可能能夠結合選擇蛋白，使得阻止通常結合所述選擇蛋白的配體結合該選擇蛋白。因此，所述mAB或其片段可阻斷通常結合選擇蛋白的配體的活性。本發明的抗體可為抗CD62P抗體或其變體的片段或可包含抗CD62P抗體或其變體的片段。形成本發明的構建體的一部分的mAB可為描述於美國專利5，800, 815的mAB，所述專利通過引用以其整體結合於本文中。同樣地，本發明的構建體可包含美國5，800，815中所述的mAB的片段。可被本發明的構建體阻斷的配體可為PSGL-1。本發明的抗體可為如以上進ー步討論的該抗體或其變體的抗原結合部分或可包含該抗體或其變體的抗原結合部分。例如，本發明的抗體可為該抗體或其變體的Fab片段，或可為來源於該抗體或其變體的單鏈抗體。表位
本文所用術語「表位」定義幹「抗原結合多肽」(Ab)與其對應的「抗原」(Ag)之間的分子相互作用的背景中。本文所用術語Ab包含抗體或其片段，例如但不限於Fab片段、F(ab』)2片段或Fv片段，其特異性結合對應的Ag。術語Ag是指用於免疫活性的脊椎動物的免疫以產生識別該Ag的Ab的分子實體。在本文中，Ag範圍更廣地稱呼並且通常g在包括被Ab特異性識別的分子，因此包括在產生Ab的免疫過程中使用的分子的片段或模擬物。一般而言，術語「表位」是指Ab特異性結合的Ag上的區或區域。蛋白表位可包含直接涉及結合Ab的Ag中的胺基酸殘基(也被稱作表位的優勢免疫組分)和不直接涉及結合的其它胺基酸殘基，例如Ag上被Ab有效阻斷的胺基酸殘基(換言之，該胺基酸殘基在Ab的「溶劑排斥的表面」和/或「足跡」內)。本文術語表位除非另外指出(例如在一些情況中本發明涉及直接結合特定的胺基酸殘基的抗體)，否則包括特異性結合抗選擇蛋白抗體或者本發明另一種選擇蛋白特異性構建體組分的選擇蛋白例如CD62P任何特定區域上的兩種類型的結合位點。任何選擇蛋白可包含許多不同的表位，其可包括但不限於(I)線性肽抗原決定簇；(2)由一個或多個非鄰接胺基酸組成的構象抗原決定簇，所述胺基酸在成熟的受體構象中彼此相近定位；和(3)全部或部分由與給定選擇蛋白共價連接的分子結構(例如糖基)組成的翻譯後抗原決定簇。給定Ab/Ag對的表位可利用多種實驗表位作圖法和計算表位作圖法在不同的細節水平限定和表徵。所述實驗方法包括誘變、X射線晶體學、核磁共振(NMR)光譜學、氫氘交換質譜(HX-MS)和各種競爭結合法。由於各方法依靠於獨特原理，表位的描述與通過測定該表位的的方法緊密相聯繫。因此，給定Ab/Ag對的表位可不同地限定，這視採用的表位作圖法而定。
在其最詳細的水平上，表位可通過原子接觸限定，所述原子接觸對Ag與Ab之間的相互作用是重要的。在不太詳細的水平上表位可通過其包含的胺基酸殘基來表徵。在更不太詳細的水平上表位可通過功能例如通過與其它Ab的競爭結合來表徵。在通過Ab例如Ab的Fab片段與其Ag之間複合體的原子座標限定的X射線衍生晶體結構的背景中，術語表位在本文中除非另外說明或與上下文矛盾，否則特別地定義為特徵在於具有離Ab中的重原子在4 A的距離內的重原子(即非氫原子)的殘基。根據以下事實在不同的細節水平上得到取決於使用的表位作圖法的表位的描述和定義，因而得出不同Ab對於相同Ag的表位的比較可類似地在不同的細節水平上進行。胺基酸水平上描述的表位，例如從X射線結構確定的表位，若其包含相同套的胺基酸殘基，則認為是相同的。若至少一個胺基酸被表位共享，則認為表位重疊。若無胺基酸殘基被表位共享，則認為表位是分開的(唯一的)。若對應Ab的結合相互排斥，即一種Ab的結合排斥其它Ab的同時結合，則認為通過競爭結合表徵的表位重疊。若Ag能夠容納兩個相對應Ab的同時結合,則認為所述表位是分開的(唯一的)。互補位
一般而言，術語「互補位」是指Ag特異性結合的Ab上的區或區域。在通過Ab例如Ab的Fab片段與其Ag之間複合體的原子座標限定的X射線衍生晶體結構的背景中，術語互補位在本文中除非另外說明或與上下文矛盾，否則特別地定義為特徵在於具有離表位的重原子在4 A的距離內的重原子(即非氫原子)的Ag殘基。表位基序
本發明的構建體的表位基序(EM)通常是指這樣的胺基酸序列，其位於構建體中使得在未切割狀態，甚至在單克隆抗體(mAB)或其片段的靶標存在的情況下，EM幹擾所述mAB或mAB片段與其靶標的結合。然而，在構建體的被切割狀態中，EM與所述靶標的結合減少，從而允許所述mAB或其片段更大地接近靶標並提供靶標結合。因此，EM為這樣的EM :其當未切割構建體時阻止mAB或其片段結合其靶標，但一旦構建體被切割，則基本上或顯著地並不幹擾mAB對靶標的結合或與mAB競爭結合靶標。因此，EM和CM的聯合提供了可活化構建體，其中當未切割所述構建體時EM減少靶標結合，並且CM經由蛋白酶的切割提供增加的靶標結合。EM的結構性質視許多因素而變化，例如幹擾mAB與其靶標結合所需的最小胺基酸序列、互補位/表位的相互作用、CM的長度、CM是否位於EM內、接頭存在與否、mAB或其片段之內或側翼是否存在可提供半胱氨酸-半胱氨酸ニ硫鍵的半胱氨酸等。所述EM的C端可與所述CM的N端共價連接。所述EM的C端可與mAB或其片段通過例如半胱氨酸化學法、聚糖化學法、N端化學法或賴氨酸化學法共價連接。所述EM可包含與所述mAB或其片段的CDR區相互作用的靶選擇蛋白的ー個或多個殘基。所述EM可為線性的，或者其可為結構表位的線性裝配體。如可通過結合相互作用分析(例如實施例4和5中所述的分析)檢測的，所述EM可阻止所述mAB或其片段結合其靶標。所述EM可包含與SEQ ID NO: 3的殘基20-39 (SVLQCLATGNWNSVPPECQA)對應的胺基酸序列。所述EM可以多種不同的形式提供。所述EM可以與其靶選擇蛋白相同的親和カ結合mAB或其片段。所述EM可以小於其靶選擇蛋白的親和カ結合mAB或其片段，例如以在CM被切割時減少靶標-mAB結合中EM的幹擾。所述mAB和EM可包含非天然存在的胺基酸序列。所述mAB和EM可為抗CD62P mAB或其片段的結合配偶體對，和選擇蛋白例如CD62P或其衍生物的完整或部分胞外域，其充當所述mAB或其片段的結合配偶體。還可選擇mAB或其片段和EM使其不是天然的結合配偶體。例如EM可為mAB或其片段的修飾的結合配偶體。 在該情況下，EM可包含胺基酸修飾，所述胺基酸修飾至少稍稍降低其對mAB結合的親和カ和/或親合力，使得在切割後，EM基本上或顯著地並不幹擾mAB-靶標的結合。或者，EM不能特異性結合mAB或其片段，而是經由非特異相互作用例如位阻幹擾mAB-靶標的結合。EM可包含⑶62P的片段。此類片段可包含⑶62P的多至200個、例如多至150個、例如多至100個、例如多至75個、例如多至50個、例如多至25個、例如20個、例如19個、例如18個、例如17個、例如16個、例如15個、例如14個、例如13個、例如12個、例如11個、例如10個、例如9個、例如8個、例如7個、例如6個、例如5個、例如4個、例如3個、例如2個、例如I個胺基酸。這些片段可為胺基酸的単一連續區段。這些片段還可裝配為許多以特定順序結合到一起的胺基酸的短連續區段。所述片段還可與並不屬於人CD62P的序列的胺基酸的任何其它連續區段組合。在一個實施方案中，此類片段可為⑶62P20-39。可按照通過實驗表位作圖法和計算表位作圖法得到的結構信息設計EM候選物。這些實驗方法包括誘變、X射線晶體學(XTal)、核磁共振(NMR)光譜學、氫氘交換質譜(HXMS)和各種競爭結合法例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、Biacore或螢光激活細胞分選術FACS法。所有這些方法已良好建立。EM候選物還可利用基於進化的篩選法例如噬菌體展示和細菌展示來鑑定。這些方法通過將編碼此類肽的基因剪接至編碼靶向外膜的噬菌體衣殼結構蛋白或細菌蛋白或裝配至鞭毛和菌毛結構的蛋白的基因，來利用噬菌體顆粒的表面或細菌表面上外來(多)肽的展示。利用重組DNA技術，可構建噬菌體上提呈的數億肽、蛋白變體、基因片段編碼的蛋白或cDNA編碼的蛋白的集合(所謂的展示文庫)。一個眾所周知的實例為FliTrx系統，其中肽作為大腸桿菌硫氧還蛋白的活性位點環內的限制性插入呈現，所述活性位點環進而被插入豐富的重複鞭毛蛋白FliC的表面暴露的區域中。然後抗體的結合特異性和特定表位的確定可通過將討論中的展示法與利用例如磁性激活細胞分選術(MACS)或螢光激活細胞分選術(FACS)方法的選擇和篩選程序組合來確定。這樣可選擇(多)肽作為基於討論中的抗體或其片段的結合特異性的可活化構建體的表位基序候選物[參考文獻Daugherty, P. S. (2007)用細菌工程改造的蛋白(Protein engineering withbacterial). Curr Opin Struct Biol 17: 474-80. Bratkovi , T. (2010)曬菌體展不的發展技術演變及其應用(Progress in phage display: evolution of the techniqueand its applications). Cellular and Molecular Life Sciences 67: 749-67]。通過所提及方法之一選擇的EM候選物可進一步通過用一種或多種天然或非天然胺基酸改變和/或互換(多)肽的殘基來最優化。這樣可增加或減少討論中的抗體或其片段的特異性和/或親和力。這可用於設計反映例如藥物組合物的最佳功能性和/或用法的基序與討論中的抗體或其片段的特異結合模式。結合親和力
本文術語「結合親和力」用作兩種分子(例如抗體或其片段和抗原)之間的非共價相互作用的強度的衡量。術語「結合親和力」用於描述單價相互作用(固有活性)，並且可區別於「結合親合力」(功能性親和力)，其是指多價相互作用的強度。兩種分子(例如抗體或其片段和抗原)之間通過單價相互作用的結合親和力，可通過解離常數(Kd)的確定來定量。進而，Kd可通過檢測複合體形成和解離的動力學(例如 通過SPR法(Biacore))來確定。與單價複合體的結合和解離對應的速率常數分別被稱作結合速率常數ka (或kj和解離速率常數kd (或k。^)。Kd通過等式Kd = kd / ka與ka和kd相關。按照以上定義，與不同分子相互作用相關的結合親和力，例如不同抗體對給定抗原的結合親和力的比較，可通過各個抗體/抗原複合體的Kd值的比較來進行。類似地，相互作用的特異性可通過目標相互作用(例如抗體和抗原之間特異的相互作用)的Kd值與非目標相互作用的Kd值的確定和比較來評價。典型地，抗體對靶標的Kd為抗體對其它非靶標分子例如環境中的不相關物質或伴隨物質的Kd的1/2、優選1/5、更優選1/10。更優選地，所述Kd為對其它非靶標分子的Kd的1/50，例如 1/100 或 1/200 ;甚至更優選 1/500，例如 1/1000 或 1/10000。該解離常數的值可通過眾所周知的方法直接確定，甚至對於複雜混合物可通過例如以下的方法計算出來，例如Caceci等(Byte 9:340-362, 1984)中所述的那些方法。例如，Kd可利用雙濾膜硝化纖維素濾膜結合測定(例如由Wong和Lohman (Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90, 5428-5432，1993)公開的方法)建立。評價配體例如抗體對靶標的結合能力的其它標準測定為本領域已知，包括例如ELISA、蛋白印跡、RIA和流式細胞術分析。抗體的結合動力學和結合親和力還可通過本領域已知的標準測定例如表面等離振子共振(SPR)例如通過使用Biacore 系統來評價。可進行競爭結合測定，其中將抗體與靶標的結合與靶標被該靶標的另一種配體例如另一種抗體的結合進行比較。發生50%抑制的濃度被稱作Ki。在理想條件下，Ki等於Kd。Ki值絕不會比Kd小，因此Ki的檢測可便利地被取代以提供Kd的上限。本發明的抗體對其靶標可具有I X 10_7M或更少、I X 10_8M或更少、或I X10_9M或更少、或I X I(TkiM或更少、或I X I(T11M或更少、或I X 10_12M或更少的Kd。特異性結合其靶標的抗體可以高親和力結合其靶標，換言之，表現出如上所述的低KD，並且可以較低親和力結合其它的非靶標分子。例如，抗體可以I X KT6M或更多、更優選I X KT5M或更多、更優選I X 10_4M或更多、更優選I X 10_3M或更多、甚至更優選I X 10_2M或更多的Kd結合非靶標分子。本發明的抗體優選能夠以以下親和力結合其靶標，所述親和力為其對另一種非靶標分子的結合親和力的至少2倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10000倍或更多。可切割基序
本發明的構建體的可切割基序(CM)可包含這樣的胺基酸序列，其可作為蛋白酶(通常為胞外蛋白酶)的底物起作用。CM位於構建體中使得當在靶標存在的情況下，CM被切割劑切割(例如CM的蛋白酶底物被蛋白酶切割)導致形成被切割狀態時，單克隆抗體或其片段結合其靶標，而在未切割狀態中，在其靶標存在的情況下，單克隆抗體或其片段與其靶標的結合被表位基序(EM)抑制。應指出的是CM的胺基酸序列可與M重疊或包含於M中，使得當構建體處於未切割構象時，全部或部分CM促進單克隆抗體或其片段的互補位的「掩蔽」。如上所述，CM可基於位於與構建體的單克隆抗體或其片段的所需靶標相同的微環境的蛋白酶來選擇。已知許多不同的條件，其中目標靶標與蛋白酶共定位，其中蛋白酶的底物為本領域已知的。例如，靶標組織可為活化的血小板。
因此，在選擇構建體的mAB使得其能夠結合靶標例如⑶62P時，合適的CM為包含可被以下蛋白酶切割的肽底物的CM，所述蛋白酶存在於損傷血管部位，特別是與完整血管相比以升高的水平存在於損傷血管部位。CM可為蛋白酶的切割位點，例如蛋白酶的活化肽，例如絲氨酸蛋白酶的活化肽。所述CM的長度可多至200個胺基酸，例如多至150個胺基酸，例如多至100個胺基酸，例如多至75個胺基酸，例如多至50個胺基酸，例如多至25個胺基酸，例如2-20個胺基酸，例如20個胺基酸，例如19個胺基酸，例如18個胺基酸，例如17個胺基酸，例如16個胺基酸，例如15個胺基酸，例如14個胺基酸，例如13個胺基酸，例如12個胺基酸，例如11個胺基酸，例如10個胺基酸，例如9個胺基酸，例如8個胺基酸，例如7個胺基酸，例如6個胺基酸，例如5個胺基酸，例如4個胺基酸，例如3個胺基酸，例如2個胺基酸。P1』可為選自A、G、I、L、S和T的胺基酸。所述CM的Pl可為選自R和K的胺基酸。在ー個特定的實施方案中，CM的Pl為R。在另ー個特定的實施方案中，CM的Pl為K。在一個實施方案中，CM的P1-P1』為RI0在另ー個實施方案中，CM的P1-P1』為RG。在第三個實施方案中，CM的P1-P1』為RT。在又一個實施方案中，CM的P1-P1』為RS。P2可為選自A、I、L和P的胺基酸。P3可為選自 A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和 V 的任何胺基酸。P4 可為選自 A、Q、G、I、L、F、W和V的胺基酸。CM可為血纖肽A(FpA)或其片段，例如與SEQ ID NO: 3的殘基40-49 (DFLAEGGGVR)對應的胺基酸序列。CM可為血纖肽B(FpB)或其片段。CM可為因子V的活化肽。CM可為因子VII的活化肽。CM可為FVIII的活化肽。CM可為PARl的活化肽。CM可為PAR2的活化肽。切割齊U
依照本發明，切割劑可為任何蛋白酶，其在與本發明構建體的靶標相同的生物微環境中存在並有活性並且能夠減少可切割基序。因此，所述蛋白酶可存在於活化的血小板或損傷血管附近。CM可被選自以下的酶切割凝血酶、因子Vila (FVIIa)、因子IXa (FIXa)、因子Xa (FXa)、因子XIa (FXIa)、因子XIIa (FXIIa)、激肽釋放酶、活化蛋白C (APC)、纖溶酶、組織纖溶酶原激活劑(tPA)和尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)。CM可被凝血酶切割。CM可被FVIIa切割。CM可被FIXa切割。CM可被FXa切割。CM可被FXIa切割。CM可被FXIIa切割。CM可被激肽釋放酶切割。CM可被APC切割。CM可被纖溶酶切割。CM可被tPA切割。CM可被uPA切割。術語「蛋白酶」和「能夠切割多肽的酶」在本文可互換使用，是指能夠水解肽鍵的任何酶，例如活化的絲氨酸蛋白酶。編碼候選構建體的核酸序列的產生
用於篩選法的候選構建體的產生可利用本領域已知的方法來實現。多肽展示、單鏈抗體展示、抗體展示和抗體片段展示為本領域熟知的方法。一般而言，選擇在候選構建體文庫中變化的構建體的元件(例如EM)用於隨機化。文庫中的候選構建體可完全隨機化或者在其隨機化方面有偏崎，例如通常在核苷酸/殘基頻率方面或在元件內的胺基酸的位置方面。至於「隨機化的」意指在隨機化胺基酸序列內任何給定位置上可提供任何遺傳上可編碼的胺基酸。待優化的構建體的元件的胺基酸序列還可部分隨機化。例如構建體元件(例如候選表位基序)可部分隨機化以便在選定位置提供僅一個胺基酸亞群(例如以在胺基酸序列的選定位置提供柔性接頭、以提供具有所需特徵(例如疏水的、極性的、帶正電的、帶負電的等)的胺基酸殘基)。在另一個實例中，構建體元件(例如候選表位基序)可部分隨 機化以便選擇另外隨機化胺基酸序列中的一個或多個殘基並在構建體文庫成員的群或亞群中保持不變。利用此類方法，可產生在待變化的元件的胺基酸序列長度之內具有胺基酸序列的多種不同的可能組合的候選構建體，從而提供隨機化候選構建體的文庫。因此，在一些實施方案中，候選構建體的文庫可完全隨機化，在待優化的元件的任何位置沒有序列偏好或恆定。在其它的實施方案中，候選肽的文庫有偏崎。換言之，序列內的一些位置或保持恆定，或選自有限數目的可能性。例如，在一個實施方案中，核苷酸或胺基酸殘基在例如疏水胺基酸、親水殘基、立體偏崎(小或大)的殘基、傾向於產生用於交聯的半胱氨酸的限定種類內隨機化。嵌合構建體的形成
DNA片段可根據本領域已知的常規技術連接。此類技術包括使用限制性內切酶以消化DNA片段、DNA聚合酶和核苷酸以填滿粘性末端以形成平末端，使用鹼性磷酸酶以避免非所需連接和使用連接酶以連接片段。本發明構建體的mAB或其片段、CM和EM可連接在一起以形成單一 DNA區段，或其本身可作為分離的區段保持。所述構建體可通過轉化與可供用於選擇的基因一起引入細胞中，其中所述構建體變得整合至宿主基因組中。通常，所述構建體為具有被宿主細胞識別的複製系統的載體的一部分。表達載體
用於產生本發明的構建體的表達載體包括載體例如質粒。一般而言,此類載體包含調控序列，其允許表達於多種類型的宿主中，包括但不限於原核生物、酵母、真菌、植物和高等真核生物。包含所需的編碼序列和調控序列的合適的表達載體可利用本領域已知的重組DNA技術構建,許多所述技術描述於Sambrook,等，Molecular Cloning: A LaboratoryManual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, N. Y. (1989)。本發明考慮的表達載體可為Durocher,Y.等，(2002) Nucleic Acid Res, 30:E9中所述的pTT載體。此類表達載體至少能夠指導本發明的核酸的複製並優選指導本發明的核酸的表達。一類載體利用提供自主複製染色體外質粒的DNA元件，其來源於動物病毒(例如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒或SV40病毒)。第二類載體依靠所需基因序列整合至宿主細胞染色體中。本發明可用的表達載體包括控制主題DNA序列的複製和表達的序列。典型地，所述表達載體包含複製起點、位於待表達DNA序列的5』 (即上遊)的啟動子和轉錄終止序列。合適的複製起點包括例如Col EUSV40病毒和M13複製起點。合適的終止序列包括例如牛生長激素、SV40、lac Z和苜 蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)多面體多腺苷酸化信號。合適的啟動子包括例如免疫球蛋白H鏈啟動子、巨細胞病毒啟動子、lac Z啟動子、gal10啟動子和AcMNPV多面體啟動子。表達載體還可包括用於所需產物的優化表達的其它調節序列。此類序列包括穩定性前導序列，其提供表達產物的穩定性；分泌型前導序列，其提供表達產物的分泌；增強子，其上調DNA序列的表達；以及限制性內切酶識別序列，其為限制性內切核酸酶的切割提供位點。所有這些物質為本領域所已知並市售。參見例如Okayama, Mol. Cell. Biol. , 3280 (1983)。合適的表達載體還可包括標記序列，其允許轉化的宿主細胞的表型選擇。此類標記可提供營養缺陷型宿主的原養型、殺生物劑抗性(例如抗生素抗性)等。選擇標記基因可直接與待表達的DNA基因序列連接，或通過共轉染引入相同的細胞中。選擇標記的實例包括新黴素、氨苄青黴素和潮黴素抗性。宿主細胞
本發明還涉及包含一種或多種表達載體例如質粒的宿主細胞,所述載體包含編碼本發明的構建體的DNA序列。當利用與輕鍊表達載體一起的共轉染時，可應用許多不同的原核和真核宿主細胞。合適的原核宿主細胞包括例如大腸桿菌菌株HB101、DH5a和XLl Blue。合適的真核宿主細胞包括例如昆蟲細胞例如草地貪夜蛾{Spodoptem frugiperda)和真菌細胞例如巴斯德畢赤酵母iPichia pastor is)細胞和釀酒酵母i^BcchaxomycGS cerevisiae)細胞。其它合適的真核細胞為在體外生長於組織培養物中或動物中的哺乳動物細胞。哺乳動物細胞可為免疫球蛋白蛋白分子提供翻譯後修飾，包括正確的摺疊或正確位點上的糖基化。優選的哺乳動物細胞系包括CHO (DUKX細胞(Urlaub和Chasin，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 77:4216-4220，1980)、Hl 和 ATCC CCL 61 細胞系)、C0S-1 (ATCC CRL 1650)、幼侖鼠腎(BHK)和 HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham 等，I. Gen. Virol. 36:59-72，1977)細胞系。優選的BHK細胞係為tk- tsl3 BHK細胞系(Waechter和Baserga，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110，1982)，在下文稱為 BHK 570 細胞。BHK 570 細胞系可以ATCC登錄號CRL 10314獲自美國典型培養物保藏所(American Type CultureCollection), 12301 Parklawn Dr. , Rockville, MD 20852 下。tkT tsl3 BHK 細胞系還可以登錄號CRL 1632獲自ATCC。此外，還可使用許多其它細胞系，包括Rat Hep I (大鼠肝癌；ATCC CRL 1600)、Rat Hep II (大鼠肝癌；ATCC CRL 1548)、TCMK (ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)和 NCTC 1469 (ATCC CCL 9. I)細胞。可表達本發明的構建體的細胞可通過以下方法分離FACS、免疫層析或者當可檢測的標記有磁性時通過磁性分離。作為分離的結果，細胞群富含表現出所需特徵的構建體，例如在其切割後表現出結合選擇蛋白例如CD62P的構建體，或者在無切割時具有減少的或無可檢測的與靶標的結合的構建體。已結合可檢測標記的靶標的候選構建體的選擇可利用本領域已知的多種技術實現。例如流式細胞術(例如FACS(R))方法可用於從未標記的候選構建體中分選可檢測標記的候選構建體。可實施流式細胞術以在候選構建體的群的分離中提供更多或更少嚴格性要求，例如通過修改門控以允許「更暗的」細胞群分離至第二群中用於進一步的篩選或要求「更亮的」細胞群以便分離至第二群中用於進一步的篩選。本發明的構建體的篩選方法
本公開內容提供了鑑定本發明的可活化構建體的方法。一般而言，方法包括將多種候選構建體與能夠結合被切割的候選構建體的單克隆抗體或其片段的靶標，以及能夠切割所述構建體的可切割基序的蛋白酶接觸；選擇當暴露於蛋白酶時結合靶標的第一群成員，將所述第一群在不存在蛋白酶的情況下與靶標接觸，並從所述第一群中通過去除在不存在蛋白酶的情況下結合靶標的所述第一群成員來選擇第二群成員，其中所述方法提供這樣的候選構建體的選擇，所述候選構建體在不存在蛋白酶的情況下表現出與在存在蛋白酶的情況 下的靶標結合相比減少的與靶標的結合。一般而言，用於篩選具有所需可活化表型的候選構建體的方法通過陽性篩選步驟(以鑑定暴露於蛋白酶後結合靶標的成員)和陰性篩選步驟(以鑑定當不暴露於蛋白酶時不結合靶標的成員)來實現。所述陰性篩選步驟可通過例如從群體中去除在不存在蛋白酶的情況下結合靶標的那些成員來實現。文庫篩選方法可如下開始通過首先進行陰性篩選以選擇在不存在蛋白酶的情況下不結合標記的靶標的候選物(換言之，當完整時不結合標記的靶標)，然後進行陽性篩選(即用蛋白酶處理並選擇在被切割狀態中結合標記靶標的那些成員)。適應症
本發明的構建體可用於減少損傷部位的炎症。此外，本發明的構建體可經工程改造使得其適於治療凝血病。出於此目的，本發明的構建體可包含組織因子(SEQ ID NO: 11)或其功能性片段(SEQ ID NO: 13)。本文所用術語「凝血病」是指增加的出血傾向，其可由正常凝血級聯的任何促凝血組分的任何定性或定量缺失引起，或由纖維蛋白溶解的任何上調引起。此類凝血病可為先天和/或獲得性的和/或醫源性的並且可由臨床醫師鑑定。先天性低凝血病(congenital hypocoagulopathy)的非限定性實例為A型血友病、B型血友病、因子vn缺乏症、因子Xi缺乏症、馮維勒布蘭德病和血小板減少症例如Glanzmann血小板機能不全(Glanzmann』 s thombasthenia)和伯-索症候群(Bernard-Soulier syndrome)。獲得性凝血病的非限定性實例為由維生素K缺乏引起的絲氨酸蛋白酶缺乏；此類維生素K缺乏可由維生素K拮抗劑例如華法林的給予引起。獲得性凝血病還可發生在大範圍外傷後。在另外稱為「血性惡性循環(bloody vicious cycle) 」的該情況下，其特徵為血稀釋(稀釋的血小板病和凝固因子的稀釋)、低體溫、凝固因子的消耗和代謝紊亂(酸中毒)。液體療法和增加的纖維蛋白溶解可使該情況惡化。所述出血可來自身體的任何部分。含「抑制物」(即針對因子VIII的同種抗體)的A型血友病和含「抑制物」(即針對因子IX的同種抗體)的B型血友病為部分先天和部分獲得性的凝血病的非限制性實例。醫源性凝血病的非限制性實例為過量使用抗凝血劑藥物例如肝素、阿司匹林、華法林和其它血小板聚集抑制劑，其可開處方以治療血栓栓塞性疾病。醫源性凝血病的第二個非限制性實例為由過量和/或不適當的液體療法誘導的凝血病，例如可由輸血誘導的凝血病。在本發明的一個實施方案中，出血與A型血友病或B型血友病相關。在另ー個實施方案中，出血與含獲得性抑制物的A型血友病或B型血友病相關。在另ー個實施方案中，出血與血小板減少症相關。在另ー個實施方案中，出血與馮維勒布蘭德病相關。在另ー個實施方案中，出血與嚴重的組織損傷相關。在另ー個實施方案中，出血與嚴重外傷相關。在另一個實施方案中，出血與手術相關。在另ー個實施方案中，出血與出血性胃炎和/或腸炎相關。在另ー個實施方案中，出血為例如在胎盤早剝中的血崩。在另ー個實施方案中，出血發生在具有機械出血的有限可能性的器官中，例如顱內、耳內或眼內。在另ー個實施方案中，出血與抗凝血治療相關。使用本發明的所述單克隆抗體可顯著減少失血。使用本發明的所述單克隆抗體可顯著減少出血時間。 治療
本文所用術語「治療」是指有需要的任何人或其它動物受試者的醫學治療。預期所述受試者已經歷了醫師或獸醫的身體檢查，所述醫師或獸醫已給出了假定或確定的診斷，該診斷提示所述特異治療的使用對所述人或其它動物受試者的健康是有益的。所述治療的時限和目的可依據受試者的健康的現狀，隨不同個體而變化。因此，所述治療可為預防性的、減輕性的、針對症狀的和/或治癒性的。依照本發明，預防性的、減輕性的、針對症狀的和/或治癒性的治療可表示本發明的單獨的方面。因此，本發明的構建體可胃腸外給予。本發明的構建體可靜脈內給予。本發明的構建體可肌內給予。本發明的構建體可皮下給予。本發明的構建體可預防性給予。本發明的構建體可治療性給予(需要時)。實施方案
以下為本發明的實施方案的非限制性列表
I.一種構建體，其包含(i)單克隆抗體或其片段、(ii)可切割基序和(iii)包含(i)或其變體的表位基序的多肽序列。2.實施方案I的構建體，所述構建體還包含組織因子或其生物學上有功能的變體或片段。3.實施方案1-2中任一個的構建體，其中所述完整的單克隆抗體或其片段能夠結合細胞上的受體，所述細胞選自活化的血小板、活化的內皮細胞和白細胞。4.實施方案1-3中任一個的構建體，其中所述完整的單克隆抗體或其片段能夠結合活化的血小板上的受體。5.實施方案1-4中任一個的構建體，其中所述完整的單克隆抗體或其片段不能結合靜息的血小板上的受體。6.實施方案1-5中任一個的構建體，其中所述完整的單克隆抗體或其片段能夠結合活化的內皮細胞上的受體。7.實施方案3-6中任一個的構建體，其中所述受體為選擇蛋白。8.實施方案3或7中任一個的構建體，其中所述受體為E-選擇蛋白、P-選擇蛋白或L-選擇蛋白。9.實施方案8的構建體，其中所述選擇蛋白為⑶62P。10.實施方案1-9中任一個的構建體，其中所述可切割基序的C端與所述單克隆抗體或其片段的重鏈的N端共價連接。11.實施方案1-10中任一個的構建體，其中所述可切割基序的C端與所述單克隆抗體或其片段的輕鏈的N端共價連接。12.實施方案1-11中任一個的構建體，其中所述可切割基序的Pl可為選自R和K的胺基酸。 13.實施方案1-12中任一個的構建體，其中所述可切割基序為蛋白酶的切割位點。14.實施方案13的構建體，其中所述可切割基序為蛋白酶的活化肽。15.實施方案14的構建體，其中所述蛋白酶為絲氨酸蛋白酶。16.實施方案12-15中任一個的構建體，其中所述可切割基序可被選自以下的酶切割凝血酶、因子Vila (FVIIa)、因子IXa (FIXa)、因子Xa (FXa)、因子XIa (FXIa)、因子XIIa (FXIIa)、激肽釋放酶、活化蛋白C (APC)、纖溶酶、組織纖溶酶原激活劑(tPA)和尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)。17.實施方案12-16中任一個的構建體，其中所述可切割基序的長度為約2-20的胺基酸，例如20個胺基酸、例如19個胺基酸、例如18個胺基酸、例如17個胺基酸、例如16個胺基酸、例如15個胺基酸、例如14個胺基酸、例如13個胺基酸、例如12個胺基酸、例如11個胺基酸、例如10個胺基酸、例如9個胺基酸、例如8個胺基酸、例如7個胺基酸、例如6個胺基酸、例如5個胺基酸、例如4個胺基酸、例如3個胺基酸、例如2個胺基酸。18.實施方案15-17中任一個的構建體，其中P2可為選自A、I、L和P的胺基酸。19.實施方案15-18中任一個的構建體，其中P2可為選自A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V的任何胺基酸。20.實施方案15-19中任一個的構建體，其中P4可為選自A、Q、G、I、L、F、W和V
的胺基酸。21.實施方案15-20中任一個的構建體，其中P1』可為選自A、G、I、L、S和T的胺基酸。22.實施方案14的構建體，其中所述可切割基序為血纖肽A (FpA)或其片段，例如與SEQ ID NO: 3的殘基40-49 (DFLAEGGGVR)對應的胺基酸序列。23.實施方案22的構建體，其中所述可切割基序的Pl為R。24.實施方案22-23中任一個的構建體，其中所述可切割基序的P1-P1』為RI。25.實施方案22-24中任一個的構建體，其中所述可切割基序的P1-P1』為RG。26.實施方案14的構建體，其中所述可切割基序為血纖肽B (FpB)或其片段。27.實施方案26的構建體，其中所述可切割基序的Pl為R。28.實施方案26-27中任一個的構建體，其中所述可切割基序的P1-P1』為RG。29.實施方案14的構建體，其中所述可切割基序為因子V的活化肽。30.實施方案29的構建體，其中所述可切割基序的Pl為R。31.實施方案29-30中任一個的構建體，其中所述可切割基序的P1-P1』為RT。
32.實施方案29-31中任一個的構建體，其中所述可切割基序的P1-P1』為RS。33.實施方案15的構建體，其中所述可切割基序為因子VII的活化肽。34.實施方案33的構建體，其中所述可切割基序的Pl為R。35.實施方案33-34中任一個的構建體，其中所述可切割基序的Pl為K。36.實施方案14的構建體，其中所述可切割基序為FVIII的活化肽。37.實施方案36的構建體，其中所述可切割基序的Pl為R。38.實施方案14的構建體，其中所述可切割基序為PARl的活化肽。39.實施方案38的構建體，其中所述可切割基序的Pl為R。

40.實施方案38-39中任一個的構建體，其中所述可切割基序的P1-P1』為RS。41.實施方案14的構建體，其中所述可切割基序為PAR2的活化肽。42.實施方案41的構建體，其中所述可切割基序的Pl為R。43.實施方案41-42中任一個的構建體，其中所述可切割基序的P1-P1』為RS。44.實施方案1-43中任一個的構建體，其中所述表位基序的C端與所述可切割基序的N端共價連接。45.實施方案44的構建體，其中所述表位基序還與單克隆抗體或其片段共價連接。46.實施方案1-45中任一個的構建體，其中所述表位基序包含與所述單克隆抗體或其片段的CDR區相互作用的靶受體的ー個或多個殘基。47.實施方案46的構建體，其中所述表位基序是線性的。48.實施方案46的構建體，其中所述表位基序是結構表位的線性裝配體。49.實施方案1-48中任一個的構建體，其中如可通過結合相互作用分析(例如實施例4和5中所述的分析)檢測的，所述表位基序阻止所述單克隆抗體或其片段結合其靶標。50.實施方案49的構建體，其中所述表位基序包含與SEQ ID NO: 3的殘基20-39(SVLQCLATGNWNSVPPECQA)對應的胺基酸序列。51.實施方案1-50中任一個的構建體，其中如可利用螢光激活細胞分選術(FACS)分析(例如實施例4中所述的分析)檢測的，所述單克隆抗體或其片段可在所述可切割基序被切割時結合其靶標。52.實施方案1-51中任一個的構建體，其中所述單克隆抗體包含SEQ ID NO: 8。53.實施方案1-52中任一個的構建體，其中所述單克隆抗體包含SEQ ID NO: 9。54.ー種多核苷酸,其編碼實施方案1-53中任一個的構建體。55.ー種載體，其包含實施方案54的多核苷酸。56.ー種質粒,其包含實施方案54的多核苷酸。57.一種分離的細胞，其包含實施方案54的多核苷酸。58.一種分離的細胞，其包含實施方案55的載體。59.一種分離的細胞，其包含實施方案56的質粒。60.實施方案59的分離的細胞，其中所述細胞是真核細胞。61.實施方案60的真核細胞，其為哺乳動物。62.實施方案61的哺乳動物細胞，其選自CHO細胞、BHK細胞和HEK細胞。
63.實施方案57-62中任一個的細胞，其能夠表達實施方案1-53中任一個的構建體。64. 一種藥物組合物，其包含實施方案1-53中任一個的構建體和藥學上可接受的載體。65.實施方案1-53中任一個的構建體在治療有需要的受試者中與血管破裂相關的並存病即出血和炎症中的用途。66.實施方案1-53中任一個的構建體在治療凝血病中的用途。67.實施方案1-53中任一個的構建體在抑制動脈硬化性泡沫細胞的增殖中的用途。
68.實施方案1-53中任一個的構建體在治療炎症中的用途。69.實施方案1-53中任一個的構建體在預防惡性增殖細胞的轉移中的用途。70. 一種治療與血管破裂相關的並存病特別是出血和炎症的方法，所述方法通過給予有需要的受試者實施方案1-53中任一個的構建體來進行。71. 一種治療凝血病的方法，所述方法包括給予有需要的受試者實施方案1-53中任一個的構建體。72. 一種治療炎症的方法，所述方法包括給予有需要的受試者實施方案1-53中任一個的構建體。73. 一種治療癌症的方法，所述方法包括給予有需要的受試者實施方案1-53中任一個的構建體。通過以下實施例進一步地闡述本發明，以下實施例不應理解為限制保護的範圍。之前描述和以下實施例中公開的特徵既可單獨地又可以其任何組合作為用於以其多種形式實現本發明的材料。
實施例實施例I :編碼EP-FdA-抗CD62P HC、抗CD62P HC和抗CD62 LC的表汰構津體的遞
抗CD62P mAb的LC和HC可變域的胺基酸序列(命名為PBl. 3 HC-V和PBl. 3LC-V)連同PBl. 3結合表位的胺基酸序列(命名為EP)獲自美國專利5，800, 815。凝血酶可切割接頭的胺基酸序列(命名為FpA)基於人纖維蛋白原a鏈中的凝血酶切割位點的胺基酸序列(檢索自公用資料庫)。編碼I) EP-FpA-PBl. 3 HC_V、2) PBl. 3 HC-V或編碼 3) PBl. 3 LC-V 的 DNA序列在外面的CRO，Geneart Inc, CA, USA合成。製備出如下的DNA序列，其包含5』端HindIII位點(AAGCTT)和緊接起始甲硫氨酸的5』端的kozak序列(GCCGCCACC)，並且對於包含HC-V的序列包含符合讀框的3』端NheI位點(GCTAGC)，對於PBl. 3 LC-V序列包含符合讀框的3，端 BsiffI 位點(CGTACG)(圖 1A、圖 IB 和圖 1C)。包含 PBl. 3 HC-V 的 DNA 序列(I 和 2)用HindIII和NheI消化並插入基於pTT的表達載體的HindIII和NheI位點中，該表達載體包含人IgG4 CHl-鉸鏈-CH2-CH3序列。所得載體分別命名為pTT_EP-FpA-PBl. 3 HC和pTT-PBl. 3 HC (圖2A和圖2B)。PBl. 3 LC-V DNA序列用HindIII和BsiWI消化並插入基於PTT的表達載體的HindIII和BsiWI位點中，該表達載體包含人LC k恆定序列。所得載體命名為 pTT-PBl. 3 LC (圖 2C)。pIT 載體基本上描述於 Durocher, Y.等，(2002) NucleicAcid Res, 30: E9。利用以下質粒組合建立兩種瞬時共轉染實驗1) pTT-PBl. 3 LC +pTT-EP-FpA-PBl. 3 HC 和 2) pTT-PBl. 3 LC + pTT-PBl. 3 HC。在各轉染實驗中，質粒以近似等摩爾比共轉染。HEK293-6E細胞生長於補充了 1% P/S (GIBC0目錄號15140-122)、0. I % pluronic (GIBC0,目錄號 24040-032)和 25 ug/mL 遺傳黴素(GIBC0，目錄號 10131-019)的 Freestyle HEK293 培養基(GIBC0，目錄號 12338-018)並將細胞用293fectin (Invitrogen,目錄號12347-019)以I X 106/mL的細胞密度轉染。對於姆升HEK293-6E細胞，轉染通過將I mg質粒DNA稀釋至30 mL Optimem (稀釋液A)中並通過將 I mL 293fectin 稀釋至 30 mL Optimem (GIBC0,目錄號 51985-026，稀釋液 B)中來進行。將稀釋液A和稀釋液B混合併在室溫孵育30分鐘。之後將轉染混合物加入HEK293-6E細胞中並將細胞在37°C下孵育於具有定軌旋轉(125 rpm)的增溼培養箱中。轉染後五天，通過離心去除細胞並將分別包含EP-FpA-PBl. 3 mAb和PBl. 3 mAb的兩種所得細胞培養上清液在純化前無菌過濾。
實施例2 EP-FpA-PBI. 3 mAb構律體和PBl. 3 mAb構律體的純化
mAb構建體EP-FpA-PBl. 3 mAb和PBl. 3的蛋白純化利用基於蛋白A的親和樹脂MabSelect SuRe (GE Healthcare,目錄號 17-5438)進行。樹脂填充在 Tricornl0/100柱中至約8 ml的柱床體積。純化利用Akta Explorer層析系統(GE Healthcare,目錄號18-1112-41)進行。用於純化步驟的緩衝液系統為由20 mM磷酸鈉、150 mM NaCl, pH 7.2組成的平衡緩衝液和10 mM甲酸，pH 3. 5組成的洗脫緩衝液。將無菌過濾的細胞培養上清液不作任何調節直接上樣於預平衡的MabSelect Sure柱中。將柱用10個柱體積的平衡緩衝液洗滌，並用約I. 5個柱體積的洗脫緩衝液等度洗脫蛋白。根據UV280監控，製備包含洗脫蛋白的流分的合併物並用SDS-PAGE/考馬斯、高壓液相色譜和基質輔助的雷射解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)分析來分析。兩種製備物各自顯示出均一且純的蛋白組成，其中單ー主要分子量分別為約148. I kDa和154. 8 kDa。這些質量與兩種重組mAb構建體EP-FpA-PBl. 3和PBl. 3的預期值對應。終蛋白濃度用NanoDrop分光光度計(ThermoScientific,目錄號ND-1000)聯合I. 4的吸光係數來檢測。實施例3 =EP-FpA-PBI. 3和PBl. 3 mAb構津體的凝血酶消化
為了證明EP-FpA-PBl. 3 mAb構建體的凝血酶可切割性/可活化性，在基於⑶62P/P-選擇蛋白的血小板結合測定前將蛋白用血漿來源的人凝血酶(Roche目錄號10 602 400001)消化。將PBl. 3 mAb構建體作為對照包括在內。凝血酶消化通過將EP-FpA-PBl. 3和PBl. 3 mAb構建體在稀釋緩衝液中稀釋至0. I U M來進行，稀釋緩衝液由50 mM TrispH 8.2,150 mM NaCl組成。將凝血酶溶解於相同的緩衝液中。凝血酶切割在相比於EP-FpA-PBl. 3和PBl. 3 mAb構建體為其1/10的摩爾濃度、與其等摩爾的濃度和為其4倍的摩爾濃度下測試。反應後用SDS-PAGE和MALDI-TOF MS進行分析。包括對照反應，其中向反應混合物中僅加入了緩衝液而無凝血酶。對於含凝血酶的所有反應混合物觀察到EP-FpA-PBl. 3 mAb構建體的6. I kDa的質量減少。當無凝血酶加入吋，沒有觀察到EP-FpA-PBl. 3 mAb構建體的質量變化。不論反應混合物中存在或不存在凝血酶，在無延伸N端的情況下構建的PBl. 3 mAb構建體沒有顯示出任何的質量變化。製備了以下四種樣品用於基於CD62P/P-選擇蛋白的血小板結合測定
樣品I)與凝血酶一起孵育的EP-FpA-PBl. 3 mAb。樣品2)在不含凝血酶的情況下孵育的EP-FpA-PBl. 3 mAb。樣品3)與凝血酶一起孵育的PBl. 3 mAb。樣品4)在不含凝血酶的情況下孵育的PBl. 3 mAb。實施例4:利用螢光激活細胞分選術(FACS)的基於CD62P/P-選擇蛋白的血小板結合測定
為了證明凝血酶切割的EP-FpA-PBl. 3 mAb特異性結合包含表面表達的⑶62P/P-選擇蛋白的活化的血小板，利用來自健康供者的純化血小板進行基於FACS的細胞結合實驗。簡而言之，通過肘前靜脈的靜脈穿刺抽取來自健康供者的血液。血液用含3. 2 %檸檬酸鈉 的9 ml管(Vacuette管，參考號455322，9NC)抽取，小心搖動並立即用於分析。血小板製備物通過製得標準的血小板富集血漿(PRP)來產生。在此，將抗凝的全血離心(200g，15分鐘)，無破碎(without brake)。收穫含PRP的上層並以5 u g/ml的終濃度加入前列腺素E (ProstaE) (Sigma,目錄號P5515)以抑制血小板的活化。洗漆並製備血小板用於染色。為了製備一批活化的血小板，用62. 5 u g/ml PAR-I (Bachem.,目錄號H-2936，批號3000205)和 100 ng/ml Convulxin (Pentapharm,目錄號 404914/119-02)進行 10 分鐘的雙重激動活化。每孔使用50-100. 000個細胞。實驗中包括名ScmAPC的陰性同種型匹配的mAb作為對照。與RPE (活化的血小板標記，Becton Dickenson,目錄號348107批號05338)綴合的抗⑶62P抗體標記用於確定雙重激動活化的和ProstaE抑制的PRP製備物的活化和非活化情況。不論是否與凝血酶預孵育，在非活化血小板上沒有觀察到PBl. 3 mAb構建體的結合(參見圖3A)。不論是否與凝血酶預孵育，在活化的血小板上觀察到PBl. 3 mAb構建體的結合。這確定了 PB1.3 mAb選擇性結合於活化的血小板，如美國專利5，800，815中所述。此外，該結合反應與對來自Becton Dickenson的市售抗⑶62P抗體觀察到的反應相似，該抗體用作陽性對照和血小板活化的標記(數據未顯示)。不論是否與凝血酶預孵育，EP-FpA-PBl. 3 mAb構建體顯示出不與非活化的血小板結合,而只有凝血酶預活化的樣品才發生與活化的血小板的結合(圖3B)。同種型匹配對照抗體cmAPC並不顯示與非活化或活化的血小板的任何結合(圖3A和圖3B)。因此，在所述的基於細胞的FACS實驗中證明了EP-FpA-PBl. 3的結合域的屏蔽效應和凝血酶的可切割性/可活化性。實施例5 :結合相互作用分析
結合相互作用分析通過Biacore T-100儀中的表面等離振子共振得到。固定濃度的相關構建體的捕獲通過在10 mM乙酸鈉pH 4. 5-5. 0中直接固定至mAb的CM5晶片至500-1000RU的水平來獲得。測試重組人全長⑶62P的200 nM-0. 2 nM的四倍稀釋液與固定化構建體的結合。運行緩衝液和稀釋緩衝液10 mM HEPESU50 mM、0. 005% p20、pH 7. 4。通過10 mM甘氨酸，pH I. 7得到再生。假定⑶62P和目標構建體的I :1相互作用，利用Biacore TlOO評價軟體得到動力學常數和結合常數(km、I^pKd)的測定。在CD62P被給定構建體結合時，不同的構建體對與CD62P的結合的競爭如下獲得通過在CM5晶片將給定構建體以5000 RU固定化，接著與50 nM⑶62P結合，接著改變備選構建體的濃度以測試其競爭。晶片的再生用10 mM甘氨酸，pH I. 7獲得。
本文引用的所有參考文獻(包括出版物、專利申請和專利)，都通過引用以其整體結合於本文中，其結合程度如同各個參考文獻單獨並具體地指出通過引用結合，並以其整體陳述在本文中(至法律允許的最大程度)。本文所有標題和副標題僅出於便利而使用且不應理解為以任何方式限制本發明。本文提供的任何及所有的實例或示例性語言(例如「例如」)的使用，僅g在更好地闡述本發明並且除非另外要求保護，否則不應對本發明的範圍形成限制。本說明書中的語言不應理解為指出任何非要求保護的要素對本發明的實施所必需。本文對專利文件的引用和結合僅出於便利而進行且並不反映此類專利文件的有效性、專利性和/或可執行性的任何觀點。若，本發明包括適用法制所允許的隨附權利要求中所述的主題的所有修改和等 同物。
權利要求
1.一種構建體，其包含(i)單克隆抗體或其片段、(ii)可切割基序和(iii)包含(i)的表位基序的多肽序列。
2.權利要求I的構建體，所述構建體還包含組織因子或其生物學上有功能的變體或片段。
3.權利要求1-2中任一項的構建體，其中所述構建體的所述單克隆抗體能夠結合細胞上的受體，所述細胞選自活化的血小板、活化的內皮細胞和白細胞。
4.權利要求1-3中任一項的構建體，其中所述構建體的所述單克隆抗體能夠結合活化的血小板上的受體。
5.權利要求4的構建體，其中所述受體為CD62P。
6.權利要求1-5中任一項的構建體，其中所述可切割基序為蛋白酶的切割位點。
7.權利要求6的構建體，其中所述可切割基序為血纖肽A(FpA)或其片段，例如與SEQID NO: 3的殘基40-49 (DFLAEGGGVR)對應的胺基酸序列。
8.權利要求1-7中任一項的構建體，其中所述表位基序包含與SEQID NO: 3的殘基20-39 (SVLQCLATGNWNSVPPECQA)對應的胺基酸序列。
9.權利要求1-8中任一項的構建體，其中如可利用螢光激活細胞分選術(FACS)分析(例如實施例4中所述的分析)檢測的，所述單克隆抗體或其片段可在所述可切割基序被切割時結合其靶標。
10.權利要求1-9中任一項的構建體，其中所述單克隆抗體包含SEQID NO: 8。
11.權利要求1-10中任一項的構建體，其中所述單克隆抗體包含SEQID NO: 9。
12.—種多核苷酸,所述多核苷酸編碼權利要求1-11中任一項的構建體。
13.一種分離的細胞，所述細胞能夠表達權利要求1-11中任一項的構建體。
14.權利要求1-11中任一項的構建體在治療有需要的受試者中與血管破裂相關的並存病即出血和炎症中的用途。
15.一種治療與血管破裂相關的並存病特別是出血和炎症的方法，所述方法通過給予有需要的受試者權利要求1-11中任一項的構建體來進行。
全文摘要
本發明涉及一種構建體、編碼所述構建體的多核苷酸以及表達所述構建體的細胞。此外，本發明涉及所述構建體在治療出血及其相關並存病中的用途，並涉及治療出血、炎症和癌細胞轉移的方法。
文檔編號A61K38/36GK102770454SQ201180009859
公開日2012年11月7日 申請日期2011年2月18日 優先權日2010年2月19日
發明者J.R.布傑爾克, S.N.格雷爾, T.埃格布傑格 申請人:諾沃—諾迪斯克有限公司