中國葉蟎屬常見種的pcr-rflp鑑定方法
2023-10-22 18:25:17
中國葉蟎屬常見種的pcr-rflp鑑定方法
【專利摘要】本發明公開了中國葉蟎屬常見種的PCR-RFLP鑑定方法。該方法通過DNA提取，多聚酶鏈式反應（PCR）擴增出核糖體轉錄間隔區序列片段（ITS）後經過四種限制性內切酶酶切得到種特異性的限制性片段長度多態性圖譜（RFLP），最後對照標準圖譜對中國葉蟎屬常見種實現快速準確鑑定。本發明所述葉蟎屬常見種的快速鑑定方法迅速、簡單、可靠，還可用於葉蟎批量鑑定。此分子鑑定技術為葉蟎屬科研、檢疫和田間防治準確鑑定種提供了保障。
【專利說明】中國葉蟎屬常見種的PCR-RFLP鑑定方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，涉及中國葉蟎屬常見種的PCR-RFLP鑑定方法。
【背景技術】
[0002]葉蟎是蝶蟎亞綱(Acari)、真蟎總目(Acariformes)、絨蟎目(Trombidiformes)、前氣門亞目(Prostigmata)、異氣門總股(Eleutherengonides)、葉蟎科(Tetranychidae)的植食性蟎類。葉蟎是一種危害果蔬和溫室植物的世界範圍的重要經濟害蟲。葉蟎屬(Tetranychus)是葉蟎科中經濟意義最大的一類葉蟎。該屬葉蟎與農業生產的關係密切，爆發嚴重時常導致作物乾枯落葉，生長停滯，嚴重影響產量和質量，在經濟上造成一定的損失。雖然葉蟎屬葉蟎經濟意義重大，但是由於形態學特徵有限，且這些特徵在不同種之間具有高度的相似性，再者同一植株或者同一葉片上葉蟎常常會混合發生，使得葉蟎的快速準確鑑定存在較大的困難。
[0003]目前，對於常規形態學鑑定較難分辨的物種，通常是採取PCR擴增特定片段如CO1、ITS等然後直接測序，通過與資料庫中已知序列對比鑑定物種。然而，此方法存在如下缺陷:1.資料庫中的已知序列來源廣泛，提交序列時資料庫無法鑑別序列所屬葉蟎鑑定的正確性，如已有分析數據表明，資料庫GenBank中的葉蟎分子序列大約30%存在鑑定錯誤；
2.PCR擴增後的ITS片段，需要經過純化、克隆、挑斑等步驟，成本較高，若待鑑定葉蟎數量較大，則載體、測序等成本非常高；3.克隆測序整個過程通常需要三天以上，若待鑑定葉蟎數量較大，則工作量巨大，所耗時間更長。
【發明內容】
`[0004]本發明的目的是針對現有技術的上述缺陷，提供一種能區分中國葉蟎屬常見種的PCR-RFLP鑑別方法，從而在分子水平上迅速高效準確的鑑定葉蟎物種。
[0005]一種中國葉蟎屬常見種的PCR-RFLP鑑定方法，包含以下步驟:
[0006]I)提取待鑑定葉蟎總DNA ；
[0007]2)使用葉蟎中擴增ITS的通用引物PCR擴增ITS序列；
[0008]3)將上述PCR產物作為酶切模板，分別使用Rsa 1、Mbo I1、HpyF31、Hinf 14種酶進行酶切反應，取酶切產物，進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下觀察並拍照記錄結果;
[0009]4)將待鑑定圖譜與標準酶切圖譜比對，通過比較酶切條帶的數量與位置從而確定待鑑定葉蟎的物種。
[0010]其中，所述的葉蟎中擴增ITS的通用引物選自SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2或者SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4。
[0011]所述PCR的反應體系如下:
[0012]
【權利要求】
1.一種中國葉蟎屬常見種的PCR-RFLP鑑定方法，其特徵在於包含以下步驟: 1)提取待鑑定葉蟎總DNA； 2)使用葉蟎中擴增ITS的通用引物PCR擴增ITS序列； 3)將上述PCR產物作為酶切模板，分別使用Rsa1、Mbo I1、HpyF31、Hinf 14種酶進行酶切反應，取酶切產物，進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下觀察並拍照記錄結果； 4)將待鑑定圖譜與標準酶切圖譜比對，通過比較酶切條帶的數量與位置從而確定待鑑定葉蟎的物種。
2.根據權利要求1所述的中國葉蟎屬常見種的PCR-RFLP鑑定方法，其特徵在於所述的葉蟎中擴增ITS的通用引物選自SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2或者SEQ ID N0.3和SEQID N0.4。
3.根據權利要求1所述的中國葉蟎屬常見種的PCR-RFLP鑑定方法，其特徵在於所述PCR的反應體系如下:
4.根據權利要求1所述的中國葉蟎屬常見種的PCR-RFLP鑑定方法，其特徵在於所述的PCR擴增後，取PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳後在凝膠成像系統下觀察並確認是否成功擴增出目的片段，目的片段作為下一步酶切反應的酶切模版。
5.根據權利要求1~4中任一項所述的中國葉蟎屬常見種的PCR-RFLP鑑定方法，其特徵在於所述的標準酶切圖譜是使用通過形態學進行分類鑑定或經測序分類鑑定的常見種葉蟎分別按照步驟I)~3)建立的電泳圖譜。
6.根據權利要求5所述的中國葉蟎屬常見種的PCR-RFLP鑑定方法，其特徵在於所述的常見種葉蟎包括二斑葉蟎綠色型、二斑葉蟎紅色型、截形葉蟎、神澤葉蟎、盧氏葉蟎、豆葉蟎、馬來葉蟎和皮氏葉蟎。
【文檔編號】C12Q1/68GK103805708SQ201410057235
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月20日 優先權日:2014年2月20日
【發明者】洪曉月, 葛成, 靳鵬宇 申請人:南京農業大學