卡拉黴素作為拓撲異構酶Ⅱ抑制劑的應用的製作方法
2023-10-04 14:21:54 3
專利名稱：卡拉黴素作為拓撲異構酶Ⅱ抑制劑的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥領域，具體涉及一種候選抗生素卡拉黴素作為拓撲異 構酶n抑制劑的應用。
背景技術：
目前，癌症已經成為嚴重的公共健康問題。世界癌症發病率與死亡率
均呈上升趨勢，尤其是20世紀70年代以來，癌症發病率以年均3%-5%的速 度遞增，癌症已經成為人類最主要的死亡原因。2006年，全球有760萬人 死於腫瘤，佔死亡總人數的13. 8%。在我國，癌症死亡率佔總死亡率的26%。 因此，抗腫瘤研究是當今生命科學和醫藥研究中極富挑戰且意義重大的領 域。世界衛生組織和包括我國在內的各國政府衛生機構都把攻克惡性腫瘤 作為一項首要的任務。腫瘤的化學治療是腫瘤治療的重要組成之一。細胞 毒類藥物依然是臨床應用中最重要的一類抗腫瘤藥物，在腫瘤化療中佔有 不可替代的地位，加強細胞毒類藥物的研究對於腫瘤的治療具有重要意義。 細胞毒類藥物主要通過幹擾細胞代謝或作用於細胞內生物大分子發揮抗腫 瘤作用，包括抗代謝藥、垸化劑、DNA拓撲異構酶(Topoisomerase， Topo ) 抑制劑等。臨床上治療腫瘤的藥物多數屬於這些靶點類藥物，因此，細胞 毒類藥物仍然是目前抗腫瘤藥物的研發重點領域，目的就是降低毒副作用 以及增加有效性，特別是針對那些尚未有效藥物治療的實體腫瘤和產生耐 藥性的腫瘤。
發明內容
本發明目的在於提供一種候選抗生素作為拓撲異構酶n抑制劑類抗腫 瘤藥物的新用途。
為實現上述目的，本發明釆用的技術方案為
卡拉黴素作為專一性拓撲異構酶ii抑制劑的應用。所述拓撲異構酶n
為真核生物中所必需的酶，在腫瘤細胞DNA複製和細胞分裂中起著重要作
用，是抗腫瘤藥物的重要作用靶點。卡拉黴素作為專一性拓撲異構酶n抑 製劑類抗腫瘤藥物的應用。
本發明所具有的優點
本發明候選抗生素化合物卡拉黴素(kalamycin)作為拓撲異構酶II抑 製劑類抗腫瘤藥物，其體外作用較目前臨床常用的拓撲異構酶II抑制劑 VP16強十倍左右。同時，卡拉黴素(kalamycin)分子量很小，只有300D,
易於透過細胞膜，易於吸收。
圖1為卡拉黴素對不同腫瘤細胞的I"值示意圖。圖2為kalamycin誘導HCT116阻滯於G2/M期示意圖。為了檢測 kalaraycin對HCT116細胞的周期效應，採用流式細胞計數儀，對kalamycin 處理後的肝癌細胞進行DNA含量分析。選擇l、 2和4pMkalamycin作用於 HCT116細胞24小時觀察量效學變化。從以上細胞周期時相分布可以看到， kalamycin的周期阻滯效應具有濃度依賴性。
圖3為kalamycin誘導S畫C-7721阻滯於G2/M期示意圖。kalamycin 誘導S薩C-7721阻滯於G2/M期。為了檢測kalamycin對SMMC-7721細胞的 周期效應，釆用流式細胞計數儀，對kalamycin處理後的肝癌細胞進行DNA 含量分析。選擇2、 4和8jiMkalamycin作用於S畫C-7721細胞24小時觀察 量效學變化。從以上細胞周期時相分布可以看到，kalamycin的周期阻滯效 應具有濃度依賴性。
圖4為kalamycin不抑制拓撲異構酶I介導的pBR322解螺旋示意圖。 (其中，泳道1為不加酶的對照，泳道2為加酶不加藥的對照，泳道7為 10|aM CPT的陽性對照，泳道3-6為反應體系中分別加入100、 50、 25、 12.5 jiM kalamycin。電泳結果表明(圖4 )，在不含酶時，大部分pBR322 以超螺旋狀態存在；而當反應體系中有Topo I存在時，在Topo I的作用 下，超螺旋DNA ( Supercoiled DNA )全部轉化為解旋的羅(relaxed DMA )。 我們在反應體系中加入10 pM Topo I抑制劑CPT後，pBR322的解旋受到 明顯的抑制，與僅有Topo I作用的泳道相比，超螺旋DNA的比例明顯增加， 表明Topo I的活性受到了抑制。然而kalamycin在100、 50、 25、 12.5 |i M劑量處理後，pBR322仍主要以解旋狀態存在，說明kalamycin對Topo I 沒有抑制作用。)
圖5為kalamycin抑制拓撲異構酶II介導的kDNA去連環示意圖。(其 中，泳道1為不加酶的對照，泳道2為加酶不加藥的對照，泳道3-9為反 應體系中分別加入50、 40、 30、 20、 10、 5、 2.5 juM kalamycin,泳道10 為反應體系中加入200 juMVP16作陽性對照。kDNA是一個巨大的DNA網狀
結構，不能在1%的瓊脂糖凝膠中遷移，因此電泳後仍滯留在加樣孔中。當 有Topo II存在時，在酶的作用下，kDNA的連環被打開，形成DNA小環 (minicircle)，於是能夠在瓊脂糖凝膠電泳中發生遷移，如圖5所示。當 反應體系中加入200 iuMVP16作用後，小環DNA幾乎全部消失，kDNA連環 未能被打破，因此仍滯留在上樣孔中(第10泳道)，說明Topo II的活性 受到抑制。同樣，在不同濃度kalamycin作用下，隨著濃度的增高，小環 DNA含量不斷減少，而上樣孔中DNA的量則不斷增加，表明TopoII的活性 受到了不同程度的抑制。10 |iM kalamycin對Topo II的活性已經產生顯 著影響；當kalamcin濃度增至20 |iM時，泳道中幾乎未見開環的小環DNA， 表明Topo II的催化活性大部分被抑制。其活性較VP16強十倍左右。)
具體實施例方式
實施例1: kalamycin細胞毒作用分析。
4接種一定數量的腫瘤細胞於96孔培養板，保證在整個試驗中細胞處於 對數生長期，並在藥物作用終止時對照組細胞的光密度(0D)約在1.0左 右。
採用磺醯羅丹明B蛋白染色法(SRB)測定kalamycin對細胞增殖的抑 製作用。根據細胞生長速率接種一定數量處於對數生長期的細胞於96孔培 養板中(見表l)。培養過夜後加入kalamycin,設置6個作用濃度梯度(10, 5， 2.5， 1.25， 0.6125， 0. 306 m mol/L )，每個濃度3復孔。作用72小 時後，傾去培養液(對於懸浮細胞，先3000 rpm離心10分鐘，再小心的 吸去培養液)，用預冷的10%三氯乙酸(TCA)在4 。C固定1小時，蒸餾 水洗滌5次，空氣中自然乾燥。然後每孔加入由1%冰醋酸配製的4 mg/mL 的SRB溶液lOOjal,室溫染色15分鐘，棄去染色液，1%醋酸洗滌5次，空 氣中自然乾燥。最後每孔加入150jal Tris溶液U0mMTris水溶液)，酶 標儀520 nm波長下測定吸光度OD值，按下列公式計算抑制率抑制率(％) =(OD對照-OD給藥)/ 0D對照x 100%。用軟體Sof tmax 2. 6 (Molecular Device)計算IC5。。實驗重複三次以上，計算平均值和標準差。根據各濃度 的抑制率，採用LOGIT法計算半數抑制濃度IC50。實驗重複3次，數據表 示為均值土SD。
選取9株人腫瘤細胞株(結腸癌細胞HCT-116、 口腔鱗癌細胞KB和乳腺 癌細胞MDA-MB-468來自美國ATCC、乳腺癌細胞MCF-7和卵巢癌細胞SK0V3 來自日本癌症研究基金會JFCR,肝癌細胞S醒C-7721和肝癌細胞Bel-7402 來自中科院上海生化細胞所、胃癌細胞SGC-7901和黑色素瘤A375來自中 科院上海藥物所)，kalamycin作用72h後，檢測其細胞毒作用。結果表明 它對不同組織來源的腫瘤細胞生長具有明顯的抑制作用，並呈現良好的劑 量依賴性。表明kalamycin抑制這些腫瘤細胞生長的靶點是廣泛存在於細 胞當中。kalamycin對9株腫瘤細胞株的I"平均值為2. 5 jiM(圖l)。 _表l.SRB檢測中不同腫瘤細胞的接種數量
細胞株 組織類型 接種個數(個/孔)
實施例2:流式細胞術檢測周期分布。
將處於對數生長期的HCT116和S醒C-7721細胞接種於6孔板中(5 x
SGC-7901 MDA-MB-468 MCF-7 SK0V3 KB
HCT-116 A375
SMMC-7721 Bel—7402
7000 8000 8000 8000 8000 5000 5000 綱O 綱O
癌 瘤
癌癌癌 癌t
癌^,l腔^色癌癌
胃乳乳卵口結黑肝肝105細胞/孔)，貼壁過夜，加入不同濃度的kalamycin處理(HCT116用1、 2、 4jumol/L，用下，SMC-7721用2、 4、 8|amol/L),對照孔中加入相應濃度的 DMS0。處理結東後，胰酶消化並收集細胞，4 。C 3000 rpm離心5 min。棄 上清，用冰冷的PBS重懸細胞，4 。C 3000 rpm離心5min,洗滌一次。加 入300 ju 1的PBS，將細胞混懸；然後緩慢加入預冷的無水乙醇700 ju 1 (邊 加邊渦旋)，-2(TC固定2 h; 1800 rpra離心3 min,棄上清；在沉澱中加 入500 nl含RNase(10 Mg/ml)的PBS,混勾，37。C水浴15 min。 然後， 加入IO jul PI終濃度為20 |ag/ml, 25。C避光染色30 min。用流式細胞 儀(FACSCalibur(TM), Becton Dickinson, USA)檢測細胞中DNA含量,每 組樣品至少分析lxl3個細胞。實驗結果用軟體CELLQUEST (Becton Dickinson, USA)和ModFIT LT處理(參見圖2和3)。 實施例3: kalamycin不抑制拓撲異構酶I 。
拓撲異構酶I介導的負超螺旋pBR322解旋反應基本步驟如下反應緩 衝體系包括10 mM Tris-Cl pH 7. 9， 50mMKCl， 50mMNaCl， 5mMMgC12, 0, lmMEDTA, 15 mg/ml牛血清白蛋白(BSA ), 0.25 ju g負超螺旋pBR322, lunitTopo I和相應濃度的待測化合物，37 。C水洛15分鐘進行解旋反應。 反應混合物中加入2 Ml 10% SDS終止反應，1 %瓊脂糖凝膠電泳1 h,電 泳緩衝液為1 xTAE(40mMTris鹼，40 mM醋酸，lmMEDTA),電壓4 V/cm。 0. 5 mg/ml溴化乙嚏染色15 min，凝膠成像分析儀300 nM透射紫外光觀察 並拍照。
拓撲異構酶I介導的pBR322解旋反應(參見圖4)。電泳結果表明在 不含酶時，大部分pBR322 (華美生物工程公司產品)以超螺旋狀態存在； 而當反應體系中有拓撲異構酶I (廣州中山大學提供)存在時，在拓撲異 構酶I的作用下，超螺旋DNA全部轉化為解旋的DNA。當在反應體系中加 入10 iaM拓撲異構酶I抑制劑CPT後，pBR322的解旋受到明顯的抑制， 與僅有Topo I作用的泳道相比，超螺旋DNA的比例明顯增加，表明拓撲異 構酶I的活性受到了抑制。然而kalamycin用12.5、 25、 50、 100juM劑 量處理後，pBR322仍主要以解旋狀態存在。提示kalamycin不是拓撲異構
酶I抑制劑。
實施例4: kalamycin強烈抑制拓撲異構酶n。
拓撲異構酶II活性可以通過ATP依賴的kDNA去連環實驗檢測。反應總 體積15 jul,含50 mMTris.HCl (pH 7.7), 50 mM KC1, 5 mM MgC12， 1 mM ATP， 0.5 mM DTT， 0.5 mM EDTA， 50 mg/ml BSA， 20 ng kDNA， 2 units拓 撲異構酶II和相應濃度的待測化合物。37 'C水浴lSmin後，加入l n 1 10% SDS終止反應。ly。瓊脂糖凝膠電泳lh，電泳緩衝液為1 xTAE (40mMTris 鹼，40 mM醋酸，lmMEDTA),電壓4 V/cm。 0. 5 mg/ml溴化乙啶染色15 min, 凝膠成像分析儀300 nM透射紫外光觀察並拍照。
釆用 一個拓撲異構酶II特異的催化反應-拓撲異構酶II介導的kDNA去連環作用，驗證kal呵cin能夠抑制拓撲異構酶II的催化活性。kDNA (美 國T叩oGEN〈Port Orange, FL， USA〉公司產品)是一個巨大的DNA網狀結構, 不能在1%的瓊脂糖凝膠中遷移，因此電泳後仍滯留在加樣孔中。當有拓撲 異構酶II (美國TopoGEN〈Port Orange, FL, USA〉公司產品)存在時，在酶 的作用下，kDNA的連環被打開，形成DNA小環(minicircle),於是能夠在 瓊脂糖凝膠電泳中發生遷移，如圖5所示。當反應體系中加入IOO yMVP16 作用後，小環DNA幾乎全部消失，kDNA連環未能被打破，因此仍滯留在上 樣孔中，說明Topo II的活性受到抑制。同樣，在不同濃度kalamycin作 用下(50、 40、 30、 20、 10、 5、 2. 5juM)，隨著濃度的增高，小環DNA含 量不斷減少，而上樣孔中DNA的量則不斷增加，表明拓撲異構酶II的活性 受到了不同程度的抑制。10 pM kalamycin對拓撲異構酶II的活性已經產 生顯著影響；當kalamycin濃度增至20 jaM時，泳道中幾乎未見開環的小 環DNA，表明拓撲異構酶II的催化活性大部分被抑制，這個效果強於VP16 在200 juM時的作用效果。可見kalamycin是一個很強的拓撲異構酶II。
從以上結果可以看出，kalamycin有較強的細胞毒作用，它可以把腫瘤 細胞抑制在G2/M期，從而使腫瘤生長抑制和凋亡。通過靶點分析，證明它 是一個很強的拓撲異構酶II抑制劑，比臨床上常用的拓撲異構酶II抑制劑 VP16強十倍左右，可以作為一個拓撲異構酶II抑制劑類抗腫瘤藥物應用。 可將kalamycin溶於橄欖油、茶油、芝麻油、大豆油等脂溶性溶劑，製成 注射劑，或把kalamycin混入澱粉等填料，製成口服劑型抗腫瘤藥物。
權利要求
1. 一種卡拉黴素作為專一性拓撲異構酶II抑制劑的應用。
2. 按權利要求i所述的卡拉黴素作為專一性拓撲異構酶n抑制劑的應 用，其特徵在於所述拓撲異構酶n為真核生物中所必需的酶，在腫瘤細胞DNA複製和細胞分裂中起著重要作用，是抗腫瘤藥物的重要作用靶點。
3. 按權利要求i所述的卡拉黴素作為專一性拓撲異構酶n抑制劑的應用，其特徵在於卡拉黴素作為專一性拓撲異構酶II抑制劑類抗腫瘤藥物 的應用。
全文摘要
本發明屬於醫藥領域，具體涉及一種候選抗生素卡拉黴素作為拓撲異構酶II抑制劑的應用。卡拉黴素作為專一性拓撲異構酶II抑制劑的應用。卡拉黴素是作為一種抗生素進行開發利用，其可以作為一種拓撲異構酶II抑制劑類抗腫瘤藥物，它不抑制拓撲異構酶I，是一種專一性的拓撲異構酶II抑制劑，其體外抑制拓撲異構酶II抑制劑的效果較VP16強十倍左右。本發明發現一種化合物作為新的拓撲異構酶II抑制劑類抗腫瘤藥物的應用，藥效較目前常用的拓撲異構酶II抑制劑強，可應用於醫藥工業。
文檔編號A61K31/365GK101480388SQ200910013989
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月23日 優先權日2009年1月23日
發明者健 丁, 玲 丁, 張偉傑, 李富超, 林麗萍, 松 秦 申請人:中國科學院海洋研究所