一種人乙醯膽鹼酯酶異構體蛋白(ar－ache)及基因編碼序列的製作方法

2024-03-10 12:35:15 2

專利名稱:一種人乙醯膽鹼酯酶異構體蛋白(ar－ache)及基因編碼序列的製作方法
本發明涉及酶學和分子細胞生物學，尤其是關於參與細胞凋亡過程中的酶。具體地，本發明涉及一種人類各組織細胞在發生細胞凋亡時表達的乙醯膽鹼酯酶異構體蛋白(AR-ACHE)及其核酸序列。
乙醯膽鹼酯酶(EC 3.1.17，acetylcholinesterase，ACHE)是神經遞質乙醯膽鹼的水解酶，屬於糖蛋白。主要存在於電鰩的電器官、哺乳動物的膽鹼能神經、神經-肌接頭、紅細胞膜(Zakut-H；et alJ-Clin-Invest.1990，86(3)900-8)以及齧齒動物的巨核細胞血小板中(A.Shafferman and B.Velan，Multidisplinary approaches to cholinesterase functions.1992 Plenum Press，New York)。
人的乙醯膽鹼酯酶基因位於7號染色體上(7q22)，目前發現有3種不同的剪切形式神經肌肉型、紅細胞型和通讀型(Soreq，H.et al.Proc Natl AcadSci U S A.1990，87，9688-92；Soreq，H.et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1994，91，7907-11)。乙醯膽鹼酯酶在膽鹼能神經系統的功能是水解神經遞質乙醯膽鹼，使之生成膽鹼和乙酸。紅細胞型和通讀型的功能不清楚，也有報導認為乙醯膽鹼酯酶具有絲氨酸蛋白酶的水解蛋白活性.。近年來，由於體外培養的腫瘤細胞株也檢測到AChE mRNA的轉錄和化療後的卵巢癌患者的血清檢測到乙醯膽鹼酯酶活性，有作者認為乙醯膽鹼酯酶與腫瘤發生有關(Lev-Lehman-E，et alBlood.1997，89(10)3644-53)。
老年性痴呆(AD)是退行神經性中較多見的疾病。雖然AD病人腦中的總ACHE活性是降低的，但在老年斑中和老年斑周圍的ACHE活性卻是升高的(Javier Saez-Valero et al.，J.Neurochem.1999，Vol.72，1600-1608；Opazo-G Inestrosa-NC，Mol-Chem-Neuropathol.1998，33(1)39-49；MimoriY.et al.，Behav Brain Res.1997，83(1-2)25-30.)，而且，與神經遞質降解功能無關。已經證明發現老年性痴呆患者病灶處有凋亡細胞存在，在長期研究細胞凋亡過程中，發現哺乳動物包括人類的一切細胞株，除了紅細胞外，經過誘導，啟動凋亡過程中表達乙醯膽鹼酯酶異構體，這個結果可以很好注釋上述現象。我們已經申請了該類酶的獲得方法(張學軍等，中國專利申請號97 1 25216.5，發明專利證書第61260號)和部分功能(張學軍等，中國專利申請號97 1 25220.3，公開號CN 1186859)的專利。本發明採用RACE等方法，獲得了AR-ACHE的cDNA全序列。
本發明的第一目的就是提供一種新的人基因乙醯膽鹼酯酶異構體(AR-ACHE)(Genbank Accession No.AF334270未公開)，該基因是一個人乙醯膽鹼酯酶異構體(AR-ACHE)蛋白基因。
本發明的第二目的是提供一種利用重組技術生產上述的新的人乙醯膽鹼酯酶異構體(AR-ACHE)蛋白和核酸序列的方法。
本發明還提供了這種人乙醯膽鹼酯酶異構體(AR-ACHE)蛋白多肽和編碼序列的應用。
本發明使用了體外培養的SK-N-SH，人肺成纖維細胞(HLF)、K562等細胞株，用DMEM，1640培養基，添加10％小牛血清，在37℃，5％CO2，培養箱培養。誘導細胞凋亡方法有3種自然衰老法，UV-B和化療藥物誘導法。自然衰老法，培養細胞，3-4天不換培養液，這時，貼壁生長的細胞，部分失去貼壁能力，進入了凋亡過程，收集這時的細胞。藥物誘導法用抗腫瘤藥物或低血清或去細胞因子等方法誘導細胞凋亡。對於細胞因子依賴的細胞株，入M07e巨核細胞株，只要在培養液中不加入GM-CSF，2-3天後，大量細胞發生凋亡，收集這時的細胞。UV-B誘導10分鐘，培養18小時後可收集凋亡細胞。全過程的具體操作如下總RNA提取將SK-N-SH細胞，HLF或K562在1640培養基中(Gibco BRL公司)於不換液的條件下培養至細胞凋外亡狀態，然後用Trizol試劑(Gibco BRL公司)提取細胞總RNA。約106細胞加入1ml Trizol，吹打均勻後室溫放置5分鐘，加入0.2ml氯仿，劇烈搖動15秒，室溫放置3分鐘。然後4℃ 12000g離心15分鐘，吸出上層無色水相，加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃ 12000g離心10分鐘。再用75％乙醇洗沉澱，7500g，4℃離心5分鐘。待乾燥後溶於DEPC處理過的水中，-70℃保存備用。
mRNA的分離先將總RNA定量，再使用Qiagen公司的Oligotex mini mRNA Kit按Kit的產品操作手冊分離mRNA，溶於DEPC處理過的水中，-70℃保存備用。
基因的全長克隆(1)RT-PCR根據人類ACHE基因的序列，設計5′和3′引物，引物序列為R1(SEQ IDNo.3)5′-cttccacggcctgcagctggct-3′，(正向)，R2(SEQ ID No.4)5′-gacaagcttacaggtctgagcagcgatcctgcttgct-3′(反向)，採用常規方法合成上述引物。用SK-N-SH細胞的mRNA進行RT-PCR擴增。條件為96℃ 3分鐘後，以95℃ 30秒，72℃ 2分鐘做5個循環，再以95℃ 30秒，70℃ 30秒，72℃ 1分鐘做39個循環，最後72℃延伸10分鐘，電泳檢測PCR產物為527bp長度，將產物克隆測序，發現存在一種與人類正常ACHE基因不同的拼接形式。
(2)cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)根據已經測得的序列，設計5′和3′引物，用SK-N-SH細胞mRNA的RT產物分別擴增上遊和下遊序列，將PCR產物克隆測序。
通過使用以上兩種方法，獲得了人類AR-ACHE的全長(見SEQ IDNo.1)。
人AR-ACHE基因的序列信息與同源性分析本發明新的人AR-ACHE全長cDNA(GenBank AccessionNo.AF334270)的長度為1936bp；其中開放讀框位於106-1686位核苷酸(見SEQ ID No.1)。根據全長cDNA推導出人AR-ACHE的胺基酸序列，共526個胺基酸殘基(見SEQ ID No.2)，分子量58352.30D，PI為6.44.將AR-ACHE的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR資料庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與人的ACHE基因至少存在85.7％的同源性。但AR-ACHE是一種人ACHE基因的異常拼接形式基因。在核苷酸水平上，它是人ACHE基因的mRNA全編碼序列(GenBank Accession No.M.55040)在Exon3中從第一到第264個鹼基發生缺失後形成的一種拼接體。在胺基酸水平上，它是人ACHE蛋白(GenProt Accession No.AAA68151)的第357-444位胺基酸殘基缺失後形成的一種新的拼接體蛋白(見圖1)。
本發明的人AR-ACHE除了可作為該家族一員用於進一步的功能研究，還可用於與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發明的人AR-ACHE還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。例如將本發明的人AR-ACHE蛋白的N端與人ACHE蛋白的N端進行交換，以產生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發明人AR-ACHE的抗體，用於篩選該家族的其他成員，或者用於親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發明人AR-ACHE核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人AR-ACHE的表達水平或者抑制人AR-ACHE的過度表達。本發明的人AR-ACHE蛋白或其活性多肽片段可以施用於腫瘤病人，以治療或減輕因人AR-ACHE缺失、無功能或異常而導致的有關病症。此外，還可以用基於本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預後判斷。根據人的乙醯膽鹼酯酶的cDNA序列表達的人AR-ACHE蛋白質，並利用此蛋白質產生的多克隆抗體和單克隆抗體，使用此多克隆或單克隆抗體可以特異性地和AR-ACHE結合，因此在與AR-ACHE產生有關的各種疾病中可以特異性地檢測到此蛋白質的存在，亦可在疾病早期或愈後檢測蛋白質的存在。
由於本發明的人AR-ACHE蛋白具有源自人的天然胺基酸序列，因此，與來源於其他物種的同族蛋白相比，預計在施用於人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內的免疫原性更低或沒有)。
人AR-ACHE多肽的製備和提純在該實施例中，將全長的人AR-ACHE編碼序列或片段構建入商品化的蛋白質融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。
將人AR-ACHE多肽以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進行原核表達。原核表達載體的構建，以及轉化大腸桿菌。根據人AR-ACHE的全長編碼序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應於編碼序列5′和3′端的約20個以上核苷酸)，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這根據選用的pGEX-2T載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的產物為模板，經PCR擴增後，將人AR-ACHE基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑑定好的表達載體利用CaCl2方法轉入大腸桿菌DH5-α，篩選鑑定得到含有pGEX-2T-AR-ACHE表達載體的工程菌DH5-α-pGEX-2T-AR-ACHE。
表達GST-AR-ACHE重組蛋白的工程菌的分離鑑定挑取單菌落的工程菌DH5-α-pGEX-2T-AR-ACHE於3ml含100μg/ml氨卞青黴素的LB培養基中振搖培養過夜，按1∶100的濃度吸取培養液於新的LB培養基(含100μg/ml氨卞青黴素)中培養約3小時，至OD 600達0.5後，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續於37℃分別培養0，1，2，3小時。取培養時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉澱物中加入裂解液(2XSDS上樣緩衝液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉澱，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色後觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達GST-AR-ACHE融合蛋白的工程菌。
GST-AR-ACHE融合蛋白的提取純化按上述方法誘導表達GST-AR-ACHE融合表達蛋白的工程菌DH5-α-pGEX-2T-AR-ACHE誘導後的細菌離心沉澱，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細菌，超聲破碎細菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％穀胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉澱結合了GST-AR-ACHE的穀胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升起聲液所得沉澱加入100μl PBS的量清洗兩次，而後按每毫升超聲液所得沉澱加入10μl還原型穀胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重複洗脫兩次。洗脫的上清保存於-80℃，並進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在58kDa處的蛋白質條帶即為人AR-ACHE蛋白(見圖2)。
人的乙醯膽鹼酯酶基因位於7號染色體上(7q22)，目前發現有3種不同的剪切形式神經肌肉型、紅細胞型和通讀型。本發明是克隆到乙醯膽鹼酯酶的異構體(AR-ACHE)。使乙醯膽鹼酯酶有了第4種類型。它在人任何有核細胞凋亡時表達，在細胞凋亡中起重要作用，為治療AD等退行病的藥物設計，和腫瘤藥物設計提供新思路和方法，在世界上都是首次。
本發明具有如下優點1.利用AR-ACHE作為該乙醯膽鹼酯酶家族的一員可用於進一步功能研究。
2. AR-ACHE可與該家族其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白，可望獲得活性更高並具有新特性蛋白。
3.本發明AR-ACHE核酸可被引入細胞，以提高人AR-ACHE的表達水平或抑制人AR-ACHE的過度表達。
4.為治療AD等病的藥物設計和腫瘤藥物設計提供新思路和方法。



圖1，AR-ACHE與人腦型ACHE胺基酸序列比較，AR-ACHE少88個胺基酸殘基。
圖2. SDS-PAGE電泳，Western blot，ECL染色。1 lane是凋亡SK-N-SH細胞裂解樣品；2 lane是正常SK-N-SH細胞裂解樣品。正常SK-N-SH細胞表達腦型乙醯膽鹼酯酶，其單體分子量約65Kda；凋亡SK-N-SH細胞表達的AR-ACHE單體分子量小於58Kda。
本發明通過以下的附圖和實施例作進一步闡述，但並不限止本發明的範圍。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人的《分子克隆》實驗室手冊(NeW YorkCold Sprng Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例11.總RNA提取；將SK-N-SH細胞在1640培養基中(Gibco BRL公司)於不換液的條件下培養至細胞凋外亡狀態，然後用Trizol試劑(Gibco BRL公司)提取細胞總RNA。約106細胞加入1ml Trizol，吹打均勻後室溫放置5分鐘，加入0.2ml氯仿，劇烈搖動15秒，室溫放置3分鐘。然後4℃12000g離心15分鐘，吸出上層無色水相，加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃12000g離心10分鐘。再用75％乙醇洗沉澱，7500g，4℃離心5分鐘。待乾燥後溶於DEPC處理過的水中，-70℃保存備用。
mRNA的分離先將總RNA定量，再使用Qiagen公司的Oligotex mini mRNA Kit按Kit產品的操作手冊分離mRNA，溶於DEPC處理過的水中，-70℃保存備用。
2.基因的全長克隆(1).RT-PCR根據人類ACHE基因的序列，設計5′和3′引物，引物序列為R1(SEQ IDNo.3)5′-cttccacggcctgcagctggct-3′，(正向)，R2(SEQ ID No.4)5′-gacaagcttacaggtctgagcagcgatcctgcttgct-3′(反向)。用SK-N-SH細胞的mRNA進行RT-PCR擴增。條件為96℃ 3分鐘後，以95℃30秒，72℃ 2分鐘做5個循環，再以95℃ 30秒，70℃ 30秒，72℃ 1分鐘做39個循環，最後72℃延伸10分鐘，電泳檢測PCR產物為527bp長度，將產物克隆測序，發現存在一種與人類正常ACHE基因不同的拼接形式。
(2).cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)根據已經測得的序列，設計5』和3』引物，用SK-N-SH細胞mRNA的RT產物分別擴增上遊和下遊序列，將PCR產物克隆測序。通過使用以上兩種方法，獲得了人類AR-ACHE的全長(見SEQ ID No.1)。
實施例2 人AR-ACHE基因的序列信息與同源性分析本發明新的人AR-ACHE全長cDNA(GenBank AccessionNo.AF334270)的長度為1936bp；其中開放讀框位於106-1686位核苷酸。根據全長cDNA推導出人AR-ACHE的胺基酸序列，共526個胺基酸殘基(見SEQ ID No.2)，分子量58352.30 D，PI為6.44.將AR-ACHE的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR資料庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與人的ACHE基因至少存在85.7％的同源性。但AR-ACHE是一種人ACHE基因的異常拼接形式基因。在核苷酸水平上，它是人ACHE基因的mRNA全編碼序列(GenBank Accession No.M.55040)在Exon3中從第一到第264個鹼基發生缺失後形成的一種拼接體。在胺基酸水平上，它是人ACHE蛋白(GenProt Accession No.AAA68151)的第357-444位胺基酸殘基缺失後形成的一種新的拼接體蛋白(見圖1)。
本發明的人AR-ACHE除了可作為該家族一員用於進一步的功能研究，還可用於與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發明的人AR-ACHE還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。例如將本發明的人AR-ACHE蛋白的N端與人ACHE蛋白的N端進行交換，以產生新的活性更高或具有新特性的蛋白。針對本發明人AR-ACHE的抗體，用於篩選該家族的其他成員，或者用於親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發明人AR-ACHE核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人AR-ACHE的表達水平或者抑制人AR-ACHE的過度表達。本發明的人AR-ACHE蛋白或其活性多肽片段可以施用於病人，以治療或減輕因人AR-ACHE缺失、無功能或異常而導致的有關病症。此外，還可以用基於本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預後判斷。
由於本發明的人AR-ACHE蛋白具有源自人的天然胺基酸序列，因此，與來源於其他物種的同族蛋白相比，預計在施用於人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內的免疫原性更低或沒有)。
實施例3人AR-ACHE蛋白的結構和功能研究1.將人AR-ACHE蛋白的胺基酸序列輸入資料庫，並且利用資料庫的軟體分析比較(網址為http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到以下結果1)我們輸入的胺基酸序列1 MRPPQCLLHTPSLASPLLLLLLWLLGGGVGAEGREDAELLVTVRGGRLRGIRLKTPGGPV61 SAFLGIPFAEPPMGPRRFLPPEPKQPWSGVVDATTFQSVCYQYVDTLYPGFEGTEMWNPN121 RELSEDCLYLNVWTPYPRPTSPTPVLVWIYGGGFYSGASSLDVYDGRFLVQAERTVLVSM181 NYRVGAFGFLALPGSREAPGNVGLLDQRLALQWVQENVAAFGGDPTSVTLFGESAGAASV241 GMHLLSPPSRGLFHRAVLQSGAPNGPWATVGMGEARRRATQLAHLVGCPPGGTGGNDTEL301 VACLRTRPAQVLVNHEWHVLPQESVFRFSFVPVVDGDFLSDTPEALINAGDFHGLQLAGR361 LAAQGARVYAYVFEHRASTLSWPLWMGVPHGYEIEFIFGIPLDPSRNYTAEEKIFAQRLM421 RYWANFARTGDPNEPRDPKAPQWPPYTAGAQQYVSLDLRPLEVRRGLRAQACAFWNRFLP481 KLLSATDTLDEAERQWKAEFHRWSSYMVHWKNQFDHYSKQDRCSDL2)分析後的結果processing.
QueryIDUNKNOW為本發明序列QueryLength長度526aaMost Probable ProSite Patterns最可能的作用位點模式PS00122 CARBOXYLESTERASE_B_1羧酸酯酶B1型EC3。1。1。1PS00941 CARBOXYLESTERASE_B_2羧酸酯酶B2型EC3。1。1。7PS00014 ER_TARGETGLOBAL MOTIF BKID KLEN BLAST SKID ％IDN RATIO PSFLAG9.0 10.0 ACES_HUMAN 614 0.0 ACES_HUMAN 85.7 1.17 T-PS001229.0 10.0 ACES_HUMAN 614 0.0 ACES_HUMAN 85.7 1.17 T-PS009416.5 0.0 EST4_RAT 561 1e-46 EST4_RAT 32.6 1.06 ？-PS000143)Most Probable PIR Superfamilies最可能的大家族SFA00837 cholinesterase膽鹼酯酶SFA01749 thyroglobulinSFA05547 juvenile-hormone esteraseSFA00831 triacylglycerol lipaseGL0BAL BKID KLEN BSF# BLAST SKID SSF# ％IDN RATIO9.0 ACES_HUMAN 614 SFA00837 0.0 ACES_HUMAN SFA00837 85.7 1.176.5 THYG_BOVIN 2769 SFA01749 2e-44 THYG_BOVIN SFA01749 31.9 1.035.0 ESTJ_HELVI 564 SFA05547 8e-40 ESTJ_HELVI SFA05547 34.7 0.605.0 LIP2_CANRU 548 SFA00831 8e-38 LIP2_CANRU SFA00831 36.7 0.604)ProSite Pattern Match and Clustal W Multiple Motif Alignment匹配多位點如下AC PS00122ID CARBOXYLESTERASE_B_1；PATTERN.DE Carboxylesterases type-B serine active site.PA F-[GR]-G-x(4)-[LIVN]-x-[LIV]-x-G-x-S-[STAG]-GACES_BOVIN+S10712 PST 190 FGGDPTSVTLFGESAGACES_HUMAN+A39256 PST 221 FGGDPTSVTLFGESAGQueryID GFT 221 FGGDPTSVTLFGESAGACES_RAT+JH0811 PST 221 FGGDPMSVTLFGESAGLIP2_CANRU+S32615 PST 210 FGGDPSKVTIYGESAGESTJ_HELVI+A34325 PST 207 FGGDPSDITIAGQSAG***** .:*: *:***5)膽鹼酯酶類似位點AC PS00941ID CARBOXYLESTERASE_B_2；PATTEPN.DE Carboxylesterases type-B signature 2.PA [ED]-D-C-L-[YT]-[LIV]-[DNS]-[LIV]-[LIVFYW]-x-[PQR]
ACES_HUMAN+A39256 PST 125 EDCLYLNVWTPACES_MOUSE+JH0314 PST 125 EDCLYLNVWTPACES_RAT+JH0811 PST 125 EDCLYLNVWTPQueryID GFT 125 EDCLYLNVWTPLIP2_CANRU+S32615 PST 109 EDCLTINVIRPTHYG_BOVIN+UIB0 PST 2280 EDCLYLNVFVPESTJ_HELVI+A34325 PSn 107 EACIYANIHVP*: *: *實施例4人AR-ACHE多肽的製備和提純將全長的人AR-ACHE編碼序列或片段構建入商品化的蛋白質融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。
1.將人AR-ACHE多肽以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進行原核表達。原核表達載體的構建，以及轉化大腸桿菌根據人AR-ACHE的全長編碼序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應於編碼序列5』和3』端的約2O個以上核苷酸)，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這根據選用的pGEX-2T載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的產物為模板，經PCR擴增後，將人AR-ACHE基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑑定好的表達載體利用CaCl2方法轉入大腸桿菌DH5-α，篩選鑑定得到含有pGEX-2T-AR-ACHE表達載體的工程菌DH5-α-pGEX-2T-AR-ACHE。
表達GST-AR-ACHE重組蛋白的工程菌的分離鑑定挑取單菌落的工程菌DH5-α-pGEX-2T-AR-ACHE於3ml含100μg/ml氨卞青黴素的LB培養基中振搖培養過夜，按1∶100的濃度吸取培養液於新的LB培養基(含100μg/ml氨卞青黴素)中培養約3小時，至OD 600達0.5後，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續於37℃分別培養0，1，2，3小時。取培養時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉澱物中加入裂解液(2XSDS上樣緩衝液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉澱，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色後觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達GST-AR-ACHE融合蛋白的工程菌。
GST-AR-ACHE融合蛋白的提取純化按上述方法誘導表達GST-AR-ACHE融合表達蛋白的工程菌DHS-α-pGEX-2T-AR-ACHE誘導後的細菌離心沉澱，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細菌，超聲破碎細菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％穀胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉澱結合了GST-AR-ACHE的穀胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升起聲液所得沉澱加入100μl PBS的量清洗兩次，而後按每毫升超聲液所得沉澱加入10ul還原型穀胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重複洗脫兩次。洗脫的上清保存於-80℃，並進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在58kDa處的蛋白質條帶即為人AR-ACHE蛋白(見圖2)。
序列表(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特徵(A)長度1936bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO.1SequenceNewSequence1 CAGAGTCGGC TCAGCCTGCG CCGGGGAACA TCGGCCGCCT CCAGCTCCCG GCGCGGCCCG GCCCGGCCCG71 GCTCGGCCGC CTCAGACGCC GCCTGCCCTG CAGCCATGAG GCCCCCGCAG TGTCTGCTGC ACACGCCTTC141 CCTGGCTTCC CCACTCCTTC TCCTCCTCCT CTGGCTCCTG GGTGGAGGAG TGGGGGCTGA GGGCCGGGAG211 GATGCAGAGC TGCTGGTGAC GGTGCGTGGG GGCCGGCTGC GGGGCATTCG CCTGAAGACC CCCGGGGGCC281 CTGTCTCTGC TTTCCTGGGC ATCCCCTTTG CGGAGCCACC CATGGGACCC CGTCGCTTTC TGCCACCGGA351 GCCCAAGCAG CCTTGGTCAG GGGTGGTAGA CGCTACAACC TTCCAGAGTG TCTGCTACCA ATATGTGGAC421 ACCCTATACC CAGGTTTTGA GGGCACCGAG ATGTGGAACC CCAACCGTGA GCTGAGCGAG GACTGCCTGT491 ACCTCAACGT GTGGACACCA TACCCCCGGC CTACATCCCC CACCCCTGTC CTCGTCTGGA TCTATGGGGG561 TGGCTTCTAC AGTGGGGCCT CCTCCTTGGA CGTGTACGAT GGCCGCTTCT TGGTACAGGC CGAGAGGACT631 GTGCTGGTGT CCATGAACTA CCGGGTGGGA GCCTTTGGCT TCCTGGCCCT GCCGGGGAGC CGAGAGGCCC701 CGGGCAATGT GGGTCTCCTG GATCAGAGGC TGGCCCTGCA GTGGGTGCAG GAGAACGTGG CAGCCTTCGG771 GGGTGACCCG ACATCAGTGA CGCTGTTTGG GGAGAGCGCG GGAGCCGCCT CGGTGGGCAT GCACCTGCTG841 TCCCCGCCCA GCCGGGGCCT GTTCCACAGG GCCGTGCTGC AGAGCGGTGC CCCCAATGGA CCCTGGGCCA911 CGGTGGGCAT GGGAGAGGCC CGTCGCAGGG CCACGCAGCT GGCCCACCTT GTGGGCTGTC CTCCAGGCGG981 CACTGGTGGG AATGACACAG AGCTGGTAGC CTGCCTTCGG ACACGACCAG CGCAGGTCCT GGTGAACCAC1051 GAATGGCACG TGCTGCCTCA AGAAAGCGTC TTCCGGTTCT CCTTCGTGCC TGTGGTAGAT GGAGACTTCC1121 TCAGTGACAC CCCAGAGGCC CTCATCAACG CGGGAGACTT CCACGGCCTG CAGCTGGCTG GGCGACTGGC1191 TGCCCAGGGT GCCCGGGTCT ACGCCTACGT CTTTGAACAC CGTGCTTCCA CGCTCTCCTG GCCCCTGTGG1261 ATGGGGGTGC CCCACGGCTA CGAGATCGAG TTCATCTTTG GGATCCCCCT GGACCCCTCT CGAAACTACA1331 CGGCAGAGGA GAAAATCTTC GCCCAGCGAC TGATGCGATA CTGGGCCAAC TTTGCCCGCA CAGGGGATCC1401 CAATGAGCCC CGAGACCCCA AGGCCCCACA ATGGCCCCCG TACACGGCGG GGGCTCAGCA GTACGTTAGT1471 CTGGACCTGC GGCCGCTGGA GGTGCGGCGG GGGCTGCGCG CCCAGGCCTG CGCCTTCTGG AACCGCTTCC1541 TCCCCAAATT GCTCAGCGCC ACCGACACGC TCGACGAGGC GGAGCGCCAG TGGAAGGCCG AGTTCCACCG1611 CTGGAGCTCC TACATGGTGC ACTGGAAGAA CCAGTTCGAC CACTACAGCA AGCAGGATCG CTGCTCAGAC1681 CTGTGACCCC GGCGGGACCC CCATGTCCTC CGCTCCGCCC GGCCCCCTAG CTGTATATAC TATTTATTTC1751 AGGGCTGGGC TATAACACAG ACGAGCCCCA GACTCTGCCC ATCCCCACCC CACCCCGACG TCCCCCGGGG1821 CTCCCGGTCC TCTGGCATGT CTTCAGGCTG AGGTCCTCCC CGCGTGCCTT CGCCCTCTGG CTGCAAATAA1891 ACTGTTACAG GCCAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特徵(A)長度526aa(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型多肽(iii)序列描述SEQ ID NO.21 MRPPQCLLHTPSLASPLLLLLLWLLGGGVGAEGREDAELLVTVRGGRLRGIRLKTPGGPV61 SAFLGIPFAEPPMGPRRFLPPEPKQPWSGVVDATTFQSVCYQYVDTLYPGFEGTEMWNPN121 RELSEDCLYLNVWTPYPRPTSPTPVLVWIYGGGFYSGASSLDVYDGRFLVQAERTVLVSM181 NYRVGAFGFLALPGSREAPGNVGLLDQRLALQWVQENVAAFGGDPTSVTLFGESAGAASV241 GMHLLSPPSRGLFHRAVLQSGAPNGPWATVGMGEARRRATQLAHLVGCPPGGTGGNDTEL301 VACLRTRPAQVLVNHEWHVLPQESVFRFSFVPVVDGDFLSDTPEALINAGDFHGLQLAGR361 LAAQGARVYAYVFEHRASTLSWPLWMGVPHGYEIEFIFGIPLDPSRNYTAEEKIFAQRLM421 RYWANFARTGDPNEPRDPKAPQWPPYTAGAQQYVSLDLRPLEVRRGLRAQACAFWNRFLP481 KLLSATDTLDEAERQWKAEFHRWSSYMVHWKNQFDHYSKQDRCSDL(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特徵(A)長度22bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.35′-cttccacggcctgcagctggct-3′(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特徵(A)長度37bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.45′-gacaagcttacaggtctgagcagcgatcctgcttgct-3′
權利要求
1.一種分離出的人乙醯膽鹼酯酶的DNA分子，其特徵在於，它包括有SEQ ID No.1所示的cDNA序列的人乙醯膽鹼酯酶異構體。
2.根據權利要求
1所述的人乙醯膽鹼酯酶的DNA分子，其特徵在於，所述人乙醯膽鹼酯酶異構體的cDNA與人的乙醯膽鹼酯酶所示cDNA序列至少85.7％的同源性，且為人ACHE基因Exon3中從第一到第264鹼基缺失所形成的新的乙醯膽鹼酯酶DNA分子。
3.根據權利要求
1所述的人乙醯膽鹼酯酶的DNA分子，其特徵在於它包含有SEQ ID No.2所示的多肽胺基酸序列的人乙醯膽鹼酯酶異構體蛋白多肽。
4.一種產生具有人乙醯膽鹼酯酶異構體(AR-ACHE)蛋白質的方法，特徵在於它的步驟如下；(1)將編碼具有人乙醯膽鹼酯酶異構體(AR-ACHE)蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成人乙醯膽鹼酯酶異構體(AR-ACHE)蛋白表達載體；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入宿主細胞，形成乙醯膽鹼酯酶異構體(AR-ACHE)蛋白的重組細胞；(3)在適合表達人乙醯膽鹼酯酶異構體(AR-ACHE)蛋白多肽的條件下，培養步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出具有人乙醯膽鹼酯酶異構體(AR-ACHE)蛋白活性的多肽。
5.根據權利要求
4所述的人乙醯膽鹼酯酶異構體(AR-ACHE)蛋白質的方法，其特徵在於根據人AR-ACHE的全長編碼序列，設計擴增出完整編碼閱讀框引物，在正反引物上分別引入限制性內切酶位點，以擴增產物為模板，經PCR擴增後將人AR-ACHE基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至PGEX-2T載體。
6.一種包含SEQ ID No.1所示的cDNA序列的人乙醯膽鹼酯酶異構體的應用，其特徵在於根據SEQ ID No.1的cDNA序列表達的人AR-ACHE蛋白質，並利用此蛋白質產生的多克隆抗體和單克隆抗體，使用此多克隆或單克隆抗體可以特異性地和AR-ACHE結合，因此在與AR-ACHE產生有關的各種疾病中可以特異性地檢測到此蛋白質的存在，亦可在疾病早期或愈後檢測蛋白質的存在。
7.根據權利要求
6所述包含SEQ ID No.1所示cDNA序列的人乙醯膽鹼酯酶異構體應用，其特徵在於應用於提高人AR-ACHE的表達水平或抑制人AR-ACHE的過度表達。
8.根據權利要求
6所述包含SEQ ID No.1所示cDNA序列的人乙醯膽鹼酯酶異構體應用，其特徵在於利用AR-ACHE與該家族其他成員進行融合或交換片段，獲得活性更高並具有新特性的蛋白。
專利摘要
本發明提供了一種人各種組織細胞發生凋亡時表達的新的人乙醯膽鹼酯酶異構體蛋白(AR－ACHE)及基因編碼序列。它的cDNA長度為1936bp,蛋白質由526個胺基酸殘基組成。本發明還提供了該蛋白和核酸序列的製備方法、在樣品中檢測人乙醯膽鹼酯酶異構體蛋白(AR－AChE)核酸序列和多肽的方法以及用該蛋白質或基因促使細胞凋亡,或者用該基因反義核酸或抗體阻止細胞凋亡的方法。
文檔編號C12N15/55GKCN1376798SQ01105781
公開日2002年10月30日 申請日期2001年3月23日
發明者張學軍, 楊磊, 賀恆益 申請人:中國科學院上海細胞生物學研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan