選擇性產生雄性或雌性不育植物的方法
2023-10-09 07:23:59 1
專利名稱：選擇性產生雄性或雌性不育植物的方法
作物中的雜種優勢可具有顯著的提高產量的效應。通常，與非雜交品種相比，雜種表現出增加的產量。雜種通常給生長因素例如水和肥料以更高的回報單位。雜種通常提供更優的逆境耐受性、在產量和成熟上的一致性，並且也提供簡單的將以其它方法可能難以組合的特徵或性狀組合起來的育種機會。植物中的雜種優勢通常大到足以保證商業利用。商用雜種被廣泛地應用於許多作物中，包括玉米、高梁、甜菜、向日葵和油菜(canola)。然而，主要由於缺乏經濟的雜交種子生產方法，小麥、大麥和水稻仍然主要以近親交配繁育。
常規上，雜交種子的生產包括分區種植雌性和雄性親本系並且只能從雌性親本收穫種子。為確保該種子是雜種，必需通過使雌性系產生雄性不育從而將雌性親本的自體受粉減少到最小。用於使雌性親本系雄性不育的方法包括機械的、化學的和遺傳的方法。在雌雄異體的植物例如玉米中，可很容易地通過除去雄性花序機械地獲得雄性不育。然而絕大部分作物是雌雄同株並且在同一朵花中具有雄性和雌性器官，這使得這種物理去雄不具實用性。因此有時使用遺傳方法。
發生的遺傳雄性不育性狀通常是由核基因控制的，其中相對於對應的與能育性相關的等位基因，與雄性不育表型相關的等位基因通常是隱性表達的。在遺傳雄性不育發生時其通常與單個隱性基因相關，所述穩性基因必需是純合的這樣雄性不育才得以表達。為了在實踐中應用這種遺傳雄性不育性狀，育種家通常培育表型一致的雌性系，所述雌性系分離成雄性不育和雄性可育植物。需要除去雄性可育植物(一旦鑑定)，這是項費力的工作。因為雄性可育植物對保持群體是必需的，所以不能從群體中將其清除，從而使得保持親本系一直成問題。除了依賴天然存在的雄性不育等位基因外，也可能使用分子生物學方法。可通過基因工程改造植物，使其表達例如反義或核酶基因，所述基因可降低或消除可育花粉形成所必需的關鍵基因的表達。這種轉基因植物系是雄性不育的並且通過與來自雄性可育植物的花粉雜交可用來生產雜交種子。這些系的主要問題是通過與等基因可育系雜交，其只能在後代中以雜合狀態保持。當產量非常重要時，這在雜交種子生產中可能是個問題。儘管例如通常將除草劑抗性與雄性不育聯繫起來，就可能選擇性地除去雄性可育植物，但這要確保所述植物一開始要以相當高的密度種植。
使用用於商業雜種生產的細胞質雄性不育要求有穩定的雄性不育細胞質和花粉來源。雄性不育細胞質遺傳系統要求用於雜種生產的三種類型的系存在，A系(細胞質雄性不育系)、B系(雄性可育保持系)和R系(具有恢復基因的雄性可育系)。用該系統產生的三系雜交涉及4系的保持和生產，近親交配的A和B系和另外兩系的雄性可育近親交配。對單一雄性不育細胞質來源的依賴性可使育種的靈活性降到最低並且導致後代大規模地對特定疾病的易感性。
也可通過使用抑制有活力的花粉形成的化學物質生產雜交種子。這些化學物質(稱為殺配子劑)用於提供瞬時雄性不育。但是殺配子劑的費用、註冊和可靠性已限制其使用。
常規的雜種種子生產系統的缺點是需要分行或分區種植雄性和雌性親本系。在釋放少量不能隨風傳播較遠的花粉的作物例如小麥中，低效率的授粉是尤其迫切的問題。在這些作物中多達三分之二的雜種生產田地需要供給雄性花粉供體植物，從而使得雜交種子生產變得很不經濟。
為了在小麥或其它作物中獲得更經濟的雜交種子生產，需要將雄性和雌性植物移得更近以更有效地傳授花粉；最有效地是在同一行中將雄性和雌性在數釐米內間作。在這種系統中只收穫來自(雄性不育)雌性親本的種子是不現實的。通過在種植混合物中使用儘可能低的這種雄性親本植株和/或通過使用雌性不育的雄性植株可最大限度地減少來自雄性親本的非雜交種子的汙染。用於構建顯性雌性不育系的方法已在(EP412，006A1(1990)；Goldman等人，(1994)EMBO.J.，13，2976-2984)中描述，但對於雄性不育系，其必須以雜合子保持。
因此，存在著對用於生產雜交種子的簡單經濟的方法的需要。特別是為了有效地生產雜交種子，存在著對提供雄性不育雌性親本系和雌性不育雄性親本系的需要，它們可容易地以純的純合系保持和用於有效地生產雜交種子。在本領域中描述的用於實現該目的的方法包括從雄性和雌性親本系生產雜交種子的方法，在所述雄性和雌性親本系中至少有一個包含優選地在花組織中表達的異源嵌合基因，所述嵌合基因使得所述株系條件性地不育，所述不育依賴於外源非毒害植物的物質的施用，所述非毒害植物的物質可通過由所述異源嵌合基因編碼和優先地在雄性或雌性生殖結構中表達的酶特異性和局部地轉化成毒植物素。所述非毒害植物的物質可以是前除草劑(pro-herbicide)。具有這種條件性不育親本系的有利方面是允許其以不育性狀的純合體保持。能育性只是在施用外源非植物毒性物質時被破壞。在一個這樣的條件性雄性不育系統的例子中，編碼脫乙醯基酶的基因(見例如US6555733)優先地在雄花組織的絨氈層細胞中表達，在所述細胞中其將外源施用的前除草劑N-乙醯L膦絲菌素轉化成毒植物素L膦絲菌素，從而阻止了有活力的花粉形成。或者該酶表達於柱頭細胞中，前除草劑N-乙醯基L膦絲菌素的施用阻止了有活力的種子的形成。在進一步類似的例子子中(i)絨氈層優先地表達的細菌細胞色素P450催化前除草劑R7402轉化成阻止有活力的花粉形成的磺脲毒植物素；和(ii)絨氈層優先地表達的膦酸單酯水解酶催化甘油草甘膦前除草劑轉化成阻止有活力的花粉形成的毒植物素草甘膦。WO 98/03838描述了條件性雌性不育系統的例子，其中能夠將所述前除草劑轉化成植物毒素的酶優先地在雌性生殖結構中表達。
儘管存在這些用於生產條件性不育的雄性和雌性親本系的方法，雜交種子的生產在作物例如小麥中仍然遠不是常規的技術。本發明特別涉及到在本領域內提高條件性雄性不育的雌性親本系和條件性雌性不育的雄性親本系的生產。
化學雜交劑和前除草劑很昂貴，因為其不能大規模生產。使用相對便宜的已經註冊的物質例作為商業可購得的除草劑作為化學雜交劑是想要的。這也會達到更好的效果，因為可在單一的噴施應用中將雜草控制與化學雜交相結合。
本發明提供了產生雄性或雌性不育植物的方法(包括提供滅活除草劑的手段)和用於再激活如此滅活的除草劑的手段，其中在營養組織中提供滅活除草劑的手段而在植物的雄性或雌性生殖結構中提供再激活手段，這樣當對植物施用除草劑時就能使營養結構而非生殖結構免受除草劑的毒害植物活性。所述手段可以是任何，其中手段是酶。本發明方法的優選的實施方案包含用多核苷酸轉化植物材料和再生所得的轉化材料成植物的步驟，所述多核苷酸編碼能夠N-乙醯化L-膦絲菌素的第一酶和能夠水解N-乙醯L-膦絲菌素或從N-乙醯L-膦絲菌素除去乙醯基團從而產生L-膦絲菌素的第二酶，其中所述第一酶只在植物的綠色組織中表達，其中對植物葉片施用L-膦絲菌素直到雄性或雌性配子形成和/或成熟時，這樣所述植物基本上不受到除草劑施用的損害，其中所述第二酶優先地在雄性或雌性生殖結構中表達，這樣在這些組織中選擇性局部產生L-膦絲菌素阻止了所述配子體的形成或使其無功能。
如上面所指出的，在優選的方法中，所述除草劑是L膦絲菌素，所述非毒害植物的物質是N-乙醯L膦絲菌素，所述滅活性酶是膦絲菌素N-乙醯轉移酶(PAT)，所述激活性酶是任何能夠水解N-乙醯L膦絲菌素的醯胺酶(例如argE基因產物，US6555733等)。在其它優選的實施方案中，PAT酶在質體藍素啟動子區域的有效控制之下表達。因此，本發明提供了使用相對便宜的商業可購得的除草劑作為雜交劑和同時提供在雜交種子生產田中控制雜草從而提高雜交作物的有效性和產量的方法。
即使在上面提供本發明的方法，仍有其它關於使用所述除草劑作為在F1代植物中控制雜草的方法的問題需要解決，所述F1代植物產生於由前面方法提供的雜交種子。該代作物至少包含兩個編碼使除草劑失活和能夠提供對除草劑抗性的基因(各來自各親本)。所述除草劑也可用於在F1代作物中選擇性控制雜草，這也是想要的。然而，由於兩個編碼激活性酶的在葉片表達的基因的存在，在對所述作物施用所述除草劑後，所述F1代作物表現出對所述除草劑的營養耐受性但具有極少或減少的穀物產量。
因此，本發明提供了其它方法，其中所述失活性酶另外地在花啟動子控制下表達，這樣其基本上只在綠色組織和在生殖組織中表達，所述生殖組織不是使其配子失去功能的生殖組織。在雜交作物中，這種失活性酶在花組織中的共表達抵消了激活性酶的效應，從而防止了因施用除草劑而造成的產量損失。因此本發明提供了克服使廉價商業除草劑膦絲菌素能夠用於雜草控制和在例如雜交穀物生產中用作雜交試劑的問題的方法，此外，所述方法提供了所得的F1代雜交穀物或水稻，在所述作物中可安全地將膦絲菌素(或L膦絲菌素)用於雜草控制而基本上沒有產量損失。作為進一步的利益，更加容易管理產自F1代自交種子(可在隨後的作物中產生自生植物(volunteer))的F2代植物，因為如果噴施控制量的膦絲菌素其自身通常是不育的(或具有顯著降低的生育力)。對於F1代植物與野草(例如紅米)或其它穀類作物的花粉異型雜交的後代也是如此。
在一個實施方案中，本發明提供了方法，其中以合適的比例在田間將雌性和雄性親本系一起間作並以合適的0.05至10kg/ha的比例和在合適的時期噴施膦絲菌素以最優化雜交種子的產量。任選地，如此產生的雜交種子產生在營養和生殖上基本上都對除草劑膦絲菌素的施用具有耐受性的F1後代，從而所述除草劑可用於雜草控制。這種雜交種子也具有有利方面其表達的除草劑耐受性性狀只能部分地傳遞給將來的自交後代或異型雜交入相關的雜草中。
本發明涉及改進用於作物雜交種子生產的方法。特別是本發明涉及從雄性和雌性親本系生產雜交種子的方法，所述親本系是依賴於外源施用除草劑的條件性雌性或雄性不育，其中兩個系都基本上對所述除草劑具有營養上的耐受性，其中在以使自體受精降到最低或受到阻止的時間和以足夠的量施用所述除草劑。本發明也涉及產生條件性雄性或雌性不育植物的方法，通過i)用一個或多個嵌合基因轉化植物材料，所述嵌合基因編碼能夠將除草劑轉化成非毒害植物的物質的失活性酶和能夠將所述非毒害植物的物質轉化成除草劑的激活性酶。所述激活性酶在一個或多個啟動子的有效控制之下表達，在條件性雄性不育植物的情況下，所述啟動子導致所述酶基本上只在雄性生殖結構中表達，或在條件性雌性不育植物的情況下所述啟動子使所述酶基本上只在雌性生殖結構中表達。所述失活性酶在啟動子區域的有效控制之下表達，所述啟動子區域導致基本上只在綠色組織中表達，或任選地在兩個或更多個啟動子區域有效控制之下表達，從而所述失活性酶另外地在花啟動子控制之下表達，這樣其基本上只在綠色組織和在除了使其配子在其中失去功能的生殖組織以外的生殖組織中表達。將所述植物材料再生成形態學正常的能育植物，所述植物是條件性雄性或雌性不育植物。本發明也包括使用條件性雄性不育植物和條件性雌性不育植物生產更有效的雜交種子，使用膦絲菌素作為雜交劑、使用某些嵌合基因和使用這些嵌合基因產生雜交種子。本發明也提供了條件性雄性不育、條件性雌性不育植物，這些植物的種子和由所述方法產生的雜交種子。在本發明的優選的實施方案中，用於生產雜交種子的方法的作物是玉米、水稻、高梁、小麥粟、燕麥、油菜和大麥。
術語表定義此處所用的『脫乙醯酶』或『醯胺酶』是指任何能夠水解N-乙醯L膦絲菌素的酶。
此處所用的『基因』是指任何包含幾個有效地連接的DNA片段例如啟動子和5』調節區域、編碼序列以及包含聚腺苷酸化位點的非翻譯3』區域的DNA序列。
當涉及基因或DNA序列時，『嵌合的』用於表示在自然界中，所述編碼序列與啟動子或與基因中的至少一個其它DNA調節區域不相關的事實。
如此處所用的，『嵌合基因』是指一種基因，其中在自然界中基因的編碼序列與啟動子或與所述基因中的至少一個其它DNA調節區域不相關。
此處所用的『表達盒』是指包含嵌合基因的可翻譯的DNA區域，所述嵌合基因的側翼連接著一個或多個限制性或其它位點，所述位點有利於從一個DNA座位的精確切割和插入另一個座位。
『非毒害植物的物質』在本發明中是指對用於本發明方法的植物、任何特定的作物的細胞或組織相對無植物毒害的物質。非毒害植物的物質不必在所有植物的所有組織中是非毒害植物的。
『雌性生殖結構』是指雌性配子和專門負責雌性配子產生、成熟和生存力的植物部分。通常其包含植物的這些部分，所述部分包括心皮或雌蕊(「花柱」)。植物的心皮包括但不限於柱頭、花柱、子房和由柱頭、花柱和子房包含的細胞或組織。
『雄性生殖結構』是指雄性配子和專門負責雄性配子產生、成熟和生存力的植物部分。其包括植物的這些部分，所述部分包括例如小孢子、雄蕊、絨氈層、花葯和花粉。
此處所用的『雌性不育植物』是在用有功能或有活力的花粉授粉後不能支持有活力的種子形成的植物。這種雌性不育可以是育種選擇或轉基因存在造成的。『條件性雌性不育植物』是指在正常生長條件下是雌性可育的而在特定的條件下可變成雌性不育的植物。在本發明中這種『雌性不育植物』或『條件性雌性不育植物』保持雄性可育並能產生有活力的花粉。
此處所用的『雄性不育植物』是不能支持有活力的花粉形成的植物。這種雄性不育可能是育種選擇或轉基因的存在造成的。『條件性雄性不育植物』是指在正常條件下是雄性可育的而在特定條件下可變成雄性不育的植物。例如，所述條件可以包括物理去雄或施用特定的化學殺配子劑。在本發明中這種『雄性不育植物』或『條件性雄性不育植物』保持雌性可育並能在用有功能或有活力的花粉授粉後產生有活力的種子。
此處所用的『啟動子區域』是DNA區域，所述DNA區域至少包含功能性啟動子和任選地一些或所有與其相關的上遊調節序列(包括增強子序列)和/或相關的下遊序列(包括一些或所有相對於啟動子為內源的基因的5』非翻譯區域)。
此處所用的『間作』是指在田間種植種子或植物的方法，所述方法確保由雄性可育植物充分地給雄性不育或條件性雄性不育植物異花傳粉。通過在種植植物之前以不同的混合比例(80/20；90/10；等)隨機地混合雌性和雄性親本種子或通過以不同種子交替播種的特定的田間模式種植來實現該方法。當要求從不同植物中分開收穫時，以交替的區或行種植植物是優選的。在本發明的方法中，所述除草劑可以和至少一種其它的物質混合使用，所述其它物質可選自胺基酸、安全劑、殺配子劑、穀胱甘肽-S-轉移酶誘導劑、細胞色素P450誘導劑、肥料、除草劑、殺線蟲劑、增效劑、殺蟲劑、殺真菌劑、激素、植物生長調節劑和細胞色素P450抑制劑。
任選地可進一步突變和選擇編碼用於本發明的酶的DNA序列以產生進一步有用的具有提高的效力的酶。於是許多酶的特性得到了提高，所述特性包括對想要的底物的催化活性(kcat/Km)、溫度穩定性和pH的最適合值。用於產生、篩選和選擇這些改進了的變體的方法是熟知的。例如，通過誘變(例如通過將DNA通過DNA複製易於出錯的細菌或醇母株系例如大腸桿菌XL1 red進行傳遞、通過UV、化學或靶向的寡核苷酸PCR誘變)的方法產生合適的變體DNA序列。特別地通過許多可選擇的DNA重排或『有性PCR』方法(如，WO 00/61740中從28至41頁中所概述的，此處引用作為參考)中的任一種產生這類基因。許多方法適合用於篩選這些改進了的基因。在合適的宿主細胞例如大腸桿菌或酵母中可合適地表達基因並且可通過使用合適的測定法例如此處所描述的測定法選擇改進了的基因。
編碼用於本發明的失活性酶的嵌合基因可各自包含編碼一個有效地連接5』啟動子區域的所述酶，所述失活性酶能夠將除草劑轉化為非毒害植物的物質，所述啟動子區域優選地指導基因基本上只在植物的綠色組織中表達。這種表達的特異性確保除草劑失活基本上只在綠色組織中發生，從而想要消除的除草劑組織殺傷效力沒有受到損害，通過激活性酶在形成配子的局部組織內選擇性表達從非毒害植物的物質局部地重新產生所述除草劑的組織殺傷效力。除了啟動子區域外，本發明的嵌合基因也包含3』轉錄終止子序列。其負責轉錄的終止和正確的mRNA聚腺苷醯化。許多這樣的3』轉錄終止子序列在本領域是已知的並且適合用於本發明的嵌合基因。在特定的實施方案中所述3』轉錄終止子序列選自CMV 35S終止子、tml終止子、胭脂鹼合酶(nos)終止子和豌豆rbcS E0終止子。在特定的實施方案中，所述除草劑是L-膦絲菌素而所述失活性酶是PAT，其是本領域熟知的能夠催化L膦絲菌素N-乙醯化的酶。例如合適的PAT酶和編碼其的序列描述於EP257542(Streptomyces viridichromogenes PAT酶)、EP617121、EP297618、EP290986(產鹼菌屬PAT酶)、EP275957(最優化的鏈黴菌基因)。在其它特定的實施方案中，所述5』啟動子區域是或來源於質體藍素基因的啟動子區域並且可以例如來源於大麥質體藍素基因(EMBLZ28347)5′的大約1kb啟動子區域，所述5』啟動子區域優選地指導基因基本上只在植物的綠色組織中表達。
編碼用於本發明的激活性酶的嵌合基因可各自包含編碼一個有效地連接5』啟動子區域的所述酶，所述激活性酶能夠將由於失活性酶對除草劑的活性作用造成的非毒害植物的物質轉化成除草劑，所述5′啟動子區域優選地指導基因在雄性或雌性生殖結構中表達。這種表達的特異性確保所表達的酶的效應只在形成有活力的種子或有活力的花粉所必需的局部組織和細胞內產生作用，並且除了其在非毒害植物的物質存在的情況下對能育性的影響外對所述植物沒有毒害。除了啟動子區域外，本發明的嵌合基因也包含3』轉錄終止子序列。其負責轉錄的終止和正確的mRNA聚腺苷醯化。許多這樣的3』轉錄終止子序列在本領域是已知的並且適合用於本發明的嵌合基因。在特定的實施方案中所述3』轉錄終止子序列選自CMV 35S終止子、tml終止子、胭脂鹼合酶(nos)終止子和豌豆rbcS E0終止子。在特定的實施方案中，所述激活性酶是能水解N-乙醯-L-膦絲菌素的醯胺酶。例如所述酶是描述於美國6,555,733的N-乙醯穀氨酸脫乙醯酶(deac 1)(任選地進一步突變和選擇以提高有關N-乙醯膦絲菌素的底物特異性)。可選擇地所述脫乙醯酶基因可以是任何一個許多描述於文獻和例如描述於EP 942965和EP 531716B1中的基因。
此外，任選地，編碼用於本發明的失活性酶的嵌合基因可各自包含編碼其中一個所述酶的DNA序列，所述DNA序列有效地連接優選地指導其在雄性或雌性生殖結構中表達的5』啟動子區域，所述失活性酶能夠將除草劑轉化成非毒害植物的物質。選擇這種表達的特異性以確保所表達的酶的效應只在形成有活力的種子或有活力的花粉所必需的組織和細胞(除了想要通過所述激活性酶的局部表達以消除其的組織和細胞外)位點內發揮作用。換句話說，如果所述激活性酶在形成雄配子的組織中表達以產生條件性雄性不育植物，那麼除了在綠色組織中外，只在形成雌配子的組織中表達所述失活性酶。選擇失活性酶優選地在花中表達的局部組織位點和時間以使其不損害所述激活性酶在用於雜交的條件性雄性不育親本系中使配子不育的效應，但抵消任何在F1雜交後代中激活性酶表達的潛在不育效應。理想地，將用於影響激活性酶在雌性親本系的雄花組織中表達的相同5』啟動子區域用於驅動失活性酶在雌性親本系中表達。類似地，將用於影響激活性酶在雄性親本系的雌花組織中表達的相同5』啟動子區域用於影響失活性酶在雄性親本系中表達。除了啟動子區域外，本發明的嵌合基因也包含3』轉錄終止子序列。其負責轉錄的終止和正確的mRNA聚腺苷醯化。許多這樣的3』轉錄終止子序列在本領域是已知的並且適合用於本發明的嵌合基因。在特定的實施方案中所述3』轉錄終止子序列選自CMV 35S終止子、tml終止子、胭脂鹼合酶(nos)終止子和豌豆rbcS E0終止子。
適合用於所述嵌合基因的某些實施方案的5』啟動子區域包含優選地在雌花組織中表達的基因的5』區域。在某些實施方案中5』啟動子區域選自菸草的stig 1啟動子(Goldman等人，(1994)EMBO J.，13，2976-2984)、經修飾的S13啟動子(Dzelkalns等人(1993)PlantCell，5，8555)、AGL5啟動子(Savidge等人(1995)Plant Cell，7，721-733)和玉米心皮特異性ZAG2基因的5』啟動子區域(Thiessen等人(1995)Gene，156，155-166)。任選地，從基因組DNA的編碼序列的上遊區域獲得進一步合適的啟動子區域，所述基因組DNA的編碼序列對應於本領域已知的優選地在雌性生殖結構中表達的cDNA序列。在某些實施方案中這類探針cDNAs選自擬南芥Fbp7和Fbp11基因(Angenent等人，(1995)Plant Cell，7，1569-1582)和蘭花特異性cDNAs O40、O108、O39、O126和O141(Nadeau等人，(1996)PlantCell，8，213-239)。在特定的實施方案中包含與雌性生殖結構中優先表達相關的基因組DNA的5』啟動子區域選自基因組DNA克隆pSH64(具有保藏號NRRL B-21920)、與cDNA P26-A4(具有保藏號NRRL B-21655)雜交的pCIB10302基因組克隆和與cDNA克隆P19-QA(具有保藏號NRRLB-21919)雜交的基因組DNA克隆X2-1。在特定的實施方案中，這些啟動子區域包含WO 98/39462中的SEQ ID No.11的核苷酸1至1390、SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的核苷酸1至1093。在其它實施方案中，通過本領域技術人員熟悉的方法分離和克隆適合用於本發明的嵌合基因的5』啟動子區域。例如，通過從組織例如玉米穗絲或小麥雌蕊中分離RNA，接著使用技術例如差示顯示、PCR選擇性cDNA扣除和扣除cDNA文庫構建進行差示篩選來鑑定在雌性生殖結構中表達的新轉錄物。cDNA克隆優選地在雌性組織而不在其它植物部分例如葉、根和穗中表達。任選地通過Northern印跡雜交進一步確定表達的組織特異性。將所述cDNA克隆用作基因組文庫篩選的探針。從基因組DNA克隆中獲得與組織特異性表達相關的5』啟動子區域和任選地3』非翻譯DNA區域，並用於構建用於優選地在雌性生殖結構中表達的嵌合基因。
適合用於所述嵌合基因的某些實施方案的5』啟動子區域包括優選地在雄花組織中表達的基因的5』區域。這些包括在花粉、絨氈層或花葯中的其它結構中表達的啟動子區域。在某些實施方案中，這些5』啟動子區域選自LAT52啟動子(Twell等人，(1989)Dev.，109，705-713)、番茄A127啟動子(Dotson等人，(1996)Plant J.，10，383-392)、玉米Zmg啟動子(Hamilton等人，(1989)Sex.PlantReprod.2，208-212)、玉米CDPK啟動子(Guerro等人，(1990)Mol.Gen.Genet.，224，161-168)和USP 5477002中公開的花葯特異性ant32和ant43D啟動子，此處引用其全文作為參考。在某些實施方案中，所述5』啟動子區域選自來自玉米的絨氈層特異性啟動子CA55(WO92/13956中描述的「Pca55」)、來自水稻的絨氈層特異性啟動子E1(USP5639948中所描述的)、來自水稻的絨氈層特異性啟動子T72(USP5639948中所描述的)、來自水稻的RA8花葯特異性啟動子(EMBL/Genbank檢索號AF042275；Jean Js等人，(1999)PMB，39，35-44)、花葯特異性Tapl啟動子(Spena等人(1992)Theor ApplGenet 84，520-527)和來自玉米的ZmC5-花粉特異性啟動子(EMBL/Genbank檢索號Y13285；Wakeley等人，(1998)PMB，37，187-192)。任選地，從基因組DNA的編碼序列的上遊區域獲得合適的啟動子區域，所述基因組DNA的編碼序列對應於本領域已知的優選地在雄性生殖結構中表達的cDNA。在某些實施方案中這種探針cDNAs選自蘭花花粉管特異性細胞色素P450基因(Nadeau等人，(1996)PlantCell，8，213-239)、擬南芥Bcpl基因(Xu等人(1995)P.N.A.S.，92，2106-2110)和玉米的雄花特異性MFS14基因(Wright SY等人，(1993)Plant J，3，41-49)。在其它的實施方案中，通過本領域技術人員熟知的方法分離和克隆適合用於本發明的嵌合基因的其它5』啟動子區域。例如，通過從組織例如穗、花粉管、花葯或絨氈層中分離RNA，接著通過使用技術例如差示顯示、PCR選擇性cDNA扣除和扣除cDNA文庫構建進行差示篩選來鑑定在雄性生殖結構中表達的新轉錄物。分離優選地在雄性組織但不在其它植物部分例如葉、根和柱頭表達的cDNA克隆。任選地通過Northern印跡雜交進一步確定表達的組織特異性。將所述cDNA克隆用作基因組文庫篩選的探針。從基因組DNA克隆中獲得與組織優先表達相關的5』啟動子區域和3』非翻譯DNA區域，並將其用於構建用於優選地在雄性生殖結構中表達的嵌合基因。
其它用於本發明的嵌合基因的啟動子區域包括水稻的Osmads 13基因、水稻花葯的OSG基因和水稻的YY2基因的上遊區域。通常，在雄性或雌性生殖結構中產生高水平的、早期的、持續的和優先的表達的啟動子區域被選作最合適的啟動子。啟動子區域也可進一步包含相互之間組合和與增強子區域一起的嵌合組合。
嵌合基因可任選地包含區域，所述區域緊接在編碼激活性或失活性酶的DNA序列前面，所述區域編碼能夠將所述酶靶向亞細胞器例如葉綠體、過氧化物酶體或線粒體的肽序列，並且所述靶向蛋白可以具有(i)葉綠體轉運肽或(ii)葉綠體蛋白-葉綠體轉運肽的葉綠體轉運肽-N端部分的序列。在某些實施方案中，轉運肽序列可選自Nicotinia plumbaginifolia線粒體ATP合酶的β亞基、線粒體特異性NADP依賴性異檸檬酸脫氫酶、呼吸鏈複合物I的NADPH結合亞基和酵母線粒體色氨醯-tRNA-合成酶的內源轉運肽序列(WO 6121513)。
用於本發明方法的多核苷酸可包含一個或多個編碼激活性和失活性酶的嵌合基因。任選地這些多核苷酸還包含其它基因和嵌合基因，例如嵌合標記基因。此處使用的嵌合標記基因包含在植物細胞中具有活性的啟動子控制之下表達的標記DNA。所述標記DNA編碼RNA、蛋白質或多肽，當所述物質在植物、植物組織或植物細胞中表達時，可使這種植物材料與不表達所述標記DNA的植物材料區分開來。標記基因的例子有為細胞提供特異性顏色的基因例如A1基因(Meyer等人(1987)Nature 330，667)或使植物細胞抵抗使用抗生素(例如，編碼對艮他黴素抗性的aac(6』)基因，WO 94/01560或提供對潮黴素抗性的潮黴素磷酸轉移酶基因)或除草劑(除了用於在雜交種子生產中影響條件性雄性和/或雌性不育的除草劑外)例如草甘膦(例如USP 5510471和WO 00/66748中的EPSPS基因)、甜菜寧(例如USP5347047；USP5543306中的pmph基因)、膦絲菌素(PAT)、溴苯腈(例如USP 4810648中描述的基因)、磺醯脲(例如EP 0360750中描述的基因)、茅草枯(WO99/48023中描述的基因)、氨腈(WO98/48023；WO 98/56238中描述的基因)進行致死選擇的基因。在本發明的多核苷酸(包含作為標記基因的附加除草劑抗性基因)的優選的實施方案中，所述除草劑是用於作物中控制雜草的除草劑，此外，充分表達除草劑抗性基因以提供對田間比率的所述除草劑以充足的耐受性。在其它優選的實施方案中，所述附加的除草劑是草甘膦並且所述除草劑抗性基因是EPSP合酶。然而所述標記基因可以是提供正選擇的基因，其中所述標記基因編碼在特定的介質中給轉化的植物細胞提供正代射作用有利方面的酶。USP5767378描述了許多合適的正選擇系統和基因。
當本發明的多核苷酸包含附加的除草劑抗性基因時，對以充分密度間作的作物植株外源地施用所述除草劑以消除來源於非轉基因的自體受精親本植株的非雜交種子的產生。在優選的實施方案中所述附加的除草劑是草甘膦或其農學上有用的鹽，而所述除草劑抗性標記基因選自WO 00/66748中描述的草苷膦抗性提供基因。
當標記基因存在時，也提供了用於除去所述標記基因的手段。例如在決定組合性狀時，這是想要的。包含標記基因的多核苷酸可任選地包含特異性重組酶的特異性識別位點，所述位點位於所述標記基因側翼並允許所述序列被「剔除」。將攜帶這種經側翼連接的標記基因的植物與攜帶編碼相應的特異性重組酶的基因的植物雜交導致所述標記從其中被特異性切除的後代植物。合適的這類位點特異性同源重組系統的例子是flp/frt系統(Lyznik等人，(1996)，Nucleic AcidsRes.24，3784-3789)和Cre/Lox系統(Bayley，C.C.等人，(1992)PMB，18，353-361)。
用於本發明方法的多核苷酸可任選地包含一個或多個位於編碼蛋白的序列的5』非翻譯區域內的翻譯增強子。本領域技術人員知道這類合適的翻譯增強子，例如來源於TMV的Omega和Omega引物序列以及來自菸草蝕紋病毒的翻譯增強子，和知道如何可將這些翻譯增強子導入所述多核苷酸以提供想要的增加的蛋白表達結果。其它例子包括來源於玉米褪綠斑駁病毒和苜蓿花葉病毒(Gallie等人，(1987)Nucl.Acids Res.，15，8693-8711；Skuzeski等人，(1990)PMB.，15，65-79)的翻譯增強子。為進一步最優化來自嵌合基因和嵌合標記基因的蛋白的表達，所述多核苷酸也可進一步包含元件例如增強子、支架附著區域(SARS或MARS)和內含子。已顯示當基因的5』非翻譯區域包含各種內含子序列和任選地當各種內含子序列用於本發明的嵌合基因中時，各種內含子例如玉米adh1內含子1增強表達。
根據本發明已轉化的表現想要的雄性/雌性不育特徵的植物也可用多核苷酸轉化，所述多核苷酸酸包含編碼能夠為包含其的植物材料提供至少一種下列農藝學性狀的區域，所述性狀是對昆蟲、真菌、病毒、細菌、線蟲、逆境、dessication和除草劑的抗性。
除草劑抗性提供基因可以例如選自編碼下列蛋白的序列草甘膦氧化酶(GOX)、EPSP合酶、羥苯基丙酮酸二氧化酶(HPPD)、膦絲菌素乙醯轉移酶(PAT)、穀胱甘肽S轉移酶(GST)、細胞色素P450、乙醯CoA羧化酶(ACCase)、乙醯乳酸合酶(ALS)、原卟啉原氧化酶(PPO)、二氫蝶酸合酶、多胺轉運蛋白、過氧化物岐化酶(SOD)、溴苯腈腈水解酶，八氫番茄紅素去飽和酶(PDS)、獲自真氧產鹼桿菌(Alcaligenes eutrophus)的tfdA基因產物和已知的所述蛋白的誘變或其它修飾產生的變體。仔細地考慮用於影響條件性不育的除草劑的性質以及激活性和失活性酶的性質後，本領域技術人員認識到需要選擇這些基因和驅動其表達的啟動子。在所述多核苷酸提供多種除草劑抗性的情況下，這些除草劑可選自二硝基苯胺除草劑，三唑並嘧啶、尿嘧啶、苯基脲、三酮、異噁唑、N-乙醯苯胺、噁二唑、triazinone、N-磺醯苯胺、醯胺、N-醯苯胺、isoxaflutole、flurochloridone、噠草伏和三唑啉酮(triazolinone)類型除草劑，並且萌後(post-emergence)除草劑選自草甘膦和其鹽、草銨膦、磺草靈、滅草松、雙丙氨膦、除草定、稀禾定或其它的環己二酮、麥草畏、蔓草磷、胺草唑、苯氧基丙酸、喹禾靈或其它芳氧基苯氧基丙酸、毒莠定、fluormetron、butafenacil、莠去津或其它三嗪、嗪草酮、氯嘧黃隆、綠黃隆、flumetsulam、halosulfuron、sulfometron、滅草喹、咪草煙、isoxaben、imazamox、metosulam、pyrithrobac、rimsulfuron、苄嘧黃隆、煙嘧黃隆、氟磺胺草醚、乙羧氟草醚、KIH9201、ET751、carfentrazone、mesotrione、sulcotrione、百草枯、敵草快、溴苯腈和噁唑禾草靈。
在所述多核苷酸包含編碼殺蟲劑蛋白的序列的情況下，這些蛋白可選自來源於Bt的晶體毒素(包括分泌的Bt毒素例如稱作「VIP」的毒素)、蛋白酶抑制劑、凝集素和Xenhorabdus/光狀桿菌屬毒素。提供真菌抗性的基因可選自編碼已知的AFPs、防衛素、殼多糖酶、葡聚糖酶和Avr-Cf9的基因。特別優選的殺昆蟲蛋白是cryIAc、cryIAb、cry3A、Vip1A、Vip1B、Vip3A、Vip3B、半胱氨酸蛋白酶抑制劑和雪花蓮凝集素。在所述多核苷酸包含提供細菌抗性的基因的情況下，這些基因可選自編碼殺菌肽和techyplesin和其類似物的基因。病毒抗性提供基因可選自編碼病毒衣殼蛋白、運動蛋白、病毒複製酶的基因和反義以及核酶序列，已知所述核酶序列提供針對病毒的抗性；而提供逆境、鹽和乾旱抗性的基因可選自編碼穀胱甘肽S轉移酶和過氧化物酶的基因、構成已知的CBF1調節序列的序列和已知的提供海藻糖積累的基因。
可「修飾」用於本發明的多核苷酸以增強其包含的蛋白編碼序列的表達，例如可除去mRNA不穩定性基序和/或偶然的拼接區或可使用作物優選的密碼子以使所得的經修飾的多核苷酸在植物中表達產生基本相似的蛋白，所述蛋白具有與生物體中未經修飾的多核苷酸的蛋白編碼區域表達所獲得的蛋白基本相似的活性/功能，在所述生物體中這些未經修飾的多核苷酸區域是內源多核苷酸。經修飾的多核苷酸和內源地包含於所述植物中並編碼基本相同蛋白的多核苷酸之間的同一性程度可以防止經修飾的和內源序列之間的共抑制。在這種情況下，序列之間的同一性程度應當優選地低於大約70％。此外可以修飾翻譯起始位點周圍的序列以使其是「Kozack優選的」。其代表的意義對本領域技術人員來說是熟知的。
本發明進一步包括形態學正常的條件性能育的完整植物，所述完整植物由使用本發明的核酸轉化的材料再生的植物雜交而產生，所述核酸從而提供這種性狀。本發明也包括所得植物的後代、其種子和部分。
本發明的植物可選自田間作物、水果和蔬菜例如油菜、向日葵、菸草、甜菜、棉花、玉米、小麥、大麥、水稻、高梁、mangel worzels、蕃茄、芒果、桃、蘋果、梨、草莓、香蕉、瓜、馬鈴薯、胡蘿蔔、萵苣、捲心菜、洋蔥、大豆屬物種、甘蔗、豌豆、field beans、白楊、葡萄、柑橘、紫花苜蓿、黑麥、燕麥、草皮和草料草、亞麻和油料種子油菜、和產生堅果的植物(只要其沒有在前面被特別地提到)、其後代、種子和部分。
特別優選的這類植物包括小麥、大麥、燕麥、水稻、玉米、粟和高梁。
本發明此外還提供了產生雜交小麥種子的優選的方法，其包括步驟(i)用一個或多個多核苷酸或載體轉化植物材料，所述多核苷酸或載體包含基本上只在綠色組織中表達的使除草劑失活的基因和提供依賴於外源施用所述除草劑的條件性雄性不育的基因；(ii)選擇如此轉化的材料；和(iii)將如此選擇的材料再生成形態學正常的條件性雄性不育的完整植物。
(iv)培育純合的條件性雄性不育雌性親本系(v)用一個或多個多核苷酸或載體轉化植物材料，所述多核苷酸或載體包含基本上只在綠色組織中表達的使除草劑失活的基因和提供依賴於外源施用與(i)中相同的除草劑的條件性雌性不育的基因；(vi)選擇如此轉化的植物；和(vii)將如此選擇的材料再生成形態學正常的條件性雌性不育的完整植物(viii)培育純合的條件性雌性不育雄性親本系(ix)以確保有效授粉的比例間作所述條件性不育的雄性和雌性親本系(x)以使自體受精減少到最少的劑量和發育階段對所述間作的親本系施用所述除草劑(xi)從間作親本植物中收穫雜交小麥種子。
本發明也提供了上述方法的變體，其中通過任何方法使雄性親本雌性不育，通過任何方法使雌性親本雄性不育，雄性和雌性親本系是依賴於施用不同除草劑(兩種除草劑都施用)的條件性不育，並且所述作物不是小麥。
本發明也包括包含用於檢測蛋白或編碼其的DNA序列的手段的診斷試劑盒，所述蛋白或DNA存在於根據本發明方法產生的植物中，因此適合用於鑑定包含其的組織或樣品。通過本領域技術人員已知的PCR擴增可檢測所述DNA序列，所述PCR擴增基於引物，所述引物是可容易地從本申請公開或提到的編碼酶的序列推導的引物。所述酶自身可通過例如使用針對其的已產生的抗體進行檢測，所述抗體用於診斷性區分所述酶包含的抗原性區域。
關於植物材料的轉化，本領域技術人員意識到儘管靶材料的類型(例如，胚發生細胞懸浮培養物或去分化未成熟胚)和轉化的特定方法(例如，使用農桿菌或微粒轟擊)在下列的實施例中被明確描述，但本發明並不限於這些特定的實施方案並且這些靶材料和方法可交換使用。此外，整個本發明說明書中所用的術語「植物細胞」是指分離的細胞，包括懸浮培養物，和以完整或部分完整的組織存在的細胞，所述組織是例如胚、小盾片、小孢子、來源於小孢子的胚或來自植物器官的體細胞。類似地，儘管特定的實施例限定於玉米和小麥，本發明同樣應用於廣泛的可使用合適的植物細胞轉化方法進行轉化的農作物中。
通過下列非限定性實施例和序列可更明確定地理解本發明。
SEQ ID#1引物5′-AACTGCAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3′SEQ ID#2引物5′-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAAAAC-3′根據已建立好的方法進行一般的分子生物學方法。對於絕大部分下列實施例，各包含本發明的多個範例。此處所用術語『基因的啟動子區域』表示DNA序列，所述DNA序列包含啟動子、所述啟動子的上遊序列和任選地也包含全部或部分編碼mRNA 5』非翻譯前導區域的DNA序列。
實施例1.依賴於外源施用膦絲菌素的條件性雌性不育的菸草植物編碼能夠水解N-乙醯L-膦絲菌素的酶的DNA序列在文獻中是熟知的，其來源於例如Streptomyces viridichromogenes(N-乙醯-L-phosphinothricylalanylalanine脫乙醯酶)、大腸桿菌(argE，N-乙醯鳥氨酸脫乙醯酶)，寡養單胞菌屬和食酸叢毛單胞菌(Comamonasacidovorans)和文獻中熟知的其密碼子經最優化的版本(例如EP531716、EP942965和US6555733)。任選地也通過標準的突變和選擇方法(例如使用塗板複製測定法監控表現N-乙醯膦絲菌素對細菌生長的增加的生長抑制作用或使用膦絲菌素產物的氨基基團的體外比色檢測)或通過應用相似的選擇進行基因改組方法進一步提高這些脫乙醯酶DNA編碼序列的N-乙醯L-膦絲菌素脫乙醯酶活性的特異性。例如通過合成(所述方法使其更容易控制限制性內切酶位點存在的位置和建立有助於克隆的側翼連接位點)獲得DNA脫乙醯酶編碼序列。設計側翼PCR引物和合成的DNA序列以提供有用的單一限制性位點以便進行克隆。優選地和在當脫乙醯酶編碼序列不含有易混的內部位點的情況下，將Ncol或Ndel置於5』末端以促進符合讀碼框的融合體的克隆，所述融合體是與ORF的5』加入序列的融合體。任選地，將限制性位點置於ATG翻譯起始位點間插序列的上遊以符合植物翻譯一致序列(例如根據Kozack)。
『ΔS13啟動子』是用於在雌花部分獲得優選表達的啟動子區域。其包含與CMV 35S核心啟動子(Dzelkalns等人(1993)Plant Cell，5，833-863)-46至+8融合的SLG13啟動子區域的-339至-79區域。將該S13啟動子區域克隆入bluescript sk中，然後將所述質粒進一步進行限制性酶切割，並用包含nos3』轉錄終止子區域和一個或其它的編碼脫乙醯酶的序列的限制性片段進行連接，從而在bluescript sk質粒中產生『ΔS13-脫乙醯酶-Nos終止子』表達盒。然後將其合適地以例如EcoR1片段限制性切出並原樣將其連接入載體例如pBIN19(Bevan(1984)Nucleic Acids Res.)或pCIB200或pCIB2001(WO98/39462)的合適位點上以用於使用農桿菌的轉化。如WO 98/39462中所描述的，pCIB200包含下列單一的多接頭限制性位點EcoR1、Sstl、Kpnl，BglII、Xbal和SalI。PCIB2001在多接頭中包含插入物，所述插入物加入其它單一限制性位點，包括MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaI和StuI。PCIB200和pCIB2001也提供了用於在卡那黴素上篩選植物和細菌的選擇標記基因、左和右T-DNA邊界、來源於RK2的在大腸桿菌和其它宿主細胞之間轉移的trfA功能以及來自RK2的oriT和oriV。可選擇地使用了包含來自具有廣泛宿主範圍的質粒pRK252(Rothstein等人(1987)Gene53，153-161)的序列的二元載體pCIB10或使用了一個其衍生物例如pCIB715，所述衍生物包含卡那黴素抗性基因和潮黴素磷酸轉移酶基因(Gritz等人(1983)Gene25，179-188)。
可選擇地使用了大約1.6kb的Stig1啟動子區域(來源於EMBL檢索號X77823)。例如用編碼脫乙醯酶的DNA序列取代Goldman等人(1994)在EMBO J.13，2976-2984中描述的stig1-GUS構建體中的GUS基因編碼區，將所得的stig1-D胺基酸氧化酶表達構建體在鄰近合適的標記基因的3』終止子序列的上遊位點和在T-DNA的邊界序列之間克隆入合適的載體例如pCIB200中。
編碼來自Streptomyces viridichromogenes、產鹼菌屬的PAT基因的DNA序列和其密碼子經最優化的版本在文獻中是熟知的(EP257542(Streptomyces viridichromogenes PAT酶)、EP617121、EP297618、EP290986(產鹼菌屬PAT酶)、EP275957(最優化的鏈黴菌基因))。適合用於菸草的PAT基因是例如描述於檢索號A02774的基因。這些DNA編碼序列可以通過例如合成(所述方法使其更容易控制限制性內切酶位點存在的位置和建立有助於克隆的側翼連接位點)獲得。設計側翼PCR引物和合成的DNA序列以放置有用的單一限制性位點以便進行克隆。優選地和在PAT編碼序列不含有易混的內部位點的情況下，將Ncol或Ndel置於5』末端以促進符合讀碼框的融合體的克隆，所述融合體是與ORF的5』加入序列的融合體。任選地，將限制性位點置於ATG翻譯起始位點間插序列的上遊以符合植物翻譯一致序列(例如根據Kozak)。
在進一步特定實施例中，根據
圖1構建二元載體內的T-DNA插入物。將包含編碼脫乙醯酶的DNA序列和編碼L-膦絲菌素N-乙醯轉移酶(PAT)的DNA序列(A02774)的構建體克隆在二元載體的T-DNA的LB/npt II基因和RB之間的位點上，所述編碼脫乙醯酶的DNA序列在stig1啟動子區域的有效控制之下，所述編碼L-膦絲菌素N-乙醯轉移酶(PAT)的DNA序列在碗豆質體藍素啟動子區域的有效控制之下。簡而言之，將脫乙醯酶編碼序列在Stig1啟動子之後和在nos終止子區域(包含於EMBLATU237588)之前以例如NcoI/PstI片段克隆入質粒pFse4-Stiglnos(描述於WO 9942598)中。通過PCR從豌豆基因組DNA中獲得豌豆質體藍素啟動子區域(來源於EMBL檢索號X16082)並將其克隆在PAT基因/nos終止子之前。將所得的PC-PAT-nos盒以例如Not I片段克隆在Stig1-seactylase-nos之後，並且將這整個兩基因構建體以例如FseI片段轉移至二元載體(pVB6，Bin19衍生物)中。
在其它的方法變體中，克隆脫乙醯酶基因，使其5』端正好位於編碼葉綠體轉運肽的區域的下遊，從而編碼葉綠體轉運肽/脫乙醯酶融合蛋白。所述葉綠體轉運肽編碼序列來源於編碼EPSP合酶小亞基(Klee，等人1987 Mol.Gen.Genet.，210，437)的擬南芥基因。任選地對其進行修飾以在CTP加工位點包含Sph1位點從而在該位點用Cys-Met取代Glu-Lys(WO 92/044490的圖9中的SEQ)。相應地，可在脫乙醯酶編碼序列的N末端通過基因工程引入SPh1位點(將緊隨甲硫氨酸後的胺基酸轉化成亮氨酸)。可選擇地，所述轉運肽編碼序列來源於編碼EPSP合酶(WO 92044490中的圖11)的Petunia基因。可選擇地葉綠體基因編碼序列是大量可能序列中的任何一個，所述可能序列包括來源於編碼Rubisco小亞基的基因和包括所謂的『最優化的』嵌合轉運肽序列(FR2673643)。在所有情況下，不依賴於亞克隆，可簡單地通過合成獲得整個想要的編碼葉綠體轉運肽/脫乙醯酶多肽的DNA序列。將該序列克隆入合適的載體內的stig1啟動子區域下遊和終止子(例如nos)序列的上遊位點(例如在Goldman等人(1994)在EMBOJ.，13，2976-2984中描述的包含stig 1→GUS構建體的載體中取代GUS編碼序列)。然後將整個基因表達構建體(也包括在質體藍素啟動子區域有效的表達控制之下的PAT基因序列)克隆入PVB6載體的T-DNA的右和左邊界之間的合適位點上。
使用類似於Horsch等人(1985)Science，227，1229-1231中描述的方法用重組二元載體轉化菸草葉片。可使用許多方法的變體。例如，使用冷凍解凍的轉化方法可將二元載體轉化入例如根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)株系LBA4404中。按照Draper等人(Plant Genetic Transformation，Blackwell Sci.Pub.1989)描述的實驗方法使用Nicotiara tabacum var.Samsun進行菸草轉化和完整的植物再生。在含有卡那黴素或其它合適的抗生素的MS培養基上選擇轉化事件。可選擇地在在膦絲菌素上進行選擇。通過PCR確定整合的轉基因的存在。再生植物並使其長到成熟並自交產生種子。使用Northern和/或Western分析來確定脫乙醯酶的組織特異性表達。所選植物是自花能稔的但具有條件性雌性不育的條件。將T1代的種子播種到地裡。當植物長到足夠大時通過PCR就轉基因的存在對其進行檢測。將PCR陽性植物轉移至溫室中。在沒有外源施用膦絲菌素的情況下這些植物是完全能育的。以各種量和在各生長階段用DL-膦絲菌素或L膦絲菌素處理這些(假定的)條件性不育植物亞組。對脫乙醯酶基因被確定為PCR陽性的T1植物進行這些處理，或等同地，直接對T0代(無性繁殖所述植物以使可留出各事件的未處理克隆用於種子生產)植物進行這些處理。然後以觀察到的能育性和營養耐受性作為選擇合適的表現最明顯的條件性不育表型的植物系的基礎。例如，可在花形成的早期階段之前或期間以通常0.25和20kg/ha的比例通過葉片噴霧的方式施用膦絲菌素。選擇未顯示受傷害的植物和收集來自經處理的植物的花粉並檢驗生存力。獲取在以高達5kg/ha的膦絲菌素處理比例下顯示相對未受損害的植物，其在用膦絲菌素處理後產生相對少的種子或無種子但在相同的處理條件下卻產生接近正常水平的有活力的花粉。對照植物是轉基因和非轉基因植物並且生長在同一條件下和同一的物理處理方案(除了處理溶液是水或formulant)下。其它的對照植物是用構建體轉化的轉基因植物，所述構建體類似於上面所描述的構建體並且包含在質體藍素啟動子區域的有效控制之下的PAT基因但不包含脫乙醯酶基因。質體藍素啟動子區域提供了在植物綠色組織中的優選表達。意外地發現，與例如35S啟動子區域不同，該啟動子基本上只在植物的某些組織中表達並且最顯著地在綠色組織中表達，當與PAT基因一起使用時提供了對除草劑DL PPT(即使在超過2kg/ha的比例時)的基本上完全的生殖耐受性。此外，當缺少在花組織中共表達的任何適合的脫乙醯酶的情況下，儘管PAT表達(當在該啟動子區域的控制之下表達時)水平在許多至關重要的花組織中非常低或不存在，但質體藍素/PAT基因組合提供了基本完全的生殖耐受性而無顯著的產量損失。
實施例2.依賴於外源施用膦絲菌素的條件性雄性不育的菸草植物獲得的脫乙醯酶和PAT編碼序列與前面實施例1中的一樣。
通過使用引物進行PCR從菸草基因組DNA中克隆TA29啟動子區域(Kriete等人(1996)Plant J.，9，808-818)，所述引物是5′-AACTGCAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3′(SEQ ID #1)和5′-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAAAAC-3′(SEQ ID #2)。通過一系列的限制性酶切割和亞克隆步驟，將所獲得的PCR片段置於脫乙醯酶編碼序列的上遊並將nos轉錄終止子加入到所述編碼區域的3』。然後以合適的限制性片段克隆、獲得所得的TA29-脫乙醯酶-nos終止子表達盒並將其克隆入實施例1中的二元載體中。
可選擇地，以合適的限制性片段(例如BamH1，Bgl/II，其中設計合成的編碼序列的變體以除去內部的限制性位點)克隆脫乙醯酶編碼序列區域並通過以有義構型插入(例如)二元載體pROK1(Baulcombe等人(1986)Nature，321，446-449)的BamH1位點將其與CaMV 35S啟動子和胭脂鹼合酶終止子區域融合。然後切割攜帶35S啟動子的EcoR1-BamH1片段並用來自攜帶TA29s啟動子區域片段(-810至+54)的pAP30(Kriete等人(1996)The Plant Journal 9，809-818)的EcoR1-BamH1片段取代。根據編碼的蛋白質序列，所得載體可稱為pGKTA29_argE_deac、pGKTA29_Streptomyces_deac等。
如在實施例1中，用於轉化的DNA構建體除了包含編碼脫乙醯酶的DNA序列(所述序列在組織特異性雄花啟動子區域例如『TA29』的有效的表達控制之下)外，也包含編碼膦絲菌素N-乙醯轉移酶基因例如『PAT』基因的DNA序列，所述序列在啟動子區域例如來自質體藍素基因的啟動子區域(在該情況下所述區域來自Pisumsatiyum質體藍素基因)有效控制之下。
通過農桿菌用載體轉化菸草植物材料並以前面實施例中描述的類似方式再生轉基因植物。所產生的植物是自花能稔的但也是條件性雄性不育的。將T1代的種子播種在土壤中。當幼苗長到充分大時通過PCR就轉基因的存在對其進行檢測。將PCR陽性的植物移入溫室。這些植物在沒有外源施用除草劑的情況下是完全能育的。以不同的量和在不同的生長階段用膦絲菌素處理這些假定的條件性不育T1植物亞組或可選擇地處理T0『事件』的幼苗(直接從轉化體中再生的)。在處理T0植物時對其進行無性繁殖以留出所述事件的未處理娣妹成員用於種子生產。然後以觀察到的對除草劑的營養耐受性和觀察到的雄性能育性作為選擇合適的、表現最顯著的條件性不育表型的植物系的基礎。例如，可在花形成的早期階段之前或期間以通常0.25和20kg/ha之間的比例通過葉片噴霧的方式施用膦絲菌素。
在另一可選擇的實施方案中，所使用的花啟動子區域是來自金魚草的tap1基因(Spena等人(1992)，Theor.Appl.Genet.，84，520-527)上遊的2.2kb區域(EMBO號X57295)。
收集來自經處理的植物的花粉並檢驗其存活力。獲取不散發花粉或散發相對很少花粉和/或無存活力的花粉的植物。對從一些經處理的植物中收集的花粉進行檢驗並發現其是畸形和無存活力的。然而，這種雄性不育植物保持雌性能育，並且當用收集自其它未處理的非轉基因或條件性雌性不育菸草植物的花粉授粉時產生(雜交)種子。對照植物包括轉基因和非轉基因植物並且生長在同一條件下和同一物理處理方案(除了處理溶液是水或formulant)下。
實施例3.能夠優選地在穀物的雄性生殖結構中表達並編碼能夠水解N-乙醯L膦絲菌素的脫乙醯酶的嵌合基因。
如實施例1中所描述的獲取編碼脫乙醯酶基因的DNA序列，任選地，其被密碼子最優化以用於在穀物中表達。
在一個特定的實施例中，使用了USP 5470359中的花葯特異性SGB6啟動子區域SEQ ID NO1。將含有從pSGB6g1(USP 5470359)亞克隆的3kb基因組EcoR1-Nhe1片段的pSGBNE1進一步亞克隆以將1558bp的ApaII/XbaI平端片段在SmaI位點克隆入bluescript ks。通過進一步的限制性酶切割和克隆步驟將該片段以符合讀碼框的方式融合到所述脫乙醯酶DNA編碼序列的上遊。在所述編碼序列的3』加上nos終止子以建立可選擇的包含可選擇的SGB6-脫乙醯酶-nos表達盒的Bluescript sk質粒，pBLB6_argE_deac、pBLB6_Streptomyces_deac。
在類似的實施例組中，類似地也將來自水稻的RA8花葯特異性啟動子區域(EMBL/genbank檢索號AF042275；Jean Js等人(1999)PMB，39，35-44)以符合讀碼框的融合方式融合到一個或其它編碼脫乙醯酶的DNA序列的上遊並在編碼序列的3』加上nos終止子，從而產生一系列包含可選擇的RA8-脫乙醯酶-nos表達盒的bluescript sk載體。
任選地，如在實施例1和2中的一樣，在轉化入穀物之前，將本實施例的嵌合基因整合到單個載體中，所述載體也包含在質體藍素(或類似地，主要在綠色組織中指導表達的啟動子區域)有效的表達控制之下的嵌合PAT基因。
可選擇地，用分開的載體轉化所述穀物組織，一個包含質體藍素/PAT基因嵌合基因，另一個包含花啟動子/脫乙醯酶嵌合基因，再生和選擇植物。
實施例4.優選地在穀物的雌性生殖結構中表達並編碼能夠水解N-乙醯L膦絲菌素的嵌合基因。
如實施例1中所描述的，獲取編碼脫乙醯酶基因的DNA序列，任選地，對其進行密碼子最優化以用於在穀物中表達。
按照Budapest協議的條款在1998年2月27日在NRRL以保藏號NRRL B-21920保藏基因組克隆pSH64。經檢測其為與穗絲特異性cDNA克隆B200i4-2(WO98/39462)雜交的基因組克隆。如下構建優選地在雌性生殖結構中表達的嵌合基因。如WO 98/39462所描述的，構建類似於具有『空』表達盒的pSH70的bluescript ks來源的質粒，所述質粒從5』至3』包含由WO98/39462的SEQ ID No 11的核苷酸1-3790構成的B200i 5′啟動子區域、BamH1位點和包含WO 98/39462中的SEQ ID No 11的核苷酸4427-6397的B200i 3′非翻譯終止區域。使用部分BamH1降解，或可選擇地通過進一步亞克隆，PCR和連接步驟，將可選擇的脫乙醯酶編碼序列連接入BamH1位點或其附近的位點以使其正好在B200i啟動子的3』和B200i終止子區域的5』。由此，建立編碼可選擇的B200i-D-胺基酸氧化酶-B200i表達盒的bluescript載體pBLB200_argE_脫乙醯酶等。
可選擇地，如WO 98/39462中所描述的，將P19基因5』啟動子區域的Pst I/Nco I片段從基因組克隆X2-1中切割出來，所述基因組克隆X2-1是按照Budapest協議的條款在1998年2月27日在NRRL以保藏號B-21919保藏的克隆。WO 98/39462中的SEQ ID No 14的核苷酸的1088位Nco I對應於P19基因的ATG翻譯起始位點。通過使用合適的亞克隆、限制性酶切割、連接和PCR步驟將該片段連接以和一個或其它編碼脫乙醯酶的DNA序列形成符合讀碼框的融合體，並在所述編碼序列的3』加上nos終止子序列。由此，建立了編碼可選擇的P19-脫乙醯酶-nos表達盒的一系列bluescript載體。可選擇地，使用相似的標準方法，獲得具有取代P19啟動子區域的P26基因的5』啟動子區域(包含一些或所有WO 98/39462中的SEQ ID No 2的核苷酸1-3987)的類似質粒。如WO 98/39462中所描述的，亞克隆基因組P26-A4克隆即pCIB10302，所述克隆根據Budapest協議的條款在1997年1月21日在the Agricultural Research Service patentculture collection(NRRL)以保藏號NRRL B-21655保藏。由此，建立了編碼可選擇的P19-脫乙醯酶-nos表達盒的一系列bluescript載體pBLP26_Streptomycs_deac等。
實施例5.用於提供(a)雌性近親交配親本系和(b)互補雄性近親交配親本系的方法的成對互補構建體，所述雌性近親交配親本系是依賴於DL膦絲菌素施用的條件性雄性不育，所述互補雄性近親交配親本系是依賴於DL膦絲菌素施用的條件性雌性不育。
適合提供雌性近親交配親本穀物或水稻植物系的第一DNA構建體包含三個基因A)、B)和C)，所述雌性近親交配親本穀物或水稻植物系是依賴於DL膦絲菌素施用的條件性雄性不育。A)由編碼能夠N-乙醯化L-膦絲菌素的PAT酶的DNA序列和合適的終止子區域例如來自nos或35S基因的終止子區域構成，所述編碼PAT酶的DNA序列在來自大麥質體藍素基因(EMBLZ28347)的大約1kb啟動子區域有效控制之下，B)由編碼類似於第一但此時在組織特異性雌花啟動子區域(例如P19或P26)有效控制之下的PAT編碼序列和合適的終止子構成，C)由在實施例1中描述的合適的脫乙醯酶編碼序列和合適的終止子區域構成`，所述脫乙醯酶編碼序列在組織特異性雄花啟動子區域(例如SGB6或RA8)有效控制之下。使用本領域標準的方法和前面實施例提供的信息裝配該構建體。
適合提供雄性近親交配親本穀物或水稻植物系的第二DNA構建體包含3個基因A)、D)和F)，所述雄性近親交配親本穀物或水稻植物系是依賴於DL膦絲菌素施用的條件性雌性不育。A)由編碼能夠N-乙醯化L-膦絲菌素的PAT酶的DNA序列和合適的終止子區域例如來自nos或35S基因的終止子區域構成，所述編碼PAT酶的DNA序列在來自大麥質體藍素基因的啟動子區域有效控制之下，D)由與所述第一DNA序列相似的PAT序列和合適的終止子構成，但此時所述PAT序列在與第一構建體中用於驅動脫乙醯酶表達的相同的組織特異性雄花啟動子區域(例如SGB6或RA8)有效控制之下，F)由實施例1中所描述的合適的脫乙醯酶編碼序列和合適的終止子區域構成，所述脫乙醯酶編碼序列在與第一構建體中用於驅動PAT表達的相同的組織特異性雌花啟動子區域(例如P19或P26)的有效控制之下。使用本領域標準的方法和前面實施例提供的信息裝配該構建體。
本實施例的成對DNA構建體包括例如下列元件構建體1A＝大麥質體藍素啟動子區域→PAT編碼序列，Nos終止子；B＝P26啟動子區域→PAT編碼序列，35S終止子；C＝RA8啟動子區域→脫乙醯酶編碼序列，Nos終止子；構建體2A＝大麥質體藍素啟動子區域→PAT編碼序列，Nos終止子；D＝RA8啟動子區域→PAT編碼序列，35S終止子；E＝P26啟動子區域→脫乙醯酶編碼序列，Nos終止子實施例6.用於小麥轉化的多核苷酸載體前面的實施例描述了通常被克隆入bluescript sk的表達盒的各種嵌合基因構建體。任選地大量製備這些載體以用於直接的DNA轉化，所述載體與共轟擊的選擇標記物例如WO 98/39462中所描述的pSOG35(DHFR/氨甲蝶呤)或pUbi-Hyg(潮黴素磷酸轉移酶/潮黴素)一起用於直接的DNA轉化。優選地，在大量製備後，使用合適的限制性酶線性化所述載體以除去bluescript的氨苄青黴素抗性基因。
任選地，除了使用共轟擊外，通過標準方法進一步對所述bluescript載體進行遺傳工程改造以使其進一步包含植物選擇性標記基因例如卡那黴素抗性、潮黴素抗性、氨甲蝶呤抗性或草甘膦抗性基因，並進行直接使用。在一些上述的實施例中，將PAT基因整合入設計的載體中並且在這些情況下，任選地在轉化後的一些階段可用DL膦絲菌素進行選擇。
可選擇地，在合適的限制性片段內切割表達盒並將其克隆入pIGPD9來源的載體(描述於WO 00/66748的圖12)中。使用這種載體進行轉化避免了將抗生素標記基因轉移到植物中，因為其在細菌中的保持依賴於營養缺陷型his B大腸桿菌突變體的互補作用。所述載體包含表達IGPD(hisB產物)的基因並經進一步的基因工程改造以包含植物選擇性標記物，例如克隆入例如WO00/66748的pZEN16i和pZEN18i的Xma I位點的EPSPS基因。可選擇地使用了在甘露糖或木糖上提供陽性選擇的標記基因(USP 5767378)。
通過使用廠商提供的實驗方案使用Maxi-prep procedure(Qiagen)獲得用於植物轉化的大規模DNA製劑。
實施例7.用多核苷酸轉化/再生小麥，所述多核苷酸包含提供組織特異性表達的PAT和N-乙醯L-膦絲菌素脫乙醯酶的嵌合基因在一個實施例中，將基因型UC703的未成熟胚(長度為0.75-1.0mm)塗布在含有3mg/l 2，4-D和3％蔗糖的MS培養基上。大約4小時後，將胚塗布在含有15％麥芽糖、3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培養基上，所述培養基由用濾紙支持的含有相同組分的瓊脂板覆蓋。在轟擊前使胚進行質壁分離2-3小時。
使用標準方法將如前面的實施例中所描述的方法製備的DNA沉澱在微米尺寸的金微粒上。使用DuPont Biolistics氦氣設備用1100psi的爆破壓轟擊4個靶板(每個靶板含16個胚)二次。在載體臺和靶之間放置80目的阻擋屏並對板進行轟擊。轟擊後，在將載有胚的板放置到含有3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培養基的板上之前，將靶在25℃下於暗處放置24小時。再經過48小時後，將單個胚從板上取出並直接放在相同成分的新鮮培養基上。當以氨甲蝶呤為選擇劑時，在基因遞送大約6周後，將所述組織放置在含有3mg/l 2，4-D、3％蔗糖和0.2mg/l氨甲蝶呤的MS培養基上進行3周。然後將組織置於包含MS培養基的再生培養基中，所述MS培養基含有1mg/l玉米素核苷和1mg/l氨甲蝶呤。2周後，將再生小苗放入滅菌容器中，該容器裝有含有2％蔗糖、1mg/l萘乙酸和4mg/l氨甲蝶呤的半強度MS培養基。根據其它選擇試劑的使用，採用類似方法。
在特定的實施例變體中，包含優選地在雄性生殖結構中表達的嵌合基因的載體與可選擇的選擇性標記基因一起用於共轟擊。因此，例如，製備質粒DNA並將其與pUbiHyg(編碼在玉米聚泛素啟動子有效控制之下的潮黴素磷酸轉移酶的質粒)一起包被在金微粒上，所述質粒包含嵌合基因，其中脫乙醯酶在RA8啟動子區域的有效控制下表達。在這種情況下，除了在轟擊後再生培養基含有在2和20mg/l之間不斷增加的潮黴素濃度外，如上所述進行轉化和再生。
在其它的實施例中，用表達草甘膦抗性EPSP合酶的質粒轉化小麥並使用草甘膦進行選擇，如WO00/66748的實施例15中所描述的進行再生。
從來源於轉化體的植物的葉組織中提取DNA，並進行PCR以檢驗PAT基因、任選地任何另外的選擇標記基因和編碼脫乙醯酶的基因的存在。繁殖PCR陽性植物。在開花期間，收集雌蕊和花葯並製備RNA。通過Northern分析確定DNA表達。此外，使用pET載體在大腸桿菌中表達脫乙醯酶基因並部分純化。從SDS凝膠上切下所表達的蛋白的蛋白帶並用於產生多克隆抗體。通過Western分析將這些抗體用於檢測在花組織和其它組織中的表達。
實施例8.有效地產生雜交穀類作物的方法，其中DL膦絲菌素用於雜草控制和同時用作化學雜交劑，其中由如此產生的雜交種子的F1代雜交植物在營養和生殖上基本上都對DL膦絲菌素的施用具有耐受性。
化學雜交劑很昂貴並且不總是有效。使用相對便宜的物質例如商業除草劑作為化學雜交劑是想要的。這也會產生更好的效果，因為可將雜草控制與化學雜交相結合。然而為了實現這個建議有許多問題需要克服。首先，需要建立對所述的除草劑具有耐受性的雄性和雌性親本系。此外，為了獲得想要的響應除草劑施用的『條件性』能育，需要以這樣的方式對兩個親本系進行基因工程改造，所述方式使得對除草劑的耐受性不擴展到所有組織中，相反，而是以組織特異性的方式表達以使各個所要求的花組織保持選擇性易感性。因此，在一個系(雌性親本系)中，必須使植物的營養部分和雌性組織具有對除草劑施用的耐受性同時雄花組織的某些關鍵部分必須保持對除草劑施用的易感性，而在另一種系(雄性親本系)中，相反地只需要雌配子形成組織的一些關鍵部分保持易感性。即使可以實現這個，仍有許多關於雜交種子和F1代的進一步問題需要克服。根據上述方案，假定該代作物必定包含至少兩個能夠提供針對除草劑的抗性的基因，那麼也需要該相同的除草劑也可在F1代雜交作物中用作選擇性雜草控制劑。然而，很難想像除草劑、組織特異性啟動子區域和耐受基因的組合，所述耐受基因允許在F1代中以和在雜交種子生產過程中使用除草劑一樣的方式使用相同的除草劑。很可能在對F1代施用除草劑後，雜交作物表現營養耐受性但卻產生很少量或不產生穀粒。目前不存在這樣的雜交作物生產系統。舉個概念上的例子，例如草甘膦如何可以以雜交劑和F1代作物選擇性除草劑結合使用可有助於弄清楚內在的困難。對於除草劑草甘膦，通常的抗性機制是表達EPSP合酶的抗性形式。鑑定允許R-EPSPS在所有組織中和在所有時間(除了在雄蕊或柱頭髮育的關鍵階段外)充分表達的啟動子區域或啟動子區域組合是非常困難的。關於這個問題最直接的方式是使用反義或類似的方法，其中R-EPSPS基因的表達由組織非特異性/組成型啟動子驅動，而在例如雄蕊中由於反義EPSPS基因(參見例如WO99/46396)的表達導致只有局部和短暫地抑制。然而，在這種情況下，在雄蕊(或柱頭)中表達的抑制由顯性基因驅動。很清楚，對於任何這樣的機制，對F1代施用除草劑會導致由於存在於F1代雜交植物中的顯性雄性和雌性條件性不育基因的相加效應造成的不育、無產量的作物。
本發明和前面實施例提供的構建體提供了克服使廉價商業除草劑DL膦絲菌素能夠同時用於雜草控制和在雜交穀物生產中用作雜交試劑的問題的方法，此外，所述方法提供了所得的雜交穀物，在所述作物中可安全地將DL膦絲菌素(或L膦絲菌素)用於雜草控制而基本上沒有產量損失。作為其它的有益方面，將更容易管理來自F1代的自交種子(以後可在隨後的作物中產生自生植物)，因為如果噴施控制量的DL膦絲菌素通常可使其自身不育。對於F1代植物與野草(例如紅米)或其它穀類作物的花粉異型雜交的後代也是如此。
在本實施例的生產雜交作物的方法中，PAT基因用於提供針對用作雜交劑的除草劑膦絲菌素的耐受性。當然，將L-膦絲菌素轉化成N-乙醯L-膦絲菌素的PAT基因是已為熟知的並且其商業上用於在作物中提供針對DL膦絲菌素的耐受性。然而，存在許多與PAT基因表達相關的至關重要的特徵，它們體現了本實施例方法的特徵。
首先，PAT基因在質體藍素啟動子區域的有效控制之下表達從而使其基本上只在植物的綠色組織中表達。令人吃驚的是在實驗中發現具有如此表達的PAT基因的小麥基本上在生殖上對以高達至少2kg/ha比例施用的DL膦絲菌素具有耐受性。因此，針對膦絲菌素的生殖耐受性不要求PAT抗性基因在其自身的配子形成組織中大量表達。因此，描述於前面實施例(所述實施例用於提供本實施例的植物)中的構建體的重要特徵是PAT基因(所述基因提供抗性性狀)在啟動子區域的有效控制之下表達，所述啟動子區域提供基本只在綠色組織中的表達。這樣的有用的啟動子區域的特徵在於其應當以這樣的方式表達PAT，所述方式使其充分保護所有非綠色花組織免受葉面施用的DL膦絲菌素的損害，同時在花組織自身中只提供最低水平的PAT表達，特別是在被靶向條件性不育的部分尤其低。PAT在大麥質體藍素啟動子區域的有效控制之下表達似乎符合這種狀況，因為基本上所有噴施的經葉進入的L膦絲菌素在其被轉運到發育中的花組織之前被截住並被轉化成非毒害植物的N-乙醯-L膦絲菌素。因此，在本實施例的方法中，在親本系中導致組織選擇性不育效果的L膦絲菌素只是通過脫乙醯酶的作用從韌皮部流經的非毒害植物的N-乙醯L-膦絲菌素中短暫和局部地產生。
作為本實施例的方法(用於產生雜交作物的方法)特徵的PAT表達的第二特徵是條件性不育的雄性和雌性親本系包含實施例5中描述的構建體1或2。通過將驅動PAT表達的花控制元件與在互補的成對構建體(實施例5)中驅動脫乙醯酶表達的元件進行精確配比，可以確保在F1雜種中，L-膦絲菌素在靶花組織中的瞬間爆發被相應的在相同時間內和相同局部組織中的PAT表達的暴發快速中和。因此，所述除草劑的施用不會在雜種中誘導顯著的對雄性或雌性配子形成組織的不育性效應。然而，在以後的代中，雜種的對應於花的PAT和D胺基酸氧化酶將會分離，從而所得的植物再次成為依賴於控制量的DL膦絲菌素施用的雄性或雌性不育。
在本實施例的方法中，如前面的實施例所描述的將實施例5中所描述的構建體轉化入小麥中或(使用標準的超二元載體方法轉化入水稻中)並選擇轉化體植物和再生成幼苗。選擇T0轉化體事件(使用農民的無性繁殖技術以保持未處理的系)並且可選擇地使用基本上如實施例1和2中所描述的方法選擇適合用於培育雄性近親交配親本系或雌性近親交配親本系的事件，所述雄性近親交配親本系是依賴於DL膦絲菌素施用的條件性雌性不育，所述雌性近親交配親本系是依賴於DL膦絲菌素施用的條件性雄性不育。最好的系表現最好的除草劑耐受性，最少的產量損失，最明顯的條件性不育表型等。選擇可選擇的雄性親本和雌性親本系並任選地與合適的優良系回交多代。全面表徵基因插入物(所述插入物存在於這些最終選擇的事件中)，如對條件性能育和除草劑抗性性狀的遺傳和所表達的基因產物的表徵。
然後以合適的比例在田間將所選擇的雌性和雄性親本系一起間作並以合適的0.05至5kg/ha的比例噴施DL膦絲菌素直至開花早期(選擇以最優化雜交種子的產量)。所產生的種子具有有利方面其可長出不僅受益於雜種優勢而且對含有DL膦絲菌素的除草劑製劑具有耐受性的植物，從而可使用DL膦絲菌素在作物中選擇性控制雜草。所述雜交種子也具有有利方面其表達的除草劑耐受性性狀僅能部分地傳遞給之後的自交代或異型雜交入相關的雜草中。因此，例如，由本發明產生的雜交水稻可在使用DL膦絲菌絲作為雜草控制劑的情況下生長而無明顯的產量損失。然而作為來自雜交水稻的花粉與紅米雌性親本的異型雜交後代的紅米植物的後代，其在營養生長上對DL膦絲菌素的處理具有耐受力但卻具有減少的自稔性(歸因於花組織中脫乙醯酶的表達)，從而產生很少的穀粒。類似地，在噴施DL膦絲菌素後，從雜種作物中長出的的第二代自生水稻或小麥絕大部分不產生穀粒。
序列表212DNA213人工序列220
223引物4005aactgcagct ttttggttag cgaatgc27210621135212DNA213人工序列220
223引物4006cagactagtt ttagctaatt tctttaagta aaaac 3權利要求
1.產生雄性或雌性不育植物的方法，其包括提供用於使除草劑失活的手段和用於再激活如此失活的除草劑的手段，其中在營養組織中提供所述使除草劑失活的手段而在植物的雄性或雌性生殖結構中提供所述再激活手段，這樣當對植物施用除草劑時，保護了營養結構，但不是生殖結構，免受除草劑的毒害植物的活性。
2.權利要求1的方法，其中所述手段是酶。
3.權利要求1或2的產生雄性或雌性不育植物的方法，其包括步驟用編碼第一酶和第二酶的多核苷酸轉化植物材料和將所轉化的材料再生成植物，所述第一酶能夠N-乙醯化L-膦絲菌素，第二酶能夠水解N-乙醯L-膦絲菌素或從N-乙醯L-膦絲菌素除去乙醯基團以產生L-膦絲菌素，其中所述第一酶只在植物綠色組織中表達，其中對植物的葉施用L膦絲菌素除草劑直到雄或雌配子形成和/或成熟時期，這樣所述植物基本上不受施用的除草劑損害，其中第二酶優選地在雄性或雌性生殖結構中表達，從而在這些組織中選擇性地局部再生L-膦絲菌素，這阻止了所述配子的形成，或使其喪失功能。
4.前面權利要求的方法，其中所述第一酶是膦絲菌素乙醯轉移酶(PAT)而所述第二酶是醯胺酶或水解酶。
5.前面權利要求中任意一項的方法，其中L-膦絲菌素與D-膦絲菌素和/或至少一種選自下列的化合物一起混合施用安全劑、殺配子劑、穀胱甘肽-S-轉移酶誘導劑、細胞色素P450誘導劑或抑制劑、除草劑、肥料、殺線蟲劑、增效劑、殺蟲劑、殺真菌劑、激素和植物生長調節劑。
6.權利要求4或5中任一項的方法，其中所述PAT酶在質體藍素啟動子的表達控制之下。
7.權利要求4至6中任一項的方法，其中所述PAT酶另外地在雄性或雌性特異性花啟動子的控制之下表達，從而使所述酶只存在於綠色組織和除了使配子在其中失去功能的生殖組織以外的生殖組織中。
全文摘要
產生雄性或雌性不育植物的方法，其包括提供用於使除草劑失活的手段和用於再激活如此失活的除草劑的手段，其中在營養組織中提供所述使除草劑失活的手段而在植物的雄性或雌性生殖結構中提供所述再激活性手段，這樣當對植物施用除草劑時，保護營養結構，但不是生殖結構，免受除草劑的毒害植物的影響。
文檔編號C12N15/82GK1823167SQ200480019859
公開日2006年8月23日 申請日期2004年6月9日 優先權日2003年7月10日
發明者T·R·豪克斯 申請人:辛根塔有限公司