一種快速檢測生物胺的方法

2023-10-10 01:40:09

專利名稱：一種快速檢測生物胺的方法
技術領域：
本發明屬於色譜分析領域，具體為ー種快速檢測生物胺的方法。
背景技術：
生物胺是ー類含氮的脂肪族或雜環類低分子化合物，在含有蛋白或游離胺基酸的食品和飲料中發現較多。它廣泛存在於各種動植物的組織之中，具有重要的生理活性。低濃度的生物胺對血管和肌肉有明顯的舒張或收縮作用，能抑制癲癇的發作，對精神活動和大腦皮層有重要的調節作用，對心臟有不同程度的正性肌力和正性頻率作用。但是，當人體吸收過量的生物胺時，可能會引起頭痛，呼吸紊亂、心悸血壓變化等過敏性反應。生物胺的毒性作用會引起食品的安全問題。其中組胺對人類的健康的影響最大， 其次是酪胺。美國FDA通過對爆發組胺中毒的大量數據的研究確定組胺的危害作用水平為500mg/kg (食品)。歐美及我國對部分食品中組胺含量做了限量要求美國FDA要求進ロ水產品組胺不得超過50mg/kg ;歐盟規定鯖科魚類中組胺含量不得超過100mg/kg ;其它食品中組胺不得超過1000mg/kg ;酪胺不得超過100 800mg/kg ;我國規定始魚中組胺不得超過1000mg/kg ;其他海水魚不得超過300mg/kg。基於生物胺在食品中廣泛存在以及潛在的安全性問題，對生物胺進行檢測具有重要意義。生物胺本身沒有螢光和紫外的發色集団，因此都要經過衍生化才能在色譜儀器下檢測出來。丹磺醯氯作為液相色譜柱前衍生試劑具有衍生操作簡單、衍生物穩定性好、可定量完成磺醯化反應、有較強的螢光和紫外吸收、靈敏度高、反應範圍寬、集體幹擾不明顯等優點，所以成了生物胺高效液相色譜檢測中最多的衍生試劑。目前，國內外研究對生物胺的檢測方法包括酶生物傳感器法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、電泳法等。生物胺的定性和定量分析方法雖然能在準確度、精密度等方面已經隨著分析儀器的進步達到了一定水平，但儀器分析方法耗時長、操作複雜、造價高。因此研究快速、簡便、低廉的分析方法十分必要。本研究提供了在食品質量監測方面生物胺的半定量技木，為判別其安全性提供了快速分析方法。

發明內容
針對現有檢測生物胺技術的不足之處，本發明的目的是提出ー種快速檢測生物胺的方法。實現本發明目的的技術方案為一種檢測生物胺的方法，包括步驟將生物胺標準品和待檢測樣品用衍生劑衍生化後帶上發色基團，於層析材料聚醯胺薄膜上點樣，用展開劑展開，在展開劑前沿距薄膜頂端0. 5 Icm時停止層析,顯色,觀察顯色結果。其中，所述生物胺是苯こ胺、腐胺、組胺、酪胺、色胺、屍胺、精胺、亞精胺中的ー種。其中，所述生物胺標準品和待檢測樣品的pH值調節為9. 4 10. O。其中，所述衍生劑為丹磺醯氯。
其中，所述衍生化的條件為生物胺標準品和待檢測樣品分別和等量衍生劑振蕩混勻後於58 65°C下反應25 35min。其中，所述點樣是在層析材料上點樣5 12yし其中，所述展開劑為體積比配比的ニ甲苯冰醋酸=5 20 I的混合物，展開步驟是在該展開劑中進行。優選地，所述展開劑為體積比配比的ニ甲苯冰醋酸=10 I的混合物。其中，所述顯色是層析後的生物胺標準品和待檢測樣品在250 280nm紫外線照射下，出現黃緑色斑點。其中，所述顯色結果的觀察，包括步驟在紫外線下肉眼觀察，如果在比移值0. 5 0. 7之間同時觀察到待測樣品與標準品比移值位置相同的黃緑色的斑點，則認為待 測樣品中含有該種生物胺，然後將層析斑點與標準品比較進行半定量分析；如果在比移值0. 5 0. 7之間沒有觀察到待測樣品與標準品比移值位置相同的黃緑色斑點，則認為待測樣品中不含有該種生物胺。本發明的有益效果在幹本發明首次提出使用聚醯胺薄膜作為生物胺的層析測定材料，此材料方便易得，展開迅速，展開後的薄層板可以長期保存以備複查，且可以應用薄層掃描儀進行定量測定；利用適當配比的展開劑，可以完全分離目標物與其他組分，因此本方法可以對生物胺實現快速定性、半定量檢測，該方法全過程約為Ih即可以得到結果，而儀器分析需時較長。食品、酒中含量較高的生物胺有苯こ胺、腐胺、組胺、酪胺等，通過聚醯胺薄膜層析對其進行半定量檢測方便快速。


圖I為顯色結果的照片。圖中淺色的斑點從左到右依次為生物胺混標、DNS-Cl (丹磺醯氯)衍生的葡萄酒樣品、1/2的DNS-Cl (丹磺醯氯)衍生的葡萄酒混合1/2的腐胺(100mg/L)的顯色結果。
具體實施例方式現以以下最佳實施例來說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例I :用0. IM鹽酸配製成質量濃度為5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L的腐胺溶液，取標準溶液和待檢測的葡萄酒樣品各lmL，以2M NaOH調節pH值至9. 4 10. 0，加入ImL丹磺醯氯衍生劑(5mg/L丙酮)，振蕩混勻。置於60°C下反應30min(期間振蕩3 8次)。用微量點樣器在在IOcmXlOcm的層析材料聚醯胺薄膜上點樣IOy L，將點完樣吹乾的聚醯胺薄片光滑面向外，聚醯胺面向內，用皮筋扎住，垂直放入密閉的、裝有飽和展開劑(ニ甲苯冰醋酸=10 I)的展開缸中上行展開，展開缸內的平衡溶劑即為展開劑在密閉的展開缸內混合靜置得到的。在展開劑前沿距薄膜頂端0. 5 Icm時停止層析，揮幹溶劑，可以實現目標化合物與雜質完全分離，在280nm紫外檢測燈下顯色後肉眼直接觀察。展開距離約為4. 5cm，在比移值0. 5 0. 7之間同時觀察到待測樣品與標準品比移值位置相同的黃緑色螢光斑點。與定量點於同一薄層板的腐胺標準品比較，可以觀察到該酒樣中腐胺螢光亮度高於5mg/L而低於15mg/L腐胺標準品(如圖I所示)，初歩判斷該酒樣中腐胺含量接近於10mg/L，遠低於國內外對食品中生物胺的限量。實施例2 用0. IM鹽酸配製成質量濃度為5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L的組胺溶液，取標準溶液和待檢測的啤酒樣品各lmL，以2M NaOH調節pH值至9. 4，加入ImL丹磺醯氯衍生劑(5mg/L丙酮)，振蕩混勻。置於65°C下反應25min(期間振蕩5次)。用微量點樣器在在IOcmXlOcm的層析材料聚醯胺薄膜上點樣5 ii L,將點完樣吹乾的聚醯胺薄片光滑面向外，聚醯胺面向內，用皮筋扎住，垂直放入密閉的、裝有飽和展開劑(ニ甲苯冰醋酸=10 I)的展開缸中上行展開，在展開劑前沿距薄膜頂端0.8cm時 停止層析，揮幹溶劑，在254nm紫外檢測燈下顯色。展開距離約為4. 5cm，在比移值0. 5
0.7之間同時觀察到待測樣品與標準品比移值位置相同的黃緑色斑點。與定量點於同一薄層板的腐胺標準品比較，可以觀察到該酒樣中組胺斑點亮度低於5mg/L，半定量判斷該酒樣中組胺含量接近於5mg/L。實施例3 用0. IM鹽酸配製成質量濃度為5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L的酪胺溶液，取標準溶液和待檢測的白酒樣品各lmL，以2M NaOH調節pH值至10. 0，加入ImL丹磺醯氯衍生劑(5mg/L丙酮)，振蕩混勻。置於58°C下反應35min(期間振蕩3次)。用微量點樣器在在IOcmXlOcm的層析材料聚醯胺薄膜上點樣12 y L，將點完樣吹乾的聚醯胺薄片光滑面向外，聚醯胺面向內，用皮筋扎住，垂直放入密閉的、裝有飽和展開劑(ニ甲苯冰醋酸=10 I)的展開缸中上行展開，在展開劑前沿距薄膜頂端Icm時停止層析，揮幹溶劑，在280nm紫外檢測燈下顯色。展開距離約為4. 5cm，在比移值0. 5 0. 7之間同時觀察到待測樣品與標準品比移值位置相同的黃緑色螢光斑點。與定量點於同一薄層板的酪胺標準品比較，可以觀察到該酒樣中酪胺螢光亮度低於5mg/L，半定量判斷該酒樣中酪胺含量接近於5mg/L。實施例4:待測樣品為豆醬IOg,粉碎研磨,溶於0. IM鹽酸溶液,定容至100ml。用0. IM鹽酸配製成質量濃度為5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L的屍胺溶液，取標準溶液和待檢測的豆醬樣品各lmL，以2M NaOH調節pH值至9. 8，加入ImL丹磺醯氯衍生劑(5mg/L丙酮)，振蕩混勻。置於60°C下反應30min(期間振蕩5次)。用微量點樣器在在IOcmXlOcm的層析材料聚醯胺薄膜上點樣IOy L，將點完樣吹乾的聚醯胺薄片光滑面向外，聚醯胺面向內，用皮筋扎住，垂直放入密閉的、裝有飽和展開劑的展開缸中上行展開，在展開劑前沿距薄膜頂端Icm時停止層析，揮幹溶剤，在280nm紫外檢測燈下顯色。展開距離約為4. 5cm，在比移值0. 5 0. 7之間同時觀察到待測樣品與標準品比移值位置相同的黃緑色螢光斑點。與定量點於同一薄層板的屍胺標準品比較，可以觀察到該樣品中屍胺螢光亮度約相當於5mg/L標準品的亮度，半定量判斷該樣品中屍胺含量接近於5mg/L,即豆醬中屍胺含量約為0. 05mg/g。以上的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案作出的各種變型和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護範圍內。
權利要求
1.一種檢測生物胺的方法，包括步驟將生物胺標準品和待檢測樣品用衍生劑衍生化後帶上發色基團，於層析材料聚醯胺薄膜上點樣，用展開劑展開，在展開劑前沿距薄膜頂端0.5 Icm時停止層析,顯色,觀察顯色結果。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述生物胺是苯乙胺、腐胺、組胺、酪胺、色胺、屍胺、精胺、亞精胺中的一種。
3.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述生物胺標準品和待檢測樣品的PH值調節為9. 4 10. O。
4.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述衍生劑為丹磺醯氯。
5.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述衍生化的條件為生物胺標準品和待檢測樣品分別和等量衍生劑振蕩混勻後於58 65°C下反應25 35min。
6.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述點樣是在層析材料上點樣5 12iiL。
7.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述展開劑為體積比配比的二甲苯冰醋酸=5 20 I的混合物，展開步驟是在該展開劑中進行。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述展開劑為體積比配比的二甲苯冰醋酸=10 I的混合物。
9.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述顯色是層析後的生物胺標準品和待檢測樣品在250 280nm紫外線照射下，出現黃綠色斑點。
10.如權利要求I 9任一所述的方法，其特徵在於，所述顯色結果的觀察，包括步驟在紫外線下肉眼觀察，如果在比移值0. 5 0. 7之間同時觀察到待測樣品與標準品比移值位置相同的黃綠色的斑點，則認為待測樣品中含有該種生物胺，然後將層析斑點與標準品比較進行半定量分析；如果在比移值0. 5 0. 7之間沒有觀察到待測樣品與標準品比移值位置相同的黃綠色斑點，則認為待測樣品中不含有該種生物胺。
全文摘要
本發明提供一種快速檢測生物胺的方法，包括步驟將生物胺標準品和待檢測樣品用衍生劑衍生化後帶上發色基團，於層析材料聚醯胺薄膜上點樣，用展開劑展開，在展開劑前沿距薄膜頂端0.5～1cm時停止層析，顯色，觀察顯色結果。本發明提出使用聚醯胺薄膜作為生物胺的層析測定材料，此材料方便易得，展開迅速，展開後的薄層板可以長期保存以備複查，且可以應用薄層掃描儀進行定量測定；利用適當配比的展開劑，可以完全分離目標物與其他組分，因此本方法可以對生物胺實現快速定性、半定量檢測，該方法全過程約為1h即可以得到結果，而儀器分析需時較長。
文檔編號G01N30/94GK102650628SQ20121015696
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月18日 優先權日2012年5月18日
發明者段長青, 潘秋紅, 田園, 黎姍姍 申請人:中國農業大學