丁香酚在製備治療沙門氏菌感染藥物中的應用的製作方法
2023-10-06 10:28:49 1
本發明涉及丁香酚在製備治療沙門氏菌感染藥物中的應用，屬於醫藥領域。
背景技術：
丁香酚，分子式為C10H12O2，是無色或蒼黃色液體，有強烈的丁香香氣，不溶於水。天然的丁香酚主要用富含丁香油的桃金孃科植物丁香的乾燥花蕾經蒸餾所得的揮髮油.再經過萃取，酸化，中和，精餾等步驟而得。合成法製備丁香酚，用愈創木酚為原料，採用烯丙基氯、烯丙醇等直接烯丙基化而得。主要用於抗菌,降血壓；也可用於香水香精以及各種化妝品香精和皂用香精配方中，還可以用於食用香精的調配。但是目前國內外未見丁香酚用於抗沙門氏菌感染的報導。
革蘭氏陰性菌沙門氏菌包含2500種血清型，比如鼠傷寒沙門氏菌，腸炎沙門氏菌和傷寒沙門氏菌等等。這種兼性胞內寄生菌能夠感染人，動物和植物，已為全世界帶來了巨大的經濟損失。作為人類最常發生的食源性疾病，沙門氏菌病通常是由汙染的水源和食物所引起的。沙門氏菌的機制闡述一直是一個熱門話題。沙門氏菌致病性所在的毒立基因主要位於染色體和質粒上，那些位於染色體上的與毒力相關基因稱為毒力島（SPIs）。SPIs上的基因一般具有較低的G+C含量，這也是SPIs基因的標誌，並且他們對於沙門氏菌的進化具有重要作用。目前，已發現的SPIs已經多於10個，而SPI-1是其中研究的比較全面的。SPI-1位於染色體中心63鹼基處，由約40個基因組成，其G+C含量為44.97%。由於SPI-1在沙門氏菌入侵過程中起重要作用，它在沙門氏菌的毒力中扮演非常重要的角色。目前國內針對沙門氏菌的感染，普遍採用抗生素進行治療。但應用抗菌藥物並不能縮短病人的病程，反而促使腸道產生耐藥菌株，使排菌時間延長，造成治療上的困難。傳統抗生素的濫用以及其不可避免的易誘導耐藥性等因素導致了近年來沙門氏菌耐藥性逐漸增強，耐藥譜逐漸加寬。這種現象的發生對於臨床上抗沙門氏菌感染的治療雪上加霜。因此臨床上亟待研發全新機制的抗感染藥物來預防和治療沙門氏菌感染。
技術實現要素：
丁香酚的分子結構如下：
本發明通過人宮頸癌細胞（Hela）損傷的保護性試驗以及小鼠沙門氏菌感染模型證實其在抗沙門氏菌感染中的作用。
附圖說明
附圖1：丁香酚對沙門氏菌三型分泌系統功能的影響(陽性對照)
附圖2：丁香酚對沙門氏菌三型分泌系統功能的影響(陰性對照)
附圖3：丁香酚對沙門氏菌三型分泌系統功能的影響(藥物處理組)
附圖4：丁香酚對沙門氏菌生長的影響分析
附圖5：丁香酚對沙門氏菌內化的影響
附圖6：丁香酚對沙門氏菌三型分泌系統主要效應蛋白SipA量的分析
附圖7：丁香酚對沙門氏菌感染小鼠的保護率
附圖8：丁香酚抑制沙門氏菌感染小鼠引起的體重下降
附圖9：丁香酚對沙門氏菌感染小鼠靶器官菌落定殖量計數
附圖10：丁香酚對沙門氏菌感染小鼠靶器官IL-1β分泌量的影響
附圖11：丁香酚對沙門氏菌感染小鼠靶器官IL-6分泌量的影響
附圖12：丁香酚對沙門氏菌感染小鼠靶器官TNF-α分泌量的影響
具體實施方式
1、沙門氏菌三型分泌系統功能的檢測試驗
本實驗通過體外構建SL1344-TEM-SipA重組菌，將丁香酚和SL1344-TEM-SipA菌株在37℃200rpm共同孵育4h，以Hela細胞為載體，以MOI=50向細胞加入藥物處理組和未處理中的菌液，陰性對照加入DMEM，37℃條件下感染30min。使用PBS清洗細胞三次，隨後加入CCF4螢光底物通過螢光顯微鏡觀察細胞的顏色變化，檢測丁香酚對沙門氏菌三型分泌系統功能的檢測。實驗結果表明，丁香酚顯著抑制沙門氏菌三型分泌系統的功能。丁香酚處理後，沙門氏菌三型分泌系統效應蛋白的分泌量顯著減少（見圖1，圖2，圖3）。
2、生長曲線的測定
將沙門氏菌於LB液體培養基內過夜培養（37℃,200rpm）,1:100擴大培養至OD600nm值為0.1左右，分別設定陽性組、陰性對照組和加藥組。繼續培養，並且每隔30min測定其各個樣品的光密度值，直至平臺期。實驗結果表明：丁香酚在抑制沙門氏菌功能的有效作用濃度下並不影響沙門氏菌的生長（見圖4）。
3、慶大保護性試驗
分別向沙門氏菌SL1344菌液內加入終濃度為0,0.1,0.2mM的丁香酚，並以SL1344InvA敲除株作為對照，37℃，200rpm共同孵育4h共，以Hela細胞為載體，MOI=50感染細胞，37℃條件下感染45min。使用PBS清洗細胞三次，向細胞培養體系內加入慶大黴素共同作用1h，使用PBS清洗細胞三次，收集細胞並用皂素裂解細胞，倍比稀釋塗於固體培養基，進行菌落計數。實驗結果表明：野生型沙門氏菌在不同藥物濃度處理下的侵入率逐漸下降，且呈現藥物劑量依賴性（見附圖5）。
4、三型分泌系統效應蛋白SipA蛋白免疫印跡試驗
分別向沙門氏菌SL1344菌液內加入終濃度為0、0.1,0.2，0.4mM的丁香酚，37℃，200rpm共同孵育4h，使用紫外分光光度計測定其OD600的吸光值，收集相同的菌量。沉澱使用相同體積的SDS-PAGE Buffer垂懸，隨後煮沸5min。將沉澱樣品用於Western-Blot分析。實驗結果表明：丁香酚處理導致SipA蛋白水平顯著下降。左圖為菌體內的SipA量的變化，右圖為點樣對照異檸檬酸脫氫酶（ICDH）（見附圖6）。
5、小鼠沙門氏菌感染的治療學研究
5.1建立小鼠沙門氏菌感染模型
使用鏈黴素處理6-8周齡小鼠，感染前對其禁水6h，採用口服感染的方式灌服沙門氏菌，建立沙門氏菌感染動物模型。保護率試驗、病理學試驗口服給予5×107個菌量。
5.2保護率實驗
以5×107個菌量感染小鼠，並於感染後6h給予50mg/kg體重的丁香酚進行藥物治療，平均12h/次，治療5天。統計小鼠感染沙門氏菌24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h後的死亡個數，計算死亡率。結果表明，陽性組小鼠分別在5-8天相繼死亡，在感染後8天全部死亡，死亡率為100%，而給藥組小鼠分別在第八天和第九天各死亡兩隻，死亡率為40%，保護率達到了60%（見附圖7）。
5.3體重監測試驗
以5×107個菌量感染小鼠，並於感染後6h給予50mg/kg體重的丁香酚進行藥物治療，平均12h/次，治療5天。統計小鼠感染沙門氏菌24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h後的體重數據。實驗結果表明：通過分析不同組小鼠的體重變化，發現給藥後可以顯著的緩解沙門氏菌感染小鼠的體重下降（見附圖8）。
5.4靶器官菌落定殖量計數和腸道炎症因子檢測
以5×107個菌量感染小鼠，並於感染後6h給予50mg/kg體重的丁香酚進行藥物治療，平均12h/次，治療5天。於第六天處死小鼠，摘取小鼠的盲腸，組織研磨盲腸組織，製備10%的組織勻漿液，其中部分勻漿液倍比稀釋後塗鏈黴素平板並計數，另一部分勻漿液離心去勻漿液上清，使用ELISA試劑盒測定器官裂解液中IL-1β，IL-6和TNF-α的含量。實驗結果表明：丁香酚藥物處理組，其盲腸組織內沙門氏菌的菌落定植量顯著減少（見附圖9）。丁香酚藥物處理後，其盲腸組織內細胞因子含量較陽性組顯著降低（見附圖10,圖11,圖12）。
綜上所述，本研究以沙門氏菌感染哺乳動物細胞，建立細胞感染水平的藥物保護效果評價模型。以口服感染沙門氏菌的方式成功建立了沙門氏菌動物感染模型，並且發現丁香酚可顯著降低沙門氏菌感染小鼠的死亡率，緩解沙門氏菌感染小鼠的腸道炎症並抑制感染小鼠體重的下降，表明丁香酚治療後可明顯改善沙門氏菌感染小鼠的腸道炎症反應。