噬菌體展示抗原克隆生物標誌物的方法

2023-10-05 16:12:59 2

專利名稱：噬菌體展示抗原克隆生物標誌物的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域。具體涉及噬菌體展示技術。
背景技術：
用噬菌體載體克隆抗原基因做為生物標誌物時，被克隆的抗原基因與載體噬菌體的基因連在一起，形成融合蛋白基因。融合蛋白基因表達後包裝形成噬菌體顆粒，被克隆的抗原基因的表達產物就被展示在重組噬菌體顆粒表面。重組噬菌體顆粒可被點在生物晶片或其它承載介質上，抗原便可在承載介質上與加入的抗體發生特異雜交反應並在儀器終端生成圖像信號數據。在將重組噬菌體顆粒點在生物晶片或其它承載介質上的時候，點樣量常常難以準確控制，同一點樣批次的點樣量差距不會太大，但不同點樣批次的差距會較大。 這就需要一種可以消除這些差距引起的誤差的方法。現有的方法常常在加入與克隆的抗原基因相對應的抗體(如血清)和標記的抗原基因抗體的抗體的同時，加入噬菌體抗體及標記的噬菌體抗體的抗體以定量校正不同的點樣點(加樣點)的點樣量(加樣量)。比如，用抗原重組噬菌體展示技術結合生物晶片技術開發人類癌症檢測標誌物時，現有的定量校正方法就是在加入受檢者的血清和標記的IgG 的抗體的同時，加入適量的噬菌體抗體及標記的噬菌體抗體的抗體。噬菌體引發的的信號強度與抗原蛋白引發的信號強度相對值就可以用來消除各個點樣點之間因點樣量不同引起的誤差。現有的方法有時會出現定量校正不準確的情況。在加入受檢者的血清的同時，加入適量的噬菌體抗體進行定量校正，在噬菌體抗體不能與抗原克隆產生相互交叉非特異性雜交反應，或者在血清抗體與噬菌體抗體不產生空間排斥的情況下是有效的；但當噬菌體抗體能與抗原克隆產生相互交叉非特異性雜交反應或者在血清抗體與噬菌體抗體能產生空間排斥(空間阻礙)的情況下，就會產生誤差。如果所用抗原克隆種類非常多(如幾十種、幾百種、或幾千種)，這種非特異性雜交反應就很難避免，導致所得結果出現誤差。

發明內容
本發明的目的在於提供一種噬菌體展示抗原克隆生物標誌物的方法，本發明的方法提供了一種不同於現有技術的一個定量校正方法，該方法可以有效避免或降低這種非特異性雜交和空間排斥引起的定量校正誤差。本發明提供的技術方案如下具體步驟如下1、將螢光蛋白基因插入噬菌體DNA的克隆位點前並使螢光蛋白基因的表達閱讀框架(reading frame)與噬菌體DNA—致；2、再用此重組噬菌體DNA去克隆抗原基因或基因片段；3、重組噬菌體基因在寄主細菌中表達；4、將表達的重組噬菌體點在生物晶片上或其它承載介質上；
5、將點好樣的生物晶片與血清抗體雜交；6、再加入標記的血清抗體的抗體(二抗)；7、讀取信號及數據分析。前述步驟(1)的步驟包括將螢光蛋白基因連接上適當的粘連序列；再將噬菌體 DNA和螢光蛋白基因用適當的酶酶切；將螢光蛋白基因插入噬菌體DNA。本發明中的定量校正方法是採用螢光蛋白來完成的。螢光蛋白具有能夠在某些波長的光的激發下自身發螢光的功能。螢光蛋白首先被發現存在於水母體內，後其基因被分離、克隆、表達，並被廣泛用於細胞生物學，通過將其與另一基因融合表達，用螢光蛋白的螢光信號示蹤其它基因在細胞或在動物活體中的表達。本發明就是採用了螢光蛋白這種特殊功能，將其與抗原基因或基因片段融合，並將螢光蛋白的發射光強做為對照來定量校正噬菌體展示抗原蛋白克隆生物標誌物的點樣量。本發明利用螢光蛋白本身可以發射螢光的特性，用螢光蛋白代替了噬菌體抗體和標記的噬菌體抗體的抗體的定量校正功能。本發明所用的螢光蛋白的種類包括，但不限於 綠色焚光蛋白(green fluorescence protein,GFP)、黃色焚光蛋白(yellow fluorescence protein, YFP)、紅色螢光蛋白(red fluorescence protein, RFP)，及其增強型衍生體及其它衍生體，如增強型綠色螢光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)、增強型黃色螢光蛋白(enhanced yellow fluorescence protein, EYFP)，增強型紅色螢光蛋白 (enhanced red fluorescence protein，ERFP)，以及其它有自身發螢光功能的蛋白。本發明所述噬菌體包括單鏈絲狀噬菌體、λ噬菌體、Τ4噬菌體以及Τ7噬菌體。本發明所用的寄主細菌較佳的為大腸桿菌。更佳地為大腸桿菌BLT5615。本發明所述的生物晶片包括，但不限於生物晶片微陣列，蛋白生物晶片微陣列， 生物液體晶片微陣列。本發明所用的寄主細菌較佳的為大腸桿菌。更佳地為大腸桿菌寄主菌株BLT5615。本技術可應用於所有以噬菌體為載體的，以包括傳統ELISA，生物晶片微陣列，蛋白生物晶片微陣列，生物液體晶片微陣列為基礎的蛋白生物標誌物技術。本發明提供的噬菌體展示技術用來克隆抗原基因或基因片段時，這些被克隆展示的抗原可做為生物標誌物用於檢測人體體液中的相應抗體，進而檢測某種或多種人類疾病，如各種癌症，心血管病，自免疫病，等。由於每個噬菌體載體上同時插入了螢光蛋白和抗原基因(或抗原基因片段)，螢光蛋白的信號強度與抗原蛋白引發的信號強度相對值可以有效地消除各個點樣點之間因點樣量不同引起的誤差。在保證能夠定量校正點樣量的同時，又能避免可能產生的相互交叉雜交及可能存在的空間排斥對結果的幹擾。現有技術的定量校正是通過用噬菌體抗體和標記的噬菌體抗體的抗體來完成的； 而本發明是通過用螢光蛋白來完成的。本發明用螢光蛋白自身發光的功能替代了噬菌體抗體和標記的噬菌體抗體的抗體的定量校正功能。螢光蛋白能自身發射螢光，既可起到定量校正的功能，又可排除噬菌體抗體及噬菌體抗體的抗體與克隆的抗原之間的非特異性雜交；螢光蛋白融入了噬菌體蛋白顆粒，對克隆抗原與克隆抗原的抗體之間的雜交沒有空間上的競爭。


圖1為本發明的技術方案流程示意圖；和背景技術相比，免去了用噬菌體抗體及標記的噬菌體抗體的抗體定量校正的步驟，用螢光蛋白替代了噬菌體抗體及噬菌體抗體的抗體的定量校正功能。圖2為用噬菌體抗體及噬菌體抗體的抗體的雜交流程(現有技術)；圖3為螢光蛋白的雜交流程(本發明技術)。
具體實施例方式實施例一、製備與增強綠色螢光蛋白(EGFP)基因融合的T7噬菌體載體本發明製備與EGFP基因融合的T7噬菌體載體可以通過多種具體途徑實施，下面就進行較詳細的描述用如下一對包裹EGFP核苷酸序列的PCR引物正向5，CTTCAGAATTCCAGTATGGTGAGCAAGGGCGA 3，反向5』 TCAGTAAGCTTCACTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG 3'從質粒載體pEGFP擴增出EGFP的核苷酸序列。在該對PCR引物中， ATGGTGAGCAAGGGCGA 和 TTACTTGTACAGCTCGT 來自 EGFP 核苷酸序列，GAATTC 是 EcoR I 內切酶的切點，AAGCTT是Hind III內切酶的切點。這樣，擴增出來的EGFP核苷酸序列中，正向5』 末端含一個EcoR I切點，3』末端含一個Hind III切點，而EGFP核苷酸序列本身卻不包含這兩個切點的任何一個。這兩個切點與T7噬菌體載體的EcoR I和Hind III配合將EGFP 核苷酸序列插入T7噬菌體。PCR反應在20 μ 1的反應液中進行，反應液中含IOpg的pEGFP 質粒DNA模板、2mM MgCl2、ImM各核苷酸(dNTP)、IXPCR緩衝液(IOmM Tris-HCl pH8. 3、50mM 此1，0.0001%膠原蛋白)、1口11的正向和反向引物、1單位的Taq酶。反應溫度循環如下 94 0C 2分鐘，30個循環的94 °C 45秒、58°C 45秒、72°C 45秒，再72°C 5分鐘。在總體積為 50 μ 1的反應液中，加入10 μ 1擴增的EGFP的PCR產物、5 μ 1 IOX Hind III內切酶緩衝液、 10單位Hind III和10單位EcoR I內切酶37°C消化3小時。同時，在另外20 μ 1的反應液中，將Ig Τ7噬菌體載體也用EcoR I和Hind III內切酶37°C消化3小時。在10 μ 1的反應液中，加入2μ 1擴增的EGFP的內切酶消化液、1 μ 1的Τ7噬菌體載體內切酶消化液、 1 μ 1的IOX的連接酶緩衝液、1 μ 1 IOmM的ATP、1 μ 1 IOOmM的DTT、1單位T4DNA連接酶。 反應在14°C進行16小時。之後4°C下保存，或直接進行包裝。噬菌體包裝、裂解擴增、效價測定按照Nogagen公司試劑盒「T7Select System Manual 」提供的方法進行。從效價測定的培養盤上挑選6個噬菌斑，用T7引物PCR擴增後，稀釋5倍的PCR產物用作模板測序，檢驗插入EGFP的序列。挑選EGFP插入序列正確的克隆擴增、提取純化融合噬菌體載體DNA、 EcoR I和Hind III內切酶酶切、純化、將濃度調至200ng/μ 1後，保存於_20°C待用。EGFP的核苷酸序列如下ATGGTGAGCA AGGGCGAGGA GCTGTTCACC GGGGTGGTGC CCATCCTGGTCGAGCTGGAC GGCGACGTAA ACGGCCACAA GTTCAGCGTG TCCGGCGAGGGCGAGGGCGA TGCCACCTAC GGCAAGCTGA CCCTGAAGTT CATCTGCACCACCGGCAAGC TGCCCGTGCC CTGGCCCACC CTCGTGACCA CCCTGACCTACGGCGTGCAG TGCTTCAGCC GCTACCCCGA CCACATGAAG CAGCACGACTTCTTCAAGTC CGCCATGCCC GAAGGCTACG TCCAGGAGCG CACCATCTTC
TTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGG
CGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGG
ACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAAC
GTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAA
GATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACC
AGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCAC
TACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGA
TCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCA
TGGACGAGCTGTACAAGTAA
用上述PCR引物擴增後的PCR產物的序列如下
CTTCAGAATTCCAGT
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGT
CGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGG
GCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACC
ACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTA
CGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACT
TCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTC
TTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGG
CGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGG
ACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAAC
GTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAA
GATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACC
AGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCAC
TACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGA
TCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCA
TGGACGAGCTGTACAAGTAAAGTGAAGCTTACTGA。
實施例二、T7噬菌體cDNA文庫轉成螢光蛋白基因融合T7噬菌體cDNA文庫。
起始的T7噬菌體cDNA文庫是用試齊U ！ Trizol (Invitrogen)、polyA
mRNA purification (Qiagen)、T70rientExpress (Novagen)、 禾口 T7Select System Manual (Novagen)從癌症組織和癌細胞系構建而來，共12個96孔盤1152個T7噬菌體抗原克隆。首先照上述試劑盒方法培養得到12個盤的裂解液(每孔180，並將它們合併，得到約 200ml裂解液，從這200ml的裂解液中提取T7噬菌體cDNA文庫DNA，取20 μ g cDNA文庫DNA 用EcoR I和Hind III內切酶消化反應3小時，1. 5%瓊脂糖膠分離，切下鏈長200至1600 鹼基對的凝膠部分，用矽介質法提取、純化凝膠中DNA至200 μ 1 10/1ΤΕ緩衝液中，保存於-20°C待用。這些待克隆的cDNA片段也可用試劑盒Trizol、polyA mRNA purification、 T70rientExpress,從癌症組織和癌細胞系提取、純化mRNA，合成、修飾(連接粘結序列)、 酶切(EcoR I，Hind III)cDNA得到。在10 μ 1的反應液中，加入21cDNA的內切酶消化液、 1 μ 1的融合Τ7噬菌體載體內切酶消化液、1 μ 1的IOX的連接酶緩衝液、1 μ 1 IOmM的ΑΤΡ、 1μ 1 IOOmM的DTT、1單位T4DNA連接酶。反應在14°C進行16小時。之後4°C下保存，或直接進行包裝。噬菌體包裝、裂解擴增、效價測定按照Nogagen公司試劑盒「T7Select System Manual」提供的方法進行。根據裂解擴增的重組噬菌體效價測定計算，按每個15cm瓊脂LB 培養皿400個噬菌斑稀釋裂解液鋪盤，共鋪6個盤。用牙籤挑選邊緣清晰、不與其它斑點粘連的噬菌斑置於每孔盛有8(^1待裂解大腸桿菌寄主菌株^^5615的96孔培養皿，共挑選 12盤96孔培養皿(共1152個克隆)。裂解後加入5 μ 1終止裂解混合液(終止混合液由如下試劑及比例組成PMSF(in 2ml MEOH,addO. 007g PMSF) 2% Gelatin PIC(Sigma) =1:1: 1)終止裂解，保存於-80°C待用。實施例三、製備抗原蛋白晶片、抗原蛋白晶片與血清樣本(來自癌症病人和健康對照)群體印跡雜交反應、和檢測癌症。在12個96孔培養皿中每孔加入感受態待裂解大腸桿菌寄主菌株BLT5615 180μ1，用96針印戳將保存備用的12盤的1152個帶有螢光蛋白基因噬菌體的抗原克隆複製到這12個盤中，裂解後加入12μ 1終止裂解混合液。這12個盤的抗原蛋白-螢光蛋白_噬菌體重組克隆再轉入3個384孔盤，每孔15 μ 1 (180 μ 1至少可轉入8個3X384)，用 Cartesian 5510晶片點樣儀，每個3X384 (3個盤)可點80張晶片，用2個3X384點兩批130 張晶片。同時，用相同方法製作沒有插入螢光蛋白基因的重組噬菌體的12個盤抗原克隆， 合併到3個384孔盤，同樣用2個3X384點兩批130張晶片。按照Chatterjee M，Mohapatra S, Ionan A, Bawa G, Ali-Fehmi R, Wang X, Nowak J, Ye B, Nahhas FA, Lu K, Witkin SS, Fishman D, Munkarah A, Morris R, Levin NK, Shirley NN, Tromp G, Abrams J, Draghici S, Tainsky MA. Diagnostic markers of ovarian cancer by high-throughput antigen cloning and detection on arrays. Cancer Res. 2006 ;66 :1181_90 中描述的雜交方法， 用120個血清樣本(60個來自癌症病人，60個來自健康人)分別與120張具螢光蛋白基因的重組克隆晶片雜交，相同的120個血清樣本用相同的雜交方法分別與120張不具螢光蛋白基因的重組克隆晶片雜交。雜交後，各晶片用Axon 4200Autoloader晶片掃描儀掃描成圖像數據文件，再將圖像數據用Imagene軟體轉化為數字數據。再按照Ho-Sheng Lin, Harvinder S.Talwar, Adi Tarea, Alexei Ionan, Madhumita Chatterjee, Bin Ye, Jerzy Wojciechowski, Saroj Mohapatra, Marc D. Basson, George Yoo, Brian Peshek, Fulvio Lonardo, Chuan-Ju G.Pan, Sorin Draghici, Judith Abrams, and Michael A. Tainsky. Autoantibody Approach for Serum-Based Detection of Head and Neck Cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2007. 16 :2396_2405中描述的方法進行數據分析，計算癌症預測靈敏性、特異性、及準確率。實驗結果表明用不具螢光蛋白基因的重組克隆晶片的癌症預測靈敏性、特異性、及準確率分別為71%、73%、和72%;用具螢光蛋白基因的重組克隆晶片的癌症預測靈敏性、特異性、及準確率則分別為84%、82%、和83%。靈敏性、特異性、 及準確率分別提高了 13% (P = 0. 00052) ,9% (P = 0. 00071)、和 11% (P = 0. 00062)。EGFP蛋白序列MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGE⑶ATY GKLTLKFICT TGKLPVPffPT LVTTLTYGVQCFSRYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL VNRIELKGID FKEDGNILGHKLEYNYNSHN VYIMADKQKN GIKVNFKIRH NIEDGSVQLA DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSTQSALSKDPNEKRDHMV LLEFVTAAGI TLGMDELYKii。上述僅為本發明的具體實施例，但本發明的設計構思並不局限於此，凡利用此構思對本發明進行非實質性的改動，均應屬於侵犯本發明保護範圍的行為。
權利要求
1.一種噬菌體展示抗原克隆生物標誌物的方法，包括如下步驟(1)將螢光蛋白基因插入噬菌體DNA的克隆位點前並使螢光蛋白基因的表達閱讀框架與噬菌體DNA —致；(2)用此重組噬菌體DNA去克隆抗原基因或基因片段；(3)重組噬菌體基因在寄主細菌中表達；(4)將表達的重組噬菌體點在生物晶片上或其它承載介質上；(5)將點好樣的生物晶片與血清抗體雜交；(6)加入標記的血清抗體的抗體；(7)讀取信號及數據分析。
2.如權利要求1所述的一種噬菌體展示抗原克隆生物標誌物的方法，其特徵在於所述步驟(1)的方法包括將螢光蛋白基因連接上適當的粘連序列；再將噬菌體DNA和螢光蛋白基因用適當的酶酶切；將螢光蛋白基因插入噬菌體DNA。
3.如權利要求1所述的一種噬菌體展示抗原克隆生物標誌物的方法，其特徵在於螢光蛋白包括綠色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、紅色螢光蛋白，及其增強型衍生體及其它衍生體，以及其它有自身發螢光功能的蛋白。
4.如權利要求1所述的一種噬菌體展示抗原克隆生物標誌物的方法，其特徵在於所述噬菌體包括單鏈絲狀噬菌體、λ噬菌體、Τ4噬菌體或Τ7噬菌體。
5.如權利要求1所述的一種噬菌體展示抗原克隆生物標誌物的方法，其特徵在於所述的寄主細菌為大腸桿菌。
6.如權利要求5所述的一種噬菌體展示抗原克隆生物標誌物的方法，其特徵在於寄主細菌為大腸桿菌BLT5615。
7.如權利要求1、2、3、4或5所述的一種噬菌體展示抗原克隆生物標誌物的方法，其特徵在於所述生物晶片包括生物晶片微陣列，蛋白生物晶片微陣列，生物液體晶片微陣列。
8.一種噬菌體展示抗原克隆生物標誌物的方法，包括如下步驟(1)製備與增強綠色螢光蛋白(EGFP)基因融合的Τ7噬菌體載體用如下一對包裹EGFP核苷酸序列的PCR引物正向 5』 CTTCAGAATTCCAGTATGGTGAGCAAGGGCGA 3』反向 5' TCAGTAAGCTTCACTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG 3'從質粒載體PEGFP擴增出EGFP的核苷酸序列；擴增出來的EGFP核苷酸序列中，正向5』 末端含一個EcoR I切點，3』末端含一個Hind III切點，利用這兩個切點與T7噬菌體載體的EcoR I和Hind III配合將EGFP核苷酸序列插入T7噬菌體；(2)T7噬菌體cDNA文庫轉成螢光蛋白基因融合T7噬菌體cDNA文庫(3)製備抗原蛋白晶片、抗原蛋白晶片與血清樣本群體印跡雜交反應；(4)信號檢測。
9.如權利要求1所述的一種噬菌體展示抗原克隆生物標誌物的方法的用途，其應用於以噬菌體為載體的，以包括傳統ELISA，生物晶片微陣列，蛋白生物晶片微陣列，生物液體晶片微陣列為基礎的蛋白生物標誌物技術上。
全文摘要
本發明公開了一種噬菌體展示抗原克隆生物標誌物的方法，本發明在噬菌體展示技術中，用螢光蛋白替代了噬菌體抗體和標記的噬菌體抗體的抗體，螢光蛋白能自身發射螢光，既可起到定量校正的功能，又可排除噬菌體抗體及噬菌體抗體的抗體與克隆的抗原之間的非特異性雜交；螢光蛋白融入了噬菌體蛋白顆粒，對克隆抗原與克隆抗原的抗體之間的雜交沒有空間上的競爭。
文檔編號C12R1/19GK102305853SQ20111020422
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者翁長仁 申請人:龍巖九健生物晶片技術研究所