玄參多糖、生產方法和用途的製作方法

2023-10-05 21:31:54 1

專利名稱：玄參多糖、生產方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及從中藥材中提取的多糖同系混合物，特別是涉及從生藥玄參中提取的玄參多糖SnPS-1、其生產方法和用途。
背景技術：
玄參是一種傳統的中藥材，具有「涼血滋陰、降火、生津、解毒」之功效。文獻報導，[張雯潔等，雲南植物研究，16(4)，407(1994)]，[李醫明，蔣山好，高文運，朱大元，藥學學報，34(6)，448(1999)]，[鄒臣亭，楊秀偉，中草藥，31(4)，241(2000)]，其化學成分主要有生物鹼、黃酮甙、甾醇、胺基酸、脂肪酸、揮髮油、胡蘿蔔素、環烯醚萜甙類成分以及微量元素等，而有關玄參中多糖類的研究尚未見報導。

發明內容
本發明要解決的問題是提供一種玄參多糖SnPS-1及其生產方法和用途。
本發明是從生藥玄參中提取獲得的多糖，其化學結構特徵為SnPS-1是以→2)Galf(1→，→2)Araf(1→為主鏈，以及少量糖鏈→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→3)Rhap(1→和極少量的分支糖→2，4)Xylp(1→，末端糖為Galp(1→。由此可見，SnPS-1是一條以直鏈為主，分支極少的雜多糖。
本發明的製備方法是將生藥用水浸泡，採用有機溶劑沉澱，透析或膜分離，濃縮乾燥獲得總多糖。玄參總糖用活性炭處理，再經離子交換柱和凝膠柱層析純化得多糖純品SnPS-1。
該多糖由完全酸水解、還原、乙醯化和GC分析得知由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其摩爾比推薦為1.8∶6.4∶1∶1.2∶2.8∶12.7，平均分子量推薦在90～105萬道爾頓，由HPLC分析得知分子量例如105萬道爾頓，進一步推薦的平均分子量在100萬道爾頓。其譜圖數據如下面所述109.49ppm信號為→2)Araf(1→產生的，108.089ppm信號為→5)Araf(1→產生的，103.74ppm信號為→3)Glcp(1→產生的，103.87ppm信號為→3)Rhap(1→產生的，103.93ppm信號為→6)Manp(1→產生的，98.387ppm信號為→2)Galf(1→產生的；5.300ppm信號為→2)Araf(1→產生的，5.193ppm信號為→5)Araf(1→產生的，4.742ppm信號為→3)Glcp(1→產生的，5.118ppm信號為→6)Manp(1→產生的，5.013ppm信號為→2)Araf(1→產生的。
從SnPS-1甲基化、還原、乙醯化衍生物的GC-MS圖譜分析得知，SnPS-1含有碎片→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，Galp(1→，→3)Rhap(1→，→2，4)Xylp(1→，→3)Araf(1→，→2)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→2)Galf(1→，其摩爾比為4∶2∶3∶5∶3∶2∶15∶9∶35。根據甲基化、NMR等分析，可以得知SnPS-1具有以下的結構SnPS-1是以→2)Galf(1→，→2)Araf(1→為主鏈，以及少量糖鏈→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→3)Rhap(1→和極少量的分支糖→2，4)Xylp(1→，末端糖為Galp(1→。
本發明的製備方法包括將生藥玄參乾燥用水浸泡，採用有機溶劑沉澱，透析或膜分離，濃縮乾燥獲的玄參總糖。玄參總糖經活性炭處理，再經離子交換柱和凝膠柱層析純化可的玄參多糖純品SnPS-1。
具體來說，將乾燥後的生藥玄參粉碎或切片，用水浸泡，其中生藥玄參與水浸泡的重量比推薦是玄參∶水＝1∶10～15，尤其推薦用10～12倍重量或更多的水，浸泡24～36小時。所述水推薦為無離子水。浸泡液的pH值推薦保持在5.0～8.0。
過濾，濾液經或不經濃縮，用有機溶劑沉澱後離心。離心所得沉澱用水溶解，推薦用1-5倍重量的水溶解。
離心，上清液透析或膜分離，透析時間推薦為24-72小時，透析用透析膜、透析袋，其孔徑推薦截留分子量在1000以下。
濃縮乾燥獲得總糖，其中乾燥或減壓濃縮溫度推薦低於60℃進行，最好採用低溫真空濃縮或冷凍乾燥，例如在30～60℃乾燥或濃縮，壓強推薦控制在0.08～0.1M Pa。
所述玄參總糖加水溶解，其中推薦1～5倍重量的水溶解。然後用活性炭處理，再經凝膠柱層析作進一步純化，用水或稀鹽溶液洗脫，收集糖峰，純度可達99.6％。凝膠柱層析所採用的凝膠為Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose型、Bio-Gel P型或Superdex，選用的分離範圍為1×103～5×104道爾頓。推薦凝前述的用有機溶劑沉澱，所述有機溶劑推薦與水互溶的有機溶劑，可以是低碳鏈的醇或酮，例如C1～C6的醇或酮等，尤其推薦乙醇，例如用2～6倍體積的75％～95％的乙醇；沉澱時間推薦為12～72小時。
經生物活性試驗，研究結果表明玄參多糖SnPS-1具有腦缺血保護作用。
本發明首次從玄參中提取玄參多糖SnPS-1。本發明的提取分離方法簡便，產率高和適於工業化生產。本發明取得到的玄參多糖粗品或純品能夠有效的用於製備具有腦缺血保護作用的藥物。


圖1是玄參多糖SnPS-1的HPLC圖。分析柱為Bio-sep，洗脫液水，流速1mL/min，檢測器RI，分析得到單一對稱峰，表明其具有均一性。
圖2是玄參多糖SnPS-1的GC-MS圖譜中的GC圖譜。其表明有8個碎片峰，具體碎片質量見圖5-12。
圖3是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應於GC圖中的13.216min峰，表明有→6)Manp(1→。
圖4是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應於GC圖中的13.397min峰，表明有→5)Araf(1→。
圖5是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應於GC圖中的15.421min峰，表明有Galp(1→。
圖6是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應於GC圖中的15.540min峰，表明有→3)Rhap(1→。
圖7是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應於GC圖中的16.126min峰，表明有→2，4)Xylp(1→。
圖8是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應於GC圖中的18.078min峰，表明有→2)Araf(1→。
圖9是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應於GC圖中的19.290min峰，表明有→3)Glcp(1→。
圖10是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應於GC圖中的22.150min峰，表明有→2)Galf(1→。
圖11是不同劑量的玄參多糖SnPS-1對大鼠腦缺血梗死體積的影響，各給藥組通過大鼠尾靜脈注射。初步結論不同劑量給藥組與缺血對照組差異顯著(p＜0.01)，各個劑量組之間無明顯差異。
圖12是0.2％劑量的玄參多糖SnPS-1對大鼠缺血及再灌注各時間點腦血流量圖，其中R 30min表示再灌注後30min，R 2h表示再灌注後2h。
圖13表示玄參多糖SnPS-1對大鼠缺血及再灌注各時間點腦血流量圖，其中R 30min表示再灌注後30min，R 2h表示再灌注後2h。初步結論0.2％劑量組除了缺血後即刻，其餘各時間點均與對照組差異顯著(p＜0.05)，0.04％和0.4％劑量組除了缺血後2小時與對照組有顯著差異(p＜0.05)，再灌注後半小時及兩小時均無顯著差異。
具體實施例方式
實施例1將生藥玄參500g洗淨乾燥，粉碎，用5升無離子水室溫浸泡24小時，過濾。殘渣用2.5升無離子水繼續浸泡12小時，過濾，合併濾液，60℃減壓濃縮至1～2升。然後用95％的乙醇沉澱，乙醇終濃度為80％，沉澱24小時。離心，沉澱用1.25升水溶解，離心，無離子水透析48～72小時。60℃減壓濃縮後冷凍乾燥，即獲得玄參總糖8.9g。加水2升溶解，加活性炭處理，反覆脫三次，然後減壓濃縮，離心，冷凍乾燥，獲得玄參總糖3.0g，純度為80％。
實施例2將生藥玄參500g洗淨乾燥，粉碎，用5升無離子水室溫浸泡36小時，過濾。殘渣用2.5升無離子水繼續浸泡12小時，過濾，合併濾液，50℃減壓濃縮至2升。然後用95％的乙醇沉澱，乙醇終濃度為82％，沉澱48小時。離心，沉澱用2升水溶解，離心，無離子水透析72小時。50℃減壓濃縮後冷凍乾燥，即獲得玄參總多糖9.5g。加水2升溶解，加活性炭處理，反覆脫三次，然後減壓濃縮，離心，冷凍乾燥，獲得玄參總多糖3.1g，純度為80％。
實施例3
玄參總糖經DEAE-Cellulose柱層析精製，純度為85～90％，再經SephadexG-25和Sephadex G-75柱層析，即獲得純度為99.6％的玄參多糖SnPS-1。具體的分離方法稱取玄參總糖100mg，溶於1～2mL蒸餾水中，離心(4500r/min，10min)。取上清液上Sephadex G-25柱(1.5cm×100cm)，用0.1mol/LNaCl洗脫，流速為0.5mL/min，每管收集3～5mL，大約37～47管為吸收峰。收集後再經Sephadex G-75柱純化，冷凍乾燥，即獲得純多糖SnPS-150mg。
實施例4玄參總糖經DEAE-Cellulose柱層析精製，純度為85～90％，再經SephadexG-25和Sephadex G-75柱層析，即獲得純度為99.6％的玄參多糖SnPS-1。具體的分離方法稱取玄參總糖120mg，溶於2～3mL蒸餾水中，離心(4500r/min，10min)。取上清液上Sephadex G-25柱(1.5cm×100cm)，用0.1mol/L NaCl洗脫，流速為0.5mL/min，每管收集3～5mL，大約38～48管為吸收峰。收集後再經Sephadex G-75柱純化，冷凍乾燥，即獲得純多糖SnPS-160mg。
權利要求
1.一種玄參多糖SnPS-1，其結構特徵為SnPS-1是以→2)Galf(1→，→2)Araf(1→為主鏈，以及糖鏈→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→3)Rhap(1→和分支糖→2，4)Xylp(1→，末端糖為Galp(1→組成，
2.如權利要求1所述的玄參多糖，其特徵是鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖的組成摩爾比為1.8∶6.4∶1∶1.2∶2.8∶12.7。
3.如權利要求1所述的玄參多糖，其特徵是其中→6)Manp(1→，→5)Arraf(1→，Galp(1→，→3)Rhap(1→，→2，4)Xylp(1→，→3)Araf(1→，→2)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→2)Galf(1→，摩爾比依次為4∶2∶3∶5∶3∶2∶15∶9∶35。
4.如權利要求1所述的玄參多糖，其特徵是分子量範圍為90～105萬道爾頓。
5.如權利要求1所述的玄參多糖的生產方法，其特徵是包括將乾燥後的生藥玄參用水浸泡，用有機溶劑沉澱，沉澱用水溶解，上清液經透析或膜分離後，濃縮乾燥獲得總糖。玄參總糖加水溶解後，經活性炭處理以及凝膠柱層析純化可得玄參多糖純品SnPS-1。
6.如權利要求5所述的玄參多糖的生產方法，其特徵是所採用的凝膠為Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose型、Bio-Gel P型或Superdex，選用的分離範圍為1000道爾頓。
7.如權利要求5所述的玄參多糖的生產方法，其特徵是生藥玄參與水浸泡的重量比玄參∶水＝1∶10～15，水浸泡時間24～36小時，浸泡液的pH＝5～8。
8.如權利要求4所述的玄參多糖的生產方法，其特徵是所述的有機溶劑是與水互溶的有機溶劑。
9.如權利要求5所述的玄參多糖的生產方法，其特徵是所述的有機溶劑是乙醇。
10.如權利要求5所述的玄參多糖的生產方法，其特徵是透析或膜分離所採用的膜，其孔徑控制在截留分子量1000道爾頓。
11.如權利要求1所述的玄參多糖，其特徵在於所述的玄參多糖可以製備具有腦缺血保護作用的藥物。
全文摘要
本發明涉及一種從中藥玄參中提取的多糖、其生產方法和用途。本發明採用水浸泡獲得玄參水提液，有機溶劑沉澱、沉澱用水溶解，上清液經透析或膜分離，濃縮乾燥獲得總糖，玄參總糖經活性炭處理和柱層析獲得玄參多糖SnPS－1，其化學結構特徵為SnPS－1是以→2)Gal/(1→，→2)Araf(1→為主鏈，以及少量糖鏈→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→3)Rhap(1→和極少量的分支糖→2，4)Xylp(1→，末端糖為Galp(1→。由此可見，SnPS－1是一條以直鏈為主，分支極少的雜多糖。本發明方法工藝簡單、產率高，適宜工業化生產。經生物活性試驗表明，該多糖無毒副作用，具有腦缺血保護的作用。
文檔編號C08B37/00GK1486991SQ0314229
公開日2004年4月7日 申請日期2003年8月15日 優先權日2003年8月15日
發明者田庚元, 鄧軍娥 申請人:中國科學院上海有機化學研究所, 浙江京新藥業股份有限公司