通過光化學內化作用在抗原呈遞細胞表面上表達抗原的方法
2023-10-29 02:42:22
專利名稱：通過光化學內化作用在抗原呈遞細胞表面上表達抗原的方法
技術領域：
本發明涉及一種疫苗接種的方法，該方法包括使用光動力學處理(PDT)將疫苗組分導入細胞，以實現抗原呈遞；本發明還涉及用於本方法的疫苗組合物。
大多數的分子不易於穿過細胞膜。將分子導入活細胞胞質的方法是操縱和研究生物過程的有用工具。現今最常用的方法有顯微注射、紅血球血影介導的融合和脂質體融合、胞飲體滲透裂解、刮式負荷法(scrape loading)、電穿孔、磷酸鈣和病毒介導的轉染。這些技術對細胞培養研究有用，雖然在許多情況下它們可能不能實行、費時、低效或者它們可能引起明顯的細胞死亡。因而這些技術用於生物學或醫學研究或治療並不是最佳的，因在這些研究中要求細胞保持活力和/或功能。
眾所周知卟啉和許多其它的光敏化合物可能引起細胞和組織的細胞毒效應。這些效應基於以下事實，即光敏化合物曝光時可能變成有毒，或者可能釋放有毒的物質如單態氧或其它氧自由基，這些物質會損傷細胞物質或生物分子，包括細胞膜和細胞結構，而這些細胞結構或膜的損傷最終會殺死細胞。這些效應已被用於治療各種異常或疾病，尤其包括腫瘤疾病。這種治療稱為光動力學治療(PDT)，它包括給予機體受感染部位光敏(光化學治療)製劑，然後在活化光(photoactivatinglight)下曝光以激活光敏劑，並使其轉變成細胞毒形式，從而殺死受感染的細胞或減少它們的增殖潛能。已知應將光敏劑優先或選擇性地定位在理想的目標位置如腫瘤或其它病灶。
已知光敏劑的範圍包括著名的補骨脂素、卟啉、二氫卟酚和酞菁。這些藥物當曝光時變成有毒。
光敏藥物通過多種機制直接或間接地發揮它們的作用。因此，如某此光敏劑被光激活時直接變成有毒，而其它的則產生有毒物質，例如氧化劑如單態氧或其它的氧衍生的游離自由基，這些物質對細胞物質和生物分子如脂質、蛋白和核苷酸有極大的破壞性。
卟啉光敏劑通過產生毒性氧物質而間接起作用，並且被認為是用於PDT的最佳候選物。卟啉是血紅素合成中自然產生的前體。具體而言，當鐵(Fe3+)通過亞鐵螯合酶的作用摻入到原卟啉IX(Pp)中時產生了血紅素。Pp是一種極強的光敏劑，而血紅素沒有光敏感作用。本領域已知道各種以卟啉為基礎的或與卟啉有關的光敏劑，文獻中也有描述。
細胞毒作用主要是通過單態氧的形成起作用。這些活性中間物質在細胞中壽命很短(＜0.04μs)，因而，在曝光期間PDT主要在單態氧形成位點非常接近的地方發揮其細胞毒作用單態氧可氧化蛋白質(組氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、DNA(鳥嘌呤)、不飽和脂肪酸和膽固醇。PDT的一個優點是沒有曝光的組織可能不受影響，即可能獲得選擇性的PDT作用。還有許多文獻認為可以用PDT來破壞不想要的細胞群，如腫瘤細胞。專利文獻描述了許多光動力化合物，這些化合物可單獨或與靶向試劑(如針對腫瘤細胞受體決定簇的免疫球蛋白)偶聯使用，使這些複合物更具有細胞特異性。某些光化學化合物(如血卟啉衍生物)天生具有在惡性細胞中定位的能力。這些方法和化合物在挪威專利第173319號、挪威專利申請第900731、176645、176947、180742、176786、301981、300499和891491號中有描述。
在WO93/14142中描述了一種藥物輸送系統，該系統包括連在共聚物載體上的一種抗癌製劑和一種光敏劑(即感光劑)。給藥後，該複合物通過胞飲或吞噬進到細胞內，停留在核內體和溶酶體中。在溶酶體中，抗腫瘤製劑與聚合物之間的結合鍵被水解，前者能被動擴散通過溶酶體膜進入胞液中。因而，此法的用途限於能擴散穿過溶酶體膜的小分子化合物。擴散一段時間後，用適當波長和能量的光源照射，以激活該光敏感化合物。抗癌製劑和光敏劑的聯合作用破壞了細胞。
因而，上述PDT方法涉及導致細胞死亡的細胞結構的破壞。
另一方面，WO96/07432提到一種方法，該方法用光動力作用機制將另外的不能透過膜的分子，以不導致普遍的細胞破壞或細胞死亡的方式導入胞質中。在這個方法中，該分子與光敏感製劑共同內化(更具體的說是「胞吞」)細胞的胞內囊(例如溶酶體或核內體)中。然後使細胞暴露於活化光中使光敏劑活化，進而引起囊膜破壞或破裂，囊中的物質(包括分子)釋放進入細胞內(即胞質中)。已發現在這個方法中，大多數細胞的功能和活力不會受到有害的影響。因而，已提議用該方法〔稱為光化學內化(internalisation)〕來將各種各樣不同的分子(包括治療劑)轉運到細胞內即胞質內。
我們現已發現，用這樣的方法不僅能有益地將分子轉到細胞內，還可以在細胞表面呈現或表達。從而，在某分子轉運並釋放到胞質之後，該分子就可能被轉移到細胞表面，在那兒它可以呈現在細胞的外部即細胞表面。這個方法在疫苗接種領域裡有特殊的用途，在此領域中，為了誘導、促進或增強免疫應答，須將疫苗組分即抗原或免疫原導入細胞，以在該細胞表面呈現。
最概括地說，本發明因而提供了一種將抗原分子或其一部分表達於細胞(較佳的是抗原呈遞細胞)表面的方法，所述方法包括通過光化學內化作用將分子導入胞質，其中，所述分子或者其一部分後來將呈現在所述細胞的表面。
本文所用的「呈現」或「表達」指分子或某一部分呈現在所述細胞表面，這樣該分子至少有一部分暴露和接觸於該細胞的周圍環境。在「表面」上表達可以通過使待表達的分子與細胞膜和/或細胞組分接觸而實現，所述細胞組分可以在膜上呈現或被呈現的。
這種抗原呈遞能有利地刺激免疫應答，較佳的是刺激能賦予對含有所述抗原的或其一部分的病原體後續攻擊的保護力的免疫應答。因而，本發明的發現作為疫苗接種的方法是特別有用的。
更具體說，本發明在這方面提供了一種在細胞表面表達抗原分子或抗原分子一部分的方法，所述方法包括使所述細胞與抗原分子和光敏劑接觸，其中，所述分子和所述製劑各自被吸收到所述細胞的胞內受膜限制的區室中；然後用能有效激活光敏感製劑的波長照射所述細胞，這樣，所述胞內區室的膜被破壞，所述分子被釋放到胞質中，而不殺傷死細胞；其中，所述釋放出來的抗原分子或其一部分隨後被提呈在所述細胞的表面上。
本文所用術語「破壞的區室」指該區室膜的完整性被永遠地或暫時地破壞，該破壞足以使區室中含有的抗原分子釋放出來。
或者，本發明在這方面還提供了用於在細胞表面表達抗原分子或抗其一部分的一種組合物，較佳的是該組合物可刺激免疫應答，所述組合物包括一種抗原分子和一種光敏劑。較佳的是，所述組合物是藥學上可接受的，還含有藥學上可接受的賦形劑或稀釋劑。
另一方面，本發明還提供了在藥物製造中抗原分子和光敏劑的用途，所製造的藥物用於在細胞表面表達所述抗原分子或其一部分，以刺激免疫應答。
另一方面，本發明提供了一種產品，該產品包括抗原分子和光敏劑，它作為混合的製品在細胞表面表達所述抗原分子或其一部分中同時、分開或順次使用，以刺激免疫應答。
另一方面，本發明提供了一種試劑盒，該試劑盒用於在細胞表面表達抗原分子或其一部分，所述試劑盒包括含有所述抗原分子的第一容器和含有光敏劑的第二容器。
本發明中的抗原分子可以是任何的分子，其中，當以適當的方式將該分子或其一部分呈遞給免疫系統時，它們能刺激免疫應答。優點是，該抗原分子因此可以是一種疫苗抗原或疫苗組分，如一種包含多肽的實體。
本領域已知許多這樣的抗原或抗原性疫苗組分，包括所有細菌的或病毒的抗原或真正的抗原(indeed antigen)或任何致病物種(包括原生動物或高等生物)的抗原組分。同時，在文獻中已廣泛地研究和報導，傳統上疫苗抗原組分包括整個生物體(不管是活的、死的或減毒的)即全細胞疫苗，以及亞單位疫苗即基於生物的具體抗原性組分(如蛋白或肽)，或者甚至是碳水化合物。任何亞單位疫苗組分在本發明中均可用作抗原性分子。然而，本發明在肽疫苗領域有特殊的應用。因而，本發明一個較佳的抗原分子是肽(在本文，肽定義為包括短的和長的肽，即肽、寡肽或多肽，還包括蛋白分子或它們的片段，如含5-500，10-250；含15-75、8-25胺基酸的肽)。宜提呈或表達的抗原分子部分較佳地包括細胞內抗原加工機制所產生的部分。然而這些部分可以由其它方法產生，如通過合理的抗原設計(如pH敏感條帶)或通過其它的細胞加工方法而實現。足夠大小的這些部分能方便地產生免疫應答，如五個以上或者10或20個胺基酸以上的肽。
文獻中已提出了許多的候選肽疫苗物，例如，在病毒性疾病和傳染病如AIDS/HIV感染或流行性感冒、犬細小病毒、牛白血病病毒、肝炎等的治療中(參見Phanuphak等人，Asian Pac.J.Allergy.Immunol.1997，15(1)，41-8；Naruse，Hokkaido Igaku Zasshi 1994，69(4)，811-20；Casal等人，J.Virol.，1995，69(11)，7274-7；Belyakov等人，Proc.Natl.Acad.Aci.USA，1998，95(4)，1709-14；Naruse等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91(20)，9588-92；Kabeya等人，Vaccine 1996，14(12)，1118-22；Itoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83(23)，9174-8)。與可採用細菌肽相類似，肽抗原實際上可以從其它生物體或物種中得到。
除了從致病生物得到抗原外，已提出將肽作為抗癌症或其它疾病如多發性硬化的疫苗。例如，致癌基因突變肽很有希望成為癌疫苗，在細胞毒T淋巴細胞的刺激中用作抗原(Schirrmacher，癌症研究和臨床腫瘤學雜誌，1995，121，443-451；柯斯蒂癌化療和生物反應調節劑，1997，17，316-327)。也評價了一種合成肽疫苗在轉移性黑色素瘤治療中的效果(Rosenberg等人，Nat.Med.1998，4(3)，321-7)。Wilson等人〔J.Neuroimmunol，1997，76(1-2)，15-28〕描述了用T細胞受體肽疫苗來治療多樣性硬化。任何這些肽疫苗組分可以用作本發明的抗原性分子，正如在文獻中描述或提議的任何一種肽均可作為肽疫苗。這種肽可以合成或從生物體中分離得到。
用於本發明方法和用途等的細胞可以是任何能在其表面表達或提呈分子的細胞，該分子是通過給藥或轉運進入胞質的。
由於本發明主要的應用是抗原呈遞或疫苗接種，所以，細胞通常是免疫效應細胞，即參加免疫應答的細胞。但是，其它細胞也可能提呈抗原給免疫系統，這些也在本發明的範圍之內。本發明的細胞宜是抗原呈遞細胞。抗原呈遞細胞可以涉及免疫反應的任何方面或「分枝」，包括體液和細胞介導免疫力，例如，刺激抗體產生，或者刺激細胞毒或殺傷細胞，這些細胞能識別和破壞(或消除)表面表達外來抗原的細胞。術語「刺激免疫應答」，包括所有類型的免疫應答和激發它們的機制。
對細胞毒細胞或產生抗體的細胞的刺激，需要被呈遞給被刺激細胞的抗原由抗原呈遞細胞這種特殊方式遞呈，例如通過MHC-I類分子的呈遞(如CD8-細胞毒T細胞的激活需要MHC-I抗原呈遞)。
抗原呈遞細胞在本領域中是周知的，在文獻中有所描述，這些細胞包括如淋巴細胞(T細胞和B細胞)、樹突細胞、巨噬細胞等。其它的包括如癌細胞(如黑色素瘤細胞)。
對於抗原呈遞細胞向細胞毒T細胞(CTL)的抗原呈遞，抗原分子需要進入抗原呈遞細胞的胞質內(Germain，Cell，1994，76，287-299)。本發明提供一種將抗原分子送到胞質的有效的方法。
通過光化學內化作用，抗原分子一旦被釋放到胞質中，即可通過細胞的抗原加工機制而被加工，並以適當的方式(如以MHC-I的方式)呈遞到細胞的表面。這個加工可能包括抗原降解，如，蛋白或多肽抗原降解成肽，這些肽隨後與MHC分子形成複合物而呈遞。因而，本發明表達或呈遞在細胞表面的抗原分子可以是被內化(胞吞)抗原的一部分或片段。
抗原可以被抗原呈遞細胞通過胞吞所攝取，並在胞吞的囊內降解成肽。這些肽可能在核內體中與MHC-II類分子結合，並被轉移到細胞表面，在那裡肽-MHC-II類複合物可被CD4+T輔助細胞識別並引起免疫應答。或者，胞質中的蛋白質可能被降解(如被蛋白酶體降解)，然後通過TAP(與抗原呈遞相關的運載蛋白)轉運到內質網中，在那兒肽可與MHC-I類分子結合併如
圖1所述轉運到細胞表面(Yewdell和Bennink，1992，Adv.Immunol.521-123)。如果肽是外來的抗原，那麼此肽-MHC-I類複合物將被CD8+細胞毒T細胞(CTLs)識別。CTLs將與該肽-MHC-I類複合物結合，從而被激活，開始增殖並形成CTLs克隆。靶細胞和其它表面具有相同的肽-MHC-I類複合物的靶細胞可被該CTL克隆所殺死。如果能在胞質中能導入足量的抗原，就可能建立對外來抗原的免疫力(Yewdell和Bennink，1992，同上；Rock，1996，Immunology Today，17131-137)。這尤其是癌症疫苗開發的基礎。一個最大的實際問題是將足量的抗原(或抗原的部分)導入胞質。這可用本發明的PCI解決。原理在圖1中闡述，該圖顯示了怎樣用PCI來刺激CTLs。將一條肽或一個蛋白(P)在胞外給予抗原呈遞細胞。P通過PCI被胞吞和釋放到胞質中。該肽或蛋白隨後將被蛋白酶體部分降解，與MHC(HLA)-I類分子形成複合物，並被轉運到細胞表面，在那兒，該複合物被CTLs識別。
如同將在下面實施例中所作的更詳細描述那樣，已證明根據本發明，可以有效地用光化學內化進行癌特異性肽的胞質中傳送。
使用靶定向試劑如靶特異性傳送或運載系統或載體分子，可將抗原分子和/或光敏劑導向特異性細胞或組織。這樣，例如可將抗原分子和/或光敏劑通過載體或載體系統(如重建的LDL顆粒)傳送給細胞。載體分子可與抗原分子、光敏劑或這兩者結合或偶聯，可採用相同的或不同的載體分子。抗原分子和/或光敏劑還可偶連於一位點靶向配體(site-targeting ligand)，例如對具體細胞類型或具體細胞結構具有特異性的配體，如抗體，該抗體能識別表達在某些類型細胞表面上的抗原如腫瘤特異性抗原。這些機制可通過受體介導的內吞作用增加光敏劑和/或抗原分子的攝取。還可以用這些靶定向分子載體和載體來引導抗原分子和/或光敏劑進入細胞內的區室中。
胞內受膜限制的區室可以是存在在細胞內的任何區室，較佳的該區室是膜性囊，尤其是核內體或溶酶體。但是，該胞內區室還可以包括高爾基體或內質網。所有的這些要求是抗原分子和光敏劑定位在同一胞內區室中。
在WO96/07432中較詳細地描述了光化學內化方法(本文引用該文的內容作為參考)。現在在文獻中也廣泛地描述了PDT方法。
本發明使用的光敏劑可以是能定位於胞內區室，尤其是內涵體或溶酶體任何試劑。這些光敏劑的範圍是本領域周知的，在文獻中有所描述，包括WO96/07432。這方面可能會提及的有雙-和四磺酸鋁酞菁、磺酸四苯基卟吩(TPPSn)、耐爾藍、二氫卟酚e6衍生物、尿卟啉I、葉赤素、血卟啉和亞甲基藍，這些都顯示定位在培養細胞的核內體和溶酶體中。這種情況最多是由於內吞活動。
可能提及的合適的光敏劑類型包括卟啉、酞菁、紅紫素、二氫卟酚、二苯卟啉酞菁、陽離子染料、四環素和親溶酶體弱鹼(lysomotropic weak base)或者它們的衍生物(Berg等人，Photochemistry and Photobiology，1997，65，403-409)。
較佳的是，光敏劑包括TPPS4(Zabner等人，J.Biol.Chem.1995，270，18997-19007)TPPS2a和AlPcS2a。
本發明的光化學內化作用可用PDT方法進行，該方法是本領域周知的和標準的，對這些技術做適當的修改在本方法中是有效的。因而，可根據PDT領域周知方法和手段的應用(application)或引入將抗原分子和光敏劑傳送到細胞中。可用本發明方法體內或體外，原位處理或活體外處理細胞，然後將處理的細胞給予病人。
從而，本發明另一方面提供了在其表面表達有抗原分子或其一部分的抗原呈遞細胞，該細胞通過前述方法獲得(或已獲得)。本發明另一方面提供了這種細胞的種群或培養物，特別是這種細胞的活的和具有完整功能的種群或培養物，本發明還提供了這種細胞(或這種細胞的種群或培養物)在治療中的應用，具體是用來刺激免疫應答，尤其是刺激CTLs應答。
本發明還提供了這種細胞(或這種細胞的種群或培養物)的應用，即用來製備刺激免疫應答尤其是CTLs免疫應答的藥物(如疫苗組分)。
可以採用本領域普通或標準的任何體內給藥方式進行體內和體外表面給藥，如注射、輸灌、局部給藥等。對於在體內使用，本發明可用於任何相關的含有靶細胞的組織，包括局部體液，以及固體組織。只要光敏劑能被靶細胞攝取並且光能正確地傳送，可用其處理所有的組織。
從而，本發明的組合物可以根據製藥技術領域周知的技術和工藝以任何方便的方式配製，如採用一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑。此組合物和載體或賦形劑材料的性質、劑量等可以根據選擇和所需的給藥途徑、接種目的等以常規方式選擇。劑量同樣地可以常規方式確定，可能依賴於抗原分子的性質、接種目的、病人年齡、給藥方式等，還要考慮到光敏劑照射時破壞膜的力量/能力。
激活光敏劑的光照射步驟同樣地可根據本領域熟知的技術和程序進行。例如，光的波長和強度可根據所用的光敏劑選擇。合適的光源在本領域中是熟知的。
如前面所提到的，以及在WO96/07432中提到的，已發現這種方式的光化學內化作用對細胞的活力和功能沒有有害的影響。具體而言，已發現當按照本發明處理全部或大多數細胞時，大多數細胞沒有被殺死，而是活著，主要功能完整。
本文所用的術語「沒有殺死細胞」是想定義這樣的一種情況。換句話說，全部或多數細胞，實際上是所有的細胞或絕大多數細胞(如至少75％的細胞，較佳的是至少80％、85％、90％或95％的細胞)沒有被殺死。
顯然，當用光照射全部或多數細胞時，某些細胞群或某些區域的組織可得到更多的光，或者以某些其它方式比其它細胞群或組織區域受到更大的PCI影響。因而，在整個受照射細胞群中生存細胞的百分比不一定一致，該百分比指受照射細胞群中仍能存活的細胞的百分比，要求僅是有足夠比例的受照射細胞存活。另外，照射導致細胞死亡要一些時間，例如幾個小時。在這種情況下可能看到最終死亡的細胞也可能在其表面表達抗原分子，這與本發明的方法一致，因而包括在本發明的方法、使用等之中。因而，細胞死亡百分比是指在照射的數小時時間內(如照射後達到4小時)仍能存活的細胞百分比，較佳的是指照射後4小時或以上的存活細胞百分比。
本發明方法可以作修改，這樣，可通過選擇與光敏劑濃度相應的光劑量而調節存活細胞組分或比例。這些技術在本領域也是熟知的。
本發明提供了一種有效的方法來傳送各種各樣的抗原分子。本發明有許多特徵，使得本發明特別適合作為疫苗傳送工具，這些特徵包括1)只要待輸送的分子能被靶細胞胞吞，其分子的大小沒有限制；2)它不依賴於細胞增殖；3)它是位點特異性，只有曝光的區域才受到影響；4)它不致瘤。另外，光化學內化作用可以和其它機制聯合作用，以產生位點或組織特異性藥物作用，如通過使用細胞表面結構的特異性配體來靶向，使用有組織特異性的調節基因元件或使用疾病特異性藥物，從而開創了獲得對靶細胞的藥物特異性的充分協同作用的可能性。
現在，本發明將參考下列附圖更詳細地描述以下非限制性例子，其中圖1顯示了可用PCI如何刺激CTLs的示意圖。在抗原呈遞細胞的胞外加入一條肽或一個蛋白(P)。P被胞舌並通過PCI釋放到胞質中。該肽或蛋白隨後將被蛋白酶體部分降解，與MHC(HLA)-I類形成複合物，然後被轉移到該細胞的表面，在那兒該複合物被CTLs識別。
圖2顯示了某肽的光化學誘導的主定域。將BL2-G-E6細胞與螢光素標記的p21ras衍生的5-21Val1A肽和AlPcS2a共同培育。用螢光顯微鏡定域方法檢測細胞的螢光肽和AlPcS2a開始前(上圖)和30分鐘後(下圖)，紅光曝光4分鐘。其標尺刻度為20μm。
圖3顯示了MART-1肽經PCI後CD8+T淋巴細胞克隆抗FM3黑色素瘤細胞的細胞毒性。
圖4顯示了PCI將HRP轉運到胞質的能力。用3.2μg/ml的TPPS2a和1mg/ml的HRP處理NHIK 3025細胞18小時。然後在用所示光劑量曝光前用沒有藥物的培養基換掉原培養基。用電滲透(electropermeabilisation)和密度離心技術測量完整細胞(○)、和與沒有胞質的死細胞()分開的胞質(●)中的HRP活性。
圖5顯示了GFP的光化學誘導表達。圖a.GFP在THX細胞中的表達，該細胞在沒有AlPcS2a和光、或者存在AlPcS2a下用pEGFP-N1-pLys複合物處理，隨後用圖中所示的光劑量曝光。用流式細胞術分析細胞，畫線右邊的細胞是GFP表達陽性細胞。圖b.THX細胞中的GFP表達，該細胞用光敏劑(20μg/ml的AlPcS2a或0.25μg/ml的3-THPP)處理18小時接著用pEGF-N1-pLys複合物轉染6小時並曝光，滅活了50％的細胞。用如圖a.所述的流式細胞術分析分析GFP表達。
實施例材料和方法照射用兩種不同的光源處理細胞，每種光源都有4個螢光管。使受TPPS4、TPPS2a和3-THPP(卟啉產品，Logan，UT)處理的細胞在藍光(3026型；Appl.Photophysics，Lodon，UK)中曝光，其光強度達到1.5mW/cm2細胞，而用AlPcS2a(卟啉產品，Logan，UT)處理的細胞在紅光(Philips TL 20W/09)中曝光，該光用Cinemoid 35型濾波器過濾，光強度為1.35mW/cm2細胞。
螢光顯微鏡檢查將Berg.K.等人(Biochem.Biophys.Acta.，1370317-324，1998)描述用螢光顯微鏡分析了細胞。為分析螢光標記分子，該顯微鏡裝備有一個450-490nm激發濾光片、一個510nm二向色光束分路器和一個510-540nm的波段通過發射過濾片。
質粒-pLys複合物的製備和細胞的處理用含5μg質粒(pEGFP-N1；Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)的75微升HBS與含5.3μg pLys(MW20700；Sigma，St.Louis，MO)的75微升HBS輕輕混合製備了質粒-pLys複合物(電荷比為1.7)。該溶液在室溫下培育30分鐘，然後用培養基稀釋，並加到細胞中。
將THX細胞在37℃下與20μg/ml的A1PcS2a培育18小時，洗滌並在與質粒-pLys複合物培育2小時之前與沒有光敏劑的培養基培育3小時。將經pEGFP-N1/pLys處理過的THX細胞洗滌一次，然後在曝光前在沒有添加物的培養基中培育2小時。37℃培育該細胞2天，傳代培養並在進行流式細胞術分析GFP表達前進一步培育5天。
用20μg/ml的AlPcS2a培育HCT-116細胞18小時，洗滌然後在曝光前在沒有質粒的培養基中用質粒-pLys複合物轉染6小時。37℃培育40小時後，用顯微鏡研究其GFP表達。
流式細胞術分析用胰蛋白酶處理細胞，離心後重懸於400μl的培養基中，然後用50μm的尼龍網過濾器過濾。然後用FACStar與流式細胞術(Becton Dickinson)分析該細胞。用調到488nm的氬雷射(200mW)激發之後，通過510-530nm濾光片測量了綠螢光蛋白(GFP)。用調到351-356nm的氪雷射(50mW)激發之後，通過650nm長通路濾光片測量了AlPcS2a。通過門控GFP螢光信號的脈衝寬度將雙染色細胞與單染色細胞相區分。該數據用PC Lysys II軟體(BectonDickinson)分析。
螢光肽的製備和細胞的處理螢光標記的Val1A-p21ras-肽(殘基5-21)由Alan Cuthbertson NycomedAmersham合成和提供。將BL2-G-E6與30μg/ml的螢光標記p21ras衍生肽一起培育18小時，隨後與20μg/ml的AlPcS2a培育18小時，並在紅光中曝光前在沒有藥物的培養基中培育1小時。
實施例1光化學內化(PCI)作用能用來使肽進入到細胞的胞質中為了評估PCI對癌特異性肽的胞質中傳送，採用了螢光標記的含殘基5-21的p21ras肽和含Val12突變(G12V)的肽(Gjertsen，M.K.等人，Int.J.Cancer，72784-790，1997)。ras肽和AlPcS2a共定域於BL2-6-E6小鼠纖維母細胞中，這表明該肽被胞吞攝入(圖2)。曝光4分鐘後，發現螢光標記的ras肽和AlPcS2a擴散到細胞質中。僅暴露於螢光標記的ras肽和光中的細胞沒有觀察到類似的作用(沒有給出數據)。
實施例2用PCI誘導抗原呈遞和CD8+T淋巴細胞介導的細胞殺傷將培養在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養基不表達MART-1的FM3黑色素瘤細胞(在6孔板中，2×105/孔)以10μg/ml的光敏劑AlPcS2a處理18小時。然後用含EDTA(0.1M)的Dulbecco公司的磷酸緩衝溶液(PBS)從培養基中釋放出該細胞，將51Cr(60μCi/ml Na2CrO4)的100％FCS加到該細胞中，並在溶液中保持1小時，然後與含5μg/ml MART-1肽的PPMI 1640的10％FCS溶液培育5小時，同時細胞仍保持在溶液中。MART-1肽的序列是TAEEAAGIGILTVILG。然後用含10％FCS的RPMI 1640培養基洗滌該細胞兩次，並接種在96孔平板(在100μl的RPMI 1640/10％FCS培養基中，2000/孔)中。然後以圖3所示的時間曝光該細胞(Philips TL 20W/09)，該光用Cinemoid 35濾光片過濾過，其光強度達到1.35mW/cm2細胞(Rodal等人，1998，J.Photochem.Photobiol.BBiol.45150-9)。曝光18小時後，去除原培養基，並加入含MART-1/HLA-A2特異性細胞毒T淋巴細胞的培養基(加入CTLs-40000/孔在100μl中)。培育4小時後，將FM3細胞與培養基相分離，計數釋放在培養基中(作為溶解細胞的指示劑)的51Cr，同時如以前所述計算自發釋放和最大釋放(Fossum等人，1995，Cancer Immunol.Immunother.40165-172)。特異性鉻釋放百分比根據下式計算(實驗釋放-自發釋放)/(最大釋放-自發釋放)×100。從圖3所示的結果可以看出，上述MART-1肽PCI之後的FM3細胞，對CD8+T淋巴細胞細胞毒性具有輕微的依賴易感性(dependent susceptibility)。
實施例3PCI誘導胞吞的分子大組分的釋放這通過PCI誘導的辣根過氧化物酶(HRP)內化/胞吞所顯示。
通過使用HRP證明(見圖4)，PCI誘導胞吞的HRP大組分(60％)釋放並進入到胞質中。
在這個實驗中，用光敏劑TPPS2a(3.2μg/ml)和1mg/ml的HRP處理NHIK3025細胞(人子宮頸原位癌細胞)18小時。然後在以圖4所示的曝光劑量曝光之前用沒有藥物的培養基替換原培養基。按照Steinman等人(J.Cell Biol.，68665-687，1976)描述的方法測量了HRP的活性。用電滲透和密度離心技術(Berg等人，Int.J.Cancer 59814-822，1994)將胞質與無胞質的死細胞相分離。
實施例4可用PCI來增加功能基因的遞送為證明這一點，用編碼綠螢光蛋白(GFP)的質粒(pEGFP-N1)的pLys複合物轉染了TXH細胞。用流式細胞術(圖5a和b)和螢光顯微鏡(未給數據)分析了GFP表達。從圖5a可以看出，用AlPcS2a和光處理導致表達GFP的細胞的百分比強烈地增加。該報告分子陽性的細胞組分從沒有光處理時的1％，到曝光5分鐘後增加到50％。在不用光敏劑時用pEGFP-pLys處理的細胞中，光不增強GFP的表達。當用AlPcS2a和光聯合處理時，不相關的質粒(編碼血紅素加氧酶)與pLys的複合物不誘導綠螢光(未給出數據)。因而，以光定向的方式，PCI能充分地增加功能基因轉染到THX細胞中的效率。用TPPS2a作為光敏劑和BHK-21、HCT-116作為靶細胞得到了相似的結果(未給出數據)。基本上是非溶酶體定域的光敏劑3-THPP只誘導了GFP表達的微小增加(圖5b)。不與pLys形成複合物的pEGFP-N1的PCI不導致GFP表達(未給出數據)。
權利要求
1.一種在細胞表面表達抗原分子或其一部分的方法，所述方法包括通過光化學內化作用將抗原分子導入胞質，其中，所述分子或其一部分隨後呈現在所述細胞的表面。
2.如權利要求1中所述的方法，所述方法包括使所述細胞與所述抗原分子或其一部分以及光敏劑接觸，其中，所述分子和所述光敏劑各自被攝入到所述細胞的胞內膜限制區室中；和以有效波長的光照射所述細胞，以激活光敏劑，這樣所述胞內區室的膜被破壞，釋放出所述的分子進入到細胞的胞質中，而不殺死細胞，其中，所述釋放的抗原分子或其一部分隨後呈現在所述細胞的表面。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述抗原分子是能刺激免疫應答反應的分子。
4.如權利要求3所述的方法，其中，所述抗原分子是疫苗抗原或疫苗組分。
5.如前面權利要求中任一項所述的方法，其中，所述抗原分子是肽。
6.如前面權利要求中任一項所述的方法，其中，所述細胞是抗原呈遞細胞，它選自淋巴細胞、樹突細胞、巨噬細胞和癌細胞。
7.如前面權利要求中任一項所述的方法，其中，所述光敏劑選自卟啉、酞菁、紅紫素、二氫卟酚、二苯卟啉酞菁、陽離子染料、四環素和親溶酶體弱鹼或者它們的衍生物。
8.如權利要求7所述的方法，其中，所述光敏劑是TPPS4、TPPS2a或AlPcS2a。
9.如前面權利要求中任一項所述的方法，其中，所述抗原分子和/或光敏劑與一個或多個靶定向試劑或載體分子結合。
10.如前面權利要求中任一項所述的方法，其中，所述方法可在體外或體內進行。
11.如前面權利要求中任一項所述的方法，其中，所述抗原呈遞導致激發免疫應答反應。
12.一種疫苗接種的方法，該方法包括如前面權利要求中任一項所述的方法。
13.一種組合物，該組合物用於在細胞表面表達抗原分子或其一部分，所述組合物包括權利要求1到5或權利要求9中任一項所述的抗原分子和權利要求2或7到9中任一項所述的光敏劑。
14.一種細胞或其細胞群，該細胞在其表面表達有抗原分子或其一部分，該細胞可通過權利要求1到12中任一項所述的方法獲得。
15.用於治療的如權利要求13所述的組合物或權利要求14所述的細胞群。
16.如前面權利要求中所述的抗原分子和光敏劑在藥物製備中的用途，所述藥物可用於在細胞表面表達所述抗原分子或其一部分，以刺激免疫應答反應或激活CTLs。
17.如權利要求14所述的細胞群在藥物製備中的用途，所述藥物用於刺激免疫應答反應或激活CTLs。
18.如權利要求16或17所述的用途，其中，所述藥物用於疫苗接種。
19.如權利要求16到18中任一項所述的用途，其中，所述藥物用來治療病毒疾病、癌症或多發性硬化。
20.一種產品，該產品包括權利要求1到5或權利要求9中任一項所述的抗原分子，和權利要求2或7到9中任一項所述的光敏劑，該產品作為一種組合製品同時、分開或順序地用於在細胞的表面表達所述抗原分子或其一部分。
21.用於在細胞表面表達抗原分子或其一部分的試劑盒，所述試劑盒包括含有權利要求1到5或權利要求9中任一項所述的抗原分子的第一容器；和含有權利要求2或7到9中任一項所述的光敏劑的第二容器。
全文摘要
本發明提供一種在抗原呈遞細胞表面表達抗原分子或其一部分的方法,該方法包括通過光化學內化作用將分子導入胞質,其中所述分子或其部分隨後呈現在所述細胞的表面。本發明還提供疫苗接種方法,該接種方法包括上述方法,及包含所述細胞的組合物、和包括所述能表達抗原分子的細胞的用途。
文檔編號A61K47/22GK1376073SQ0080508
公開日2002年10月23日 申請日期2000年3月10日 優先權日1999年3月15日
發明者K·伯格, T·E·耶勒, A·霍格西特, L·普拉斯米凱特 申請人:福多庫爾聯合股份有限公司