一株木糖氧化無色桿菌菌株及其應用的製作方法

2023-09-23 15:51:50

專利名稱：一株木糖氧化無色桿菌菌株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株木糖氧化無色桿菌菌株及其應用。
背景技術：
牛仔布印染廢水含大量靛藍，致使色度較高，且靛藍的可生化性差，很難用微生物 直接處理含靛藍的印染廢水。應用漆酶脫色靛藍處理印染廢水，與目前採用物理的光氧化 法或投化學試劑沉降靛藍的方法處理相比，具有無二次汙染、可重複使用、成本低的優點， 且目前牛仔布印染廠廢水中不僅僅含有靛藍一種染料，還有大量的硫化黑染料，如果採用 漆酶脫色靛藍，硫化黑就很容易沉澱回收，否則，僅用化學試劑沉澱印染廢水就把兩種染料 沉澱在一起，還需進一步處理此廢棄物。應用漆酶脫色含靛藍的印染廢水，脫色後BOD顯著升高，COD基本不變，仍然較高， 不能達標排放。脫色產物中含有吲哚醌和鄰氨基苯甲酸，目前應用漆酶脫色靛藍仍處於研 究階段，脫色後產物吲哚醌和鄰氨基苯甲酸的微生物降解方法報導較少。

發明內容
本發明的目的是提供一株木糖氧化無色桿菌菌株及其應用。本發明提供的菌株為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) N4，其保 藏登記號為CGMCC Na · 3632。木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) N4 已於 2010 年 02 月 08 日保 藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區 北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC No . 3632。本發明提供的應用為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC No . 3632在降解吲哚醌、或者吲哚醌和鄰氨基苯甲酸中的應用。所述應用中，所述降解吲哚醌的方法，是將木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC Ns . 3632接種到含吲哚醌的體系中培養。所述應用中，所述降解吲哚醌和鄰氨基苯甲酸的方法，是將木糖氧化無色桿菌 (Achromobacter xylosoxidans) N4 CGMCC Ns . 3632接種到含吲哚醌和鄰氨基苯甲酸的體 系中培養。所述應用中，所述木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) N4 CGMCC Na . 3632先經過28°C液體培養24_48h，將培養獲得的發酵液以體積百分比為5%接種量接 種到含吲哚醌的體系中。所述液體培養用的培養基為由牛肉膏3g/L，蛋白腖10g/L，NaCl 5g/L和水組成的培養基。所述應用中，上述木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC N2. 3632在含吲哚醌的體系或含吲哚醌和鄰氨基苯甲酸的體系中培養的溫度為 250C -35°C，優選為 28V。所述應用中，所述含吲哚醌的體系中吲哚醌的濃度為500mg/L以下，優選為100mg/L。所述含吲哚醌和鄰氨基苯甲酸的體系中，所述吲哚醌和鄰氨基苯甲酸的體系中， 吲哚醌和鄰氨基苯甲酸的濃度均為500mg/L以下，優選為100mg/L。實驗證明，木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)N4 CGMCC Ns. 3632 能夠快速高效地降解吲哚醌和鄰氨基苯甲酸，可用於生物法處理靛藍經漆酶脫色後的印染 廢水。木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC Ns . 3632既可以降解 吲哚醌，也可以降解鄰氨基苯甲酸，可以用於單獨含有吲哚醌或鄰氨基苯甲酸的體系中，也 可以用於它們的混合體系中，降解吲哚醌或鄰氨基苯甲酸。


圖1為28 °C,180rpm搖床條件下木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4CGMCC Na . 3632 菌株對 100mg/L 吲哚醌的降解曲線。圖2為28 °C,180rpm搖床條件下木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) N4CGMCC Na . 3632菌株對100mg/L吲哚醌和100mg/L鄰氨基苯甲酸混合物 的降解曲線。圖3為28 °C,180rpm搖床條件下木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4CGMCC Na . 3632菌株對50-150mg/L鄰氨基苯甲酸的降解曲線。圖4為28 °C,180rpm搖床條件下木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4CGMCC Na . 3632菌株對200_500mg/L鄰氨基苯甲酸的降解曲線。
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材 料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實施例1、木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) N4 CGMCC Na . 3632 的分離、純化及鑑定。2009年5月，應用無菌水將牛仔布印染廢水處理池的活性汙泥(採自浙江省海 寧市某牛仔布印染廠)進行稀釋，塗固體培養基(1L固體培養基含牛肉膏3g，蛋白腖10g， NaCl 5g，瓊脂15g，其餘為水)平板，分離到18株菌，採用平板劃線的方法純化菌株。將分離 純化後的18株菌分別用接種環接入液體培養基(1L培養基含牛肉膏3g，蛋白腖10g，NaCl 5g，其餘為水)進行液體培養，培養溫度為28°C，ISOrpm培養24_48h後，以5% (體積百分 含量)接種量加入到吲哚醌或鄰氨基苯甲酸水溶液中，液相色譜測定結果顯示N4菌株能夠 快速高效地降解吲哚醌和鄰氨基苯甲酸，可用於生物法處理靛藍印染廢水。N4菌株生理生化實驗結果如表1所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列1所 示。根據細胞顯微形態、生理生化數據和16S rRNA基因序列數據，將菌株N4鑑定為木糖氧 化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)，並於2010年02月08日保藏於中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3 號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC No . 3632。表1、理化實驗結果 實施例 2、木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) N4 CGMCC Na . 3632 對吲哚醌降解的效果驗證試驗
一、對100 mg/L吲哚醌的降解效果驗證試驗木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)N4 CGMCC Ns . 3632 的培養 基固體培養基(IL)牛肉膏3g，蛋白腖10g, NaCl 5g，瓊脂15g，其餘為水。液體培養基(IL)牛肉膏3g，蛋白腖10g，NaCl 5g，其餘為水。將木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) N4 CGMCC Ns · 3632 接種到 液體培養基中，28°C，180印m條件下培養24_48h，至培養液的0D_為0. 6，然後在非無菌 環境中，將培養液按照體積百分比為5%的量接種到100 mg/L吲哚醌的水溶液中，對照組 加入按照體積百分比為5%的蒸餾水，28°C，ISOrpm培養，於不同時間取樣離心，上清液用
0.22um微孔濾膜過濾，應用高效液相色譜儀(採用美國Agilent公司Agilem 1200高效液 相色譜儀進行分析，色譜柱為C18柱(4. 6X 150mm)，流動相V(甲醇)V(水)=60 40， 流速1 mL/min，檢測器為UV-可見檢測器，檢測波長為254nm，進樣量為10 μ L)檢測吲哚醌 的含量。吲哚醌是以初始含量為100%，降解過程中其它檢測含量值為與初始含量的比值換 算的百分含量為相對含量。新物質是以降解過程中最高含量為100%，其它檢測含量值為與 最高含量的比值換算的百分含量為相對含量。結果表明，在Ν4菌株的作用下，吲哚醌水溶液的黃色逐漸減退。液相色譜顯示，在 Ν4菌株的作用下，吲哚醌峰逐漸變小，直至消失，而對照組在實驗前後吲哚醌未有顯著改變。如圖1所示，Ν4菌株在100 mg/L吲哚醌水溶液中180rpm震蕩培養12h，對吲哚醌 的降解率為94. 42% 士0. 29，18h達到完全降解；N4菌株在降解吲哚醌的同時，產生一種新 物質，此物質在18h相對含量達到最高，而後逐漸降低，48h時含量(8. 05% )低於實驗起始 含量(24. 12% )。同樣實驗條件下的對照組吲哚醌濃度在實驗前後基本保持不變。二、對不同濃度吲哚醌降解的效果驗證試驗木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)N4 CGMCC Ns .3632 對不同濃 度吲哚醌的降解將木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) N4 CGMCC Ns · 3632 接種於 液體培養基中，在28°C，ISOrpm培養24_48h，離心後收集菌體，用緩衝溶液(1L水中含有
1.5gK2HP04，0. 5gKH2P04，0. 2gMgS04. 7H20，1. OgNaCl，1. Og (NH4) 2S04，其餘為水)洗菌 3 次，用 緩衝溶液重懸菌體獲得OD6tltl為0. 6的菌懸液，將菌懸液按照體積百分比為5%的量分別接 種到 50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L 或 500mg/L 的吲哚醌水溶液中， 28°C，ISOrpm震蕩，於不同時間取樣離心，上清液用0. 22um微孔濾膜過濾，應用高效液相色 譜儀(採用美國Agilent公司Agilent 1200高效液相色譜儀進行分析，色譜柱為C18柱 (4. 6 X 150mm)，流動相V (甲醇)V(水)=60 40，流速lmL/min，檢測器為UV-可見 檢測器，檢測波長為254nm，進樣量為IOyL)檢測吲哚醌的含量。結果表明，接入木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC Na . 3632 後，50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L 的吲哚醌分別 在16h、24h、24h、36h、36h、72h、84h內達到完全降解；同時生成的新物質分別在16h、24h、 24h、24h、36h、48h、60h 達到最高，而後分別於 32h、56h、56h、60h、72h、96h、96h 低於實驗起
始含量。
6
實施例3、木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) N4 CGMCC Na . 3632 對吲哚醌和鄰氨基苯甲酸混合物降解的效果驗證試驗木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)N4 CGMCC Ns . 3632 的培養 基固體培養基(IL)牛肉膏3g，蛋白腖10g, NaCl 5g，瓊脂15g，其餘為水。液體培養基(IL):牛肉膏3g，蛋白腖10g，NaCl 5g，其餘為水。將木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) N4 CGMCC Ns . 3632 接種到 液體培養基中，28°C，ISOrpm條件下培養24_48h，至培養液的0D_為0. 6，然後在非無菌環 境中，將發酵液按照體積百分比為5%的量接種到含有100mg/L吲哚醌和100mg/L鄰氨基苯 甲酸的混合體系中，對照組為在混合體系中加入體積百分比為5 %的蒸餾水，28 V，ISOrpm 培養，於不同時間取樣離心，上清液用0. 22um微孔濾膜過濾，應用高效液相色譜儀(採用美 國Agilent公司Agilent 1200高效液相色譜儀進行分析，色譜柱為C18柱(4. 6X 150mm)， 流動相V(甲醇)V(水)=60 40，流速lmL/min，檢測器為UV-可見檢測器，檢測波 長為254nm，進樣量為IOyL)檢測吲哚醌和鄰氨基苯甲酸的含量。以初始含量為100%，降 解過程中其它檢測含量值為與初始含量的比值換算的百分含量為相對含量。結果表明，在N4菌株的作用下，溶液的黃色逐漸減退。液相色譜結果顯示，在N4菌 株的作用下，吲哚醌峰逐漸變小，直至消失，鄰氨基苯甲酸峰值呈現先上升後下降的趨勢， 可能是吲哚醌降解過程中產生的新物質對鄰氨基苯甲酸峰值的影響，而對照組在實驗前後 吲哚醌和鄰氨基苯甲酸峰值未有顯著改變。如圖2所示，N4菌株在100mg/L吲哚醌和100mg/L鄰氨基苯甲酸的混合體系中 ISOrpm震蕩培養42h內，菌體處於生長停滯期，42h_72h為對數生長期，在此期間的42h_66h 鄰氨基苯甲酸含量迅速降低。培養60h，N4菌株對吲哚醌的降解率達到100%，對鄰氨基苯 甲酸的降解率達到53. 26%;培養66h，N4菌株對吲哚醌的降解率為100%，對鄰氨基苯甲酸 的降解率為93. 72%。實施例4、木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) N4 CGMCC Na . 3632 對鄰氨基苯甲酸降解的效果驗證試驗木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)N4 CGMCC Ns . 3632 的培養 基固體培養基(IL)牛肉膏3g，蛋白腖10g, NaCl 5g，瓊脂15g，其餘為水。液體培養基(IL)牛肉膏3g，蛋白腖10g，NaCl 5g，其餘為水。一、木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC Ns · 3632 對 100mg/L鄰氨基苯甲酸溶液的降解將木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) N4 CGMCC Ns · 3632 接種到 液體培養基中，28°C，ISOrpm條件下培養24_48h，至培養液的0D_為0. 6，然後在非無菌環 境中，將培養液按照體積百分比為5%的量接種到100mg/L鄰氨基苯甲酸的水溶液中，對照 組加入按照體積百分比為5%的蒸餾水，28°C ISOrpm震蕩培養，於不同時間取樣離心，上清 液用0.22um微孔濾膜過濾，應用高效液相色譜儀(採用美國Agilent公司Agilent 1200 高效液相色譜儀進行分析，色譜柱為C18柱(4. 6X 150mm)，流動相V(甲醇)V(水)= 60 40，流速lmL/min，檢測器為UV-可見檢測器，檢測波長為254nm，進樣量為IOyL)檢測鄰氨基苯甲酸的含量。液相色譜結果表明，在N4菌株的作用下，鄰氨基苯甲酸峰值逐漸變小，而對照組 在實驗前後鄰氨基苯甲酸峰值未有顯著改變。N4菌株在100mg/L鄰氨基苯甲酸水溶液中180rpm震蕩培養12h，鄰氨基苯甲酸濃 度為68. 01 士9. 66mg/L，24h鄰氨基苯甲酸濃度為3. 74士0. 05mg/L。同樣實驗條件下的對照 組鄰氨基苯甲酸濃度在實驗前後基本保持不變。二、木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC Ns. 3632在不同 溫度條件下對鄰氨基苯甲酸的降解將木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) N4 CGMCC Ns · 3632 接種到 液體培養基中，在28°C，ISOrpm培養24_48h，至培養液的OD6tltl為0. 6，然後在非無菌環境中， 將培養液按照體積百分比為5%的量接種到100mg/L的鄰氨基苯甲酸水溶液中，分別在室 溫情況下(10°C _20°0、251、301、351或401條件下，180印111震蕩，於不同時間取樣離 心，上清液用0. 22um微孔濾膜過濾，應用高效液相色譜儀(採用美國Agilent公司Agilent 1200高效液相色譜儀進行分析，色譜柱為C18柱(4. 6 X 150mm)，流動相V (甲醇)V (水) =60 40，流速lmL/min,檢測器為UV-可見檢測器，檢測波長為254nm,進樣量為10 μ L) 檢測鄰氨基苯甲酸的含量。結果表明木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) N4 CGMCC Na . 3632 在10°C -40°C均能降解鄰氨基苯甲酸，最適宜溫度範圍為25°C -35°c，24h降解率均在85% 以上；溫度波動幅度較大的室溫情況下(10°C -20°C )，24h降解率為28. 43%,72h降解率為 89. 18% ；40°C條件下24h降解率為22. 61%,48h降解率為92. 26%。三、木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)N4 CGMCC Ns. 3632對不同 濃度鄰氨基苯甲酸的降解將木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) N4 CGMCC Ns · 3632 接種 在液體培養基中，在28 °C，ISOrpm培養24_48h，至培養液的OD6tltl為0. 6，然後在非無菌環 境中，將培養液按照體積百分比為5%的量分別接種到50mg/L、75mg/L、100mg/L、150mg/L、 200mg/L、300mg/L、400mg/L或500mg/L的鄰氨基苯甲酸水溶液中，28°C，180rpm震蕩，於不 同時間取樣離心，上清液用0. 22um微孔濾膜過濾，應用高效液相色譜儀(採用美國Agilent 公司Agilent 1200高效液相色譜儀進行分析，色譜柱為C18柱(4. 6X 150mm)，流動相 V(甲醇)V(水)=60 40，流速lmL/min，檢測器為UV-可見檢測器，檢測波長為254nm， 進樣量為IOyL)檢測鄰氨基苯甲酸的含量。結果如圖3和圖4所示，該菌株對50mg/L、75mg/L、100mg/L和150mg/L的鄰氨基苯 甲酸水溶液16h的降解率分別為61. 19 %、49. 73 %、46. 49 %和8. 09 %，24h的降解率分別為 94. 05%,95. 06%,96. 27%和18. 69%，對150mg/L的鄰氨基苯甲酸水溶液32h的降解率為 93% ；對200mg/L的鄰氨基苯甲酸水溶液Id的降解率為4. 64%,2d的降解率為97. 92% ； 對300mg/L、400mg/L的鄰氨基苯甲酸水溶液前3d未見降解，在第4d —天內完全降解；對 500mg/L的鄰氨基苯甲酸水溶液，則前4d未見降解，而在第5d —天內完全降解。
權利要求
木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4，其保藏登記號為CGMCC№.3632。
2.木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) N4 CGMCC Ns .3632 在降解吲哚 醌、或者降解吲哚醌和鄰氨基苯甲酸中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述降解吲哚醌，是將木糖氧化無色桿菌 (Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC Ns . 3632 接種到含吲哚醌的體系中培養。
4.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述降解吲哚醌和鄰氨基苯甲酸，是將木 糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) N4 CGMCC Ns . 3632接種到含吲哚醌和鄰 氨基苯甲酸的體系中培養。
5.根據權利要求3或4所述的應用，其特徵在於所述培養溫度為25°C_35°C，優選為 28 °C。
6.根據權利要求3-5中任意一項所述的應用，其特徵在於所述含吲哚醌的體系中吲 哚醌的濃度為500mg/L以下，優選為100mg/L。
7.根據權利要求3-5中任意一項所述的應用，其特徵在於所述含吲哚醌和鄰氨基苯 甲酸的體系中吲哚醌和鄰氨基苯甲酸的濃度均為500mg/L以下，優選為100mg/L。
8.根據權利要求3-7中任意一項所述的應用，其特徵在於所述木糖氧化無色桿菌 (Achromobacter xylosoxidans) N4 CGMCC Ns . 3632 先經過 28°C液體培養 24-48 小時，再接 種到含吲哚醌的體系或含吲哚醌和鄰氨基苯甲酸的體系中。
9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於所述液體培養用的培養基為由牛肉膏3g/ L，蛋白腖10g/L，NaCl 5g/L和水組成的培養基。
全文摘要
本發明公開了一株木糖氧化無色桿菌菌株及其應用。該菌株為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4，其保藏登記號為CGMCC No.3632。木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC No.3632能夠快速高效地降解吲哚醌和鄰氨基苯甲酸，可用於生物法處理靛藍印染廢水。
文檔編號C12R1/025GK101914467SQ201010224650
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月2日 優先權日2010年7月2日
發明者常勝和, 李宗偉, 李月豔, 王雁萍, 秦廣雍, 董湘熔, 談重芳 申請人:鄭州大學