一種用馬尾松毛蟲解剖卵繁殖野蠶黑卵蜂的方法
2023-10-23 23:19:52 2
專利名稱：一種用馬尾松毛蟲解剖卵繁殖野蠶黑卵蜂的方法
技術領域：
本發明涉及用馬尾松毛蟲解剖卵繁殖野蠶黑卵蜂的方法。
背景技術：
膜翅目昆蟲在農林重要害蟲的生物防治方面正發揮著不可替代的重要作用。截至2001年，全世界引進天敵成功控制農林害蟲的情況為蚜小蜂科90例，繭蜂科53例，姬小蜂科23例，姬蜂科22例，金小蜂科17例，纓小蜂科9例，其他科共15例。以上所有生物防治的成功實例都是建立在這些寄生蜂在自然界就是寄生其特定的寄主的。這是生物進化過程中所建立起來的。
昆蟲利它素是指由一種昆蟲分泌並釋放到體外引起異種昆蟲個體產生行為反應的化學物質，並且該行為反應對接受者有利。利它素在寄生蜂的寄生行為中，主要起寄主定位、寄主識別和刺激產卵等重要作用，對捕食性昆蟲主要起搜尋獵物的作用。這是寄生蜂之所以寄生其天然寄主的原因。充分利用這一關鍵因子，將有助於建立一套全新的寄生蜂與寄主間的關係，打破傳統寄生方式。
野蠶黑卵蜂(Telenomus theophila Wu et Chen)屬膜翅目(Hymenoptera)緣腹細蜂科(Scelionidae)，是野蠶卵期的優勢寄生天敵，具有搜尋能力強、寄主專一、產卵量高等優點，目前在室內已經解決了大量繁殖的技術難題，可做到全年持續繁殖。高其康等研究發現，野蠶黑卵蜂對解剖來自桑蠶側輸卵管的卵的接受率(野蠶黑卵蜂表現出探查和鑽入行為)，遠小於對野蠶或桑蠶雌蛾自然解剖卵的接受率，表明自然解剖卵的表面存在能被野蠶黑卵蜂識別的物質。進一步研究發現，這種物質來源於野蠶或桑蠶雌蛾的性附腺中，定名為野蠶黑卵蜂寄主識別利它素。測定野蠶黑卵蜂對不同形狀並塗有野蠶黑卵蜂寄主識別利它素的錫球(人造卵)的反應級數表明，塗有野蠶黑卵蜂寄主識別利它素的錫球(人造卵)能強烈地誘導野蠶黑卵蜂對其產生寄生行為，這一結果為本發明提供了物質基礎，為擴展野蠶黑卵蜂寄主範圍的提供了必要條件。
馬尾松(Pinus massoniana Lamb.)屬松科松屬油松派(組)，全樹皆可利用，經濟效益較高，對氣候適應性強，對土壤要求低，生長迅速，是植樹造林的好樹種。廣泛分布於秦嶺、淮河以南，雲貴高原以東的17個省自治區、直轄市，面積約200萬KM2，居全國針葉林首位，蓄積居全國第四位。
馬尾松毛蟲Denduolimus punctatus(Walker)，屬鱗翅目(Lepidoptera)枯葉蛾科(Lasiocampidae)松毛蟲屬(Dendrolimus)，主要危害馬尾松，還可危害溼地松、火炬松等。在我國森林害蟲中，馬尾松毛蟲的危害面積最大，經常猖獗成災。而且，人體接觸松毛蟲毒毛後，易引起皮炎及關節腫痛，既影響林業生產，又危及人身健康。該蟲主要分布於華東、華中、西南、華南等地，南北跨15個省區。一年發生2-4代，發生世代的多少隨不同地區而異。松樹被害後，輕者造成材積損失，松脂減產，種子產量降低；重者針葉被吃光，形如火燒，造成松樹枯死，導致松墨天牛、松白星象鼻蟲、松小蠹蟲等蛀幹害蟲大發生，以致松林大面積死亡。同時松毛蟲具毒毛，人體接觸容易引起皮膚癢、皮炎、關節腫痛，嚴重時會致殘等疾病，影響人民身體健康。如廣東省五十年代至六十年代初，發生面積較小；自1964年開始，發生面積不斷擴大，危害程度日趨嚴重；據統計，自1964年至1991年，平均每年馬尾松毛蟲發生面積達300萬畝以上，最嚴重的是1988年和1991年，其中1988年發生面積880萬畝；1991年發生面積1825萬畝次，實際發生面積998萬畝，按針葉損失率50％以上，面積約為500萬畝，每畝損失木材0.1立方米計，1991年損失木材50萬立方米，經濟損失近1.5億元，按受災面積中產脂面積約150萬畝，每畝損失松脂30公斤計，1991年損失松脂4.5萬噸，經濟損失500萬元；據1991年統計，防治松毛蟲面積約1212萬畝次，投入防治經費約2000萬元。由此廣東省在1991年因松毛蟲災害造成直接經濟損失2億元以上。
馬尾松毛蟲在自然界的寄生性天敵有①寄生蜂主要的種類有松毛蟲黑卵蜂、毒蛾黑卵蜂、松毛蟲赤眼蜂、平腹小蜂，這些小蜂寄生在松毛蟲卵。兩色姬蜂，大腿蜂、紅頭小繭蜂、日本瘤姬蜂、黑胸姬蜂、花胸姬蜂主要寄生幼蟲和蛹；據調查，馬尾松毛蟲寄生蜂45種。②寄生蠅主要的種類有松毛蟲狹頰寄蠅，蠶飾腹寄蠅、傘裙追寄蠅、家蠶追姬蠅等。主要寄生老熟幼蟲和蛹。馬尾松毛蟲的數量消長與天敵的關係極為密切。上述寄生性天敵要利用並應用於生物防治的話，必須解決寄生性天敵的大量繁殖問題，這是寄生天敵應用於生物防治的最大瓶頸。
發明內容
本發明的目的是提供一種用馬尾松毛蟲解剖卵繁殖野蠶黑卵蜂的方法，應用本發明方法可增加馬尾松毛蟲的寄生天敵，拓展野蠶黑卵蜂的寄生寄主範圍，為進一步建立馬尾松毛蟲新的生物防治途徑提供有力的技術支撐。
本發明的用馬尾松毛蟲解剖卵繁殖野蠶黑卵蜂的方法，包括以下步驟1)從桑樹枝杆上採集野蠶卵，置培養箱內培養，獲得野蠶黑卵蜂；
2)解剖野桑蠶或桑蠶雌蛾性附腺的貯存部，從貯存部的分泌物中分離收集野蠶黑卵蜂寄主識別利它素；3)採集馬尾松毛蟲雌蛾的解剖卵，在馬尾松毛蟲解剖卵表面塗上野蠶黑卵蜂寄主識別利它素，涼幹；4)用經交配的野蠶黑卵蜂雌蜂寄生步驟3)的馬尾松毛蟲解剖卵，放入培養箱內培養，直至馬尾松毛蟲解剖卵中羽化出野蠶黑卵蜂。
本發明所指的野蠶黑卵蜂形態特徵符合1980年吳燕如等在動物分類學報第5卷第1期第79至83所描述的特徵。
本發明所指的馬尾松毛蟲屬鱗翅目、枯葉蛾科、松毛蟲屬，成蟲形態的特徵體色有灰白、灰褐、茶褐、黃褐等色。雌蛾體色比雄蛾淺。雄蛾體長20-28mm，翅展36-39mm，觸角羽狀，體一般茶褐到黑褐色，前翅橫線色深，明顯，中室白斑顯著，亞外緣黑斑內側褐色，腹部細削，末端尖。雌蛾體長18-29mm，翅展42-57mm，觸角短櫛狀。體、翅密被灰褐色鱗片、呈灰褐色、前翅中室白斑不明顯，前翅具5條深色橫線，外橫線略呈波浪狀紋，亞外緣斑列8-9個黑褐色，內側襯以淡棕色斑，腹部粗壯、末端圓。
本發明能用馬尾松毛蟲解剖卵繁殖野蠶黑卵蜂的特徵是寄生塗有野蠶黑卵蜂寄主識別利它素的馬尾松毛蟲解剖卵時，所用的野蠶黑卵蜂雌蜂必須已經與野蠶黑卵蜂雄蜂自然交配過。
本發明中用馬尾松毛蟲解剖卵繁殖野蠶黑卵蜂所用的野蠶黑卵蜂雌蜂其數量不限定。通常，為獲得更多的野蠶黑卵蜂，可將步驟1)獲得野蠶黑卵蜂在室內進一步用桑蠶卵繁殖。即採集桑蠶雌蛾的解剖卵作為野蠶黑卵蜂繁殖用的寄主卵，將桑蠶卵放入含步驟1)獲得的野蠶黑卵蜂容器中，供野蠶黑卵蜂寄生，繁殖野蠶黑卵蜂。
本發明用馬尾松毛蟲解剖卵繁殖野蠶黑卵蜂的生化培養箱的培養最佳溫度25±1℃，相對溼度為75±10％。
本發明的優點是1.採用本項發明的方法，可以使自然條件下不能寄生馬尾松毛蟲解剖卵的野蠶黑卵蜂能寄生，從而擴大野蠶黑卵蜂繁殖所用的寄主範圍，為進一步成功控制馬尾松毛蟲對馬尾松的危害創造了新的途徑。在實際應用中有其巨大潛力。一旦把本發明應用於防治馬尾松毛蟲，由於野蠶黑卵蜂能在實驗條件下大量繁殖的優點，即能解決因寄生蜂無法大量繁殖而導致的無法應用的難題，大大減少化學農藥及其他微生物的使用量，保護自然環境的可持續平衡發展，有效地控制害蟲的發生，其經濟和社會效益均將是巨大的。
2.具有較高的科學研究價值。本項發明打破了自然條件下寄生蜂與寄主間的對應關係，把原來不能寄生的非寄主轉變成能寄生的寄主，擴大了野蠶黑卵蜂的寄生範圍，開創了害蟲生物防治的新方法和新途徑。
具體實施例方式
實施例1)桑蠶卵的準備將從桑蠶蛹羽出後3-5小時的雌和雄成蛾經交配，交配時間2-5小時左右分開，放在一牛皮紙的糙面上並蓋上一報紙避光，待基本產滿卵時，更換牛皮紙，讓這些蛾繼續產卵。同時將產出的卵卡剪裁分開後，立即放入-20℃冰箱內保存，作為野蠶黑卵蜂繁蜂用的寄主卵。
2)野蠶黑卵蜂採集冬季在有野桑蠶發生的桑園中的桑樹枝杆上，採集野蠶卵。將採集的野桑蠶卵裝在寄生蜂收集瓶內。一端(大口端)用3層沙布封口，另一端(小口端)接一乾淨玻璃試管並朝向陽處，室溫放置。待野蠶黑卵蜂羽出後，每天更換接蜂試管，將換下試管內的野蠶幼蟲用毛筆引出，再將各管的野蠶黑卵蜂並在一起，使每管的蜂數為50～100頭左右。取一小塊棉花，沾20％蜂蜜稀釋液後，小心地貼在已接蜂管壁上，供新羽出野蠶黑卵蜂取食，然後將試管口用四層紗布封住並每天更換沾蜂蜜的棉花。
3)野蠶黑卵蜂的進一步繁殖野蠶黑卵蜂羽化第二天的上午，將上述步驟1)的桑蠶卵放入含野蠶黑卵蜂的玻璃試管中，供野蠶黑卵蜂寄生。當天下午，取出各管內的已寄生桑蠶卵卡(小心不讓野蠶黑卵蜂跑出試管)，然後將這些卵卡放入乾淨玻璃試管內，並在管壁上粘一小塊用水溼潤的棉花(以擠不出水為宜)。再用四層紗布封口，並用記號筆記在管壁上記上「野蠶黑卵蜂」及其代數和當天日期。注意，每管羽出蜂寄生次數以3次為宜。將作好標記的各管寄生卵置於生化培養箱內。培養箱的條件為溫度為25±1℃，相對溼度為75±10％，14小時光照，10小時黑暗，光照強度800Lux。每天保持各管內棉花的溼度，並觀察寄生卵的顏色變化情況，直寄生卵中羽化出新一代野蠶黑卵蜂。這些蜂可繼續重複擴大培養。也可作為寄生馬尾松毛蟲解剖卵的蜂。
4)野蠶黑卵蜂寄主識別利它素的提取和保存取剛羽化的桑蠶雌蛾，在冰臺上解剖，取得性附腺，用剪刀將性附腺從貯存部和分泌部交界處剪開，然後，一手用鑷子夾住貯存部近分泌端，懸在1.5mL離心管上，另一手用剪刀剪開貯存部近中輸卵管的會和處，使貯存部內的附腺分泌物自然流入離心管中，在收集的附腺分泌物中加入等體積滅菌無離子水，混勻後8000轉/分鐘離心5分鐘，收集上清液，分裝在離心管內，每管0.25mL，於-70℃保存或直接用於7)。
5)馬尾松毛蟲解剖卵採集在馬尾松毛蟲發生區採集活的馬尾松毛蟲繭，用刀削出馬尾松毛蟲蛹，放於內含吸水紙的培養皿中，待馬尾松毛蟲成蟲羽出，用解剖刀從雌成蛾腹部取出卵巢，放入一乾淨的燒杯中，加入生理鹽水，充分攪動以破卵巢膜，靜止片刻，這時成熟卵會優先沉入杯底。倒去上層液體，再加入生理鹽水，充分攪動，再去上層液體。這樣反覆幾次，直到獲得馬尾松毛蟲解剖卵。
6)馬尾松毛蟲解剖卵的野蠶黑卵蜂寄主識別利它素處理取上述步驟4)的蠶黑卵蜂寄主識別利它素，用滅菌無離子水稀釋4倍。將上述步驟5)獲得的馬尾松毛蟲解剖卵放入野蠶黑卵蜂寄主識別利它素溶液中，用鑷子逐一從野蠶黑卵蜂寄主識別利它素溶液中鑷出馬尾松毛蟲解剖卵置與乾淨的牛皮紙上，室溫中涼幹製成經野蠶黑卵蜂寄主識別利它素處理過的馬尾松毛蟲解剖卵卡。
7)馬尾松毛蟲解剖卵繁殖野蠶黑卵蜂將上述步驟2)或3)中的野蠶黑卵蜂引入乾淨的玻璃試管內，再將上述步驟6)準備好的馬尾松毛蟲解剖卵卡放入有野蠶黑卵蜂玻璃試管內，供野蠶黑卵蜂寄生，用四層紗布封口。寄生4小時後取出該寄生卵卡，放入生化培養箱內。培養箱的最佳條件為溫度為25±1℃，相對溼度為75±10％，14小時光照，10小時黑暗，光照強度800Lux。每天保持各管內棉花的溼度，並觀察寄生卵的顏色變化情況，直至馬尾松毛蟲解剖卵中羽化出新一代野蠶黑卵蜂。
權利要求
1.一種用馬尾松毛蟲解剖卵繁殖野蠶黑卵蜂的方法，包括以下步驟1)從桑樹枝杆上採集野蠶卵，置培養箱內培養，獲得野蠶黑卵蜂；2)解剖野桑蠶或桑蠶雌蛾性附腺的貯存部，從貯存部的分泌物中分離收集野蠶黑卵蜂寄主識別利它素；3)採集馬尾松毛蟲雌蛾的解剖卵，在馬尾松毛蟲解剖卵表面塗上野蠶黑卵蜂寄主識別利它素，涼幹；4)用經交配的野蠶黑卵蜂雌蜂寄生步驟3)的馬尾松毛蟲解剖卵，放入培養箱內培養，直至馬尾松毛蟲解剖卵中羽化出野蠶黑卵蜂。
2.根據權利要求1所述的用馬尾松毛蟲解剖卵繁殖野蠶黑卵蜂的方法，其特徵是將步驟1)獲得野蠶黑卵蜂在室內用桑蠶卵進行繁殖。
3.根據權利要求1所述的用馬尾松毛蟲解剖卵繁殖野蠶黑卵蜂的方法，其特徵是步驟1)和4)所說的培養箱內培養的溫度為25±1℃，相對溼度為75±10％。
全文摘要
本發明公開了一種用馬尾松毛蟲解剖卵繁殖野蠶黑卵蜂的方法。該方法是利用從桑蠶或野桑蠶雌蛾性附腺中分離得到的野蠶黑卵蜂寄主識別利它素應用於馬尾松毛蟲解剖卵，使得野蠶黑卵蜂能寄生在自然界中不能寄生的馬尾松毛蟲解剖卵，並能在馬尾松毛蟲解剖卵內完成整個發育過程，直到從馬尾松毛蟲解剖卵中羽出野蠶黑卵蜂。從馬尾松毛蟲解剖卵中羽出野蠶黑卵蜂仍能進行世代繁殖。本發明方法有望挖掘野蠶黑卵蜂的寄生潛力，開發成為馬尾松毛蟲的又一天敵，為馬尾松林的長期保護，達到可持續發展作出貢獻，為進一步成功控制馬尾松毛蟲對馬尾松的危害創造了新的途徑。
文檔編號A01K67/00GK1545872SQ20031010944
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月10日 優先權日2003年12月10日
發明者高其康, 樓兵幹, 韋國棟, 胡萃 申請人:浙江大學