紫草素及其衍生物作為基因治療增敏劑的應用的製作方法

2024-01-21 19:24:15 1

紫草素及其衍生物作為基因治療增敏劑的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及紫草素及其衍生物在製備基因治療增敏劑中的應用。本發明優點在於：紫草素及其衍生物作為基因治療增敏劑具有相對較小的毒性；使用紫草素及其衍生物聯合基因治療進行惡性腫瘤治療時，紫草素及其衍生物本身的抗癌作用與其增強的基因治療的作用疊加，可以最大發揮抗腫瘤作用。
【專利說明】紫草素及其衍生物作為基因治療增敏劑的應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及基因治療領域，具體地說，是紫草素及其衍生物作為基因治療增敏劑的應用。

【背景技術】
[0002]紫草(英文名:Lithospermum erythrorhizon)是中醫學常用中藥,入藥種屬及部位為紫草科植物紫草、新藏假紫草或滇紫草的根。性寒，味甘、鹹；歸心、肝經；功效:涼血止血，清熱解毒；主治:血熱壅盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、溼疹、水火燙傷。紫草素是紫草的主要有效成分之一，分子式:C16H16O5，分子量:288.30 g/mol。紫草素具有抗炎作用，這種作用是通過抑制腫瘤壞死因子_a (TNF-a)造成的，而TNF_a是形成和持續炎症的重要因素。另外紫草素還具有抗細菌，抗真菌，和抗HIV的作用。
[0003]基因治療(Gene therapy)是利用分子生物學方法將目的基因導入患者體內，使之表達目的基因產物，從而使疾病得到治療，為現代醫學和分子生物學相結合而誕生的新技術。rAAV是目前基因治療領域應用最廣泛的病毒載體，目前正在越來越多地應用到肝癌的基因治療中。使用rAAV作為載體的研究都取得了一定的肝癌抑制效果，但並沒有確定靶向肝癌最好的rAAV血清型；而作為殺傷性治療，對肝癌細胞的獨特靶向性是至關重要的。另夕卜，臨床使用rAAV，降低用量，保證安全至關重要，怎樣將對肝癌靶向性最好rAAV感染效率最大化，目前還沒有人提出解決方案。


【發明內容】

[0004]本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供紫草素及其衍生物在製備基因治療增敏劑中的應用。
[0005]為實現上述目的，本發明採取的技術方案是:紫草素及其衍生物在製備基因治療增敏劑中的應用。
[0006]所述的基因治療是指基於病毒為載體的基因治療。
[0007]所述的病毒是腺相關病毒。
[0008]所述的腺相關病毒是2型、3型、8型腺相關病毒。
[0009]所述的基因治療是以腺相關病毒為載體對肝癌的基因治療。
[0010]所述的紫草素衍生物是乙醯紫草素、去氧紫草素、消旋乙醯紫草素、1-甲氧基乙醯紫草素、β，β二甲基丙烯醯紫草素、2，3-二甲基戊烯醯紫草素、β-羥基異戊醯紫草素、β，β - 二甲基丙烯阿卡寧、乙醯阿卡寧、β -乙醯氧基異戊醯阿卡寧、β -羥基異戊醯阿卡寧。
[0011]所述的紫草素衍生物是乙醯紫草素、β，β 二甲基丙烯醯紫草素。
[0012]所述的基因治療是以攜帶天花粉蛋白基因的優化3型腺相關病毒為載體對肝癌的基因治療。
[0013]本發明優點在於: 1、紫草素及其衍生物作為基因治療增敏劑具有相對較小的毒性。已經發現的常用蛋白酶體抑制劑MG132具有較高的毒性，不能應用於臨床，硼替佐米作為一種蛋白酶體抑制劑用於臨床抗癌治療也產生了一定的毒副反應，紫草素及其衍生物作為植物來源的物質，在發揮基因治療增敏劑的作用時毒副作用較小；
2、使用紫草素及其衍生物聯合基因治療進行惡性腫瘤治療時，紫草素及其衍生物本身的抗癌作用與其增強的基因治療的作用疊加，可以最大發揮抗腫瘤作用。基因治療目前最常用的載體類型是病毒載體，其中又因非致病性而對腺相關病毒使用越來越廣泛，利用腺相關病毒的特殊靶向性治療惡性腫瘤是目前基因治療的研究熱點之一，在這一過程中紫草素及其衍生物作為蛋白酶體抑制劑本身就具有對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用，攜帶治療基因的腺相關病毒的治療作用被紫草素及其衍生物增強之後，可以疊加產生更強的抗腫瘤作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1.體外實驗挑選最佳中藥單體，DMSO作為陰性對照，MG132作為陽性對照。(A)HeLa細胞，不同藥物在多個濃度下處理I小時，然後5，000 MOI感染rAAV2_CMVp_hrGFP病毒，並藥物共同作用2小時，48小時後拍攝GFP照片，ImageJ軟體分析。(B)與實驗(A)相同方法，僅測試更小濃度跨度的紫草素效果。(C)HeLa細胞，所示4種藥物在實驗(A)中得出的最佳濃度處理I小時，然後5，000 MOI感染rAAV2-CB-EGFP病毒，並藥物共同作用2小時，48小時後拍攝EGFP照片，ImageJ軟體分析。(D)實驗(C)細胞拍照過後進行流式細胞術檢測。(E)HeLa細胞5，000 MOI感染rAAV2_CB_EGFP病毒，48小時後5 μ M紫草素或DMSO處理2小時，再48小時後拍攝EGFP照片，ImageJ軟體分析。
[0015]圖2.紫草素提高rAAV在肝癌細胞中的感染效率，DMSO作為陰性對照，MG132作為陽性對照。(A) Huh7細胞，紫草素多個濃度下處理I小時，然後5，000 MOI感染rAAV3-CB-EGFP病毒，並藥物共同作用2小時，48小時後拍攝GFP照片，ImageJ軟體分析。(B)與實驗(A)相同方法，僅換成rAAV2-CB-EGFP病毒。(C)Huh7細胞，紫草素採用實驗(A)測得的最佳濃度處理I小時，然後5，000 MOI感染rAAV3-UF50病毒，並藥物共同作用2小時,48小時後拍攝M-apple突光照片，ImageJ軟體分析。(D)實驗(C)的細胞拍照過後進行Fluc信號檢測。(E)紫草素化學結構式。
[0016]圖3.紫草素不改變AFP特異性啟動子的rAAV3在人肝臟細胞中的轉基因表達水平。(A)人肝細胞，紫草素多個濃度下處理I小時，然後5，000 MOI感染rAAV2-UF50病毒，並藥物共同作用2小時，48小時後檢測螢光素酶信號。(B)人肝細胞，紫草素多個濃度下處理I小時，然後5，000 MOI感染rAAV3-UF50病毒，並藥物共同作用2小時，48小時後檢測Fluc信號。(C) 5，000 Μ0Ι, rAAV3_AFP_EGFP病毒感染所示細胞，48小時後拍攝EGFP螢光照片，圖中為各組代表性照片。
[0017]圖4.體內實驗驗證紫草素對rAAV的增強效果。(A)C57BL/6小鼠，腹腔注射紫草素 lmg-3mg/kg/day,第 3 天通過尾靜脈系統注射 rAAV8-CB-Fluc_EYFP, I X 109vgs/mouse,第90天拍攝活體螢光照片，圖為各組代表性小鼠照片。(B)實驗(A)中各組小鼠在所示不同時間點拍攝活體螢光照片後，統計分析螢光強度。(C)實驗(A)中所示兩組小鼠第90天處死，每鼠取等量肝組織提取全DNA並取三份，每份10ng qPCR檢測病毒基因組數量。
[0018]圖5.紫草素增強rAAV感染效率的機理。(A) Cy3染料標記的，或未標記的rAAV2-CB-Fluc病毒，分別2，000Μ0Ι，或20，000Μ0Ι感染HeLa細胞2小時，48小時後檢測相對Fluc信號信號強度。(B) Cy3染料標記的，或未標記的rAAV2_CB_Fluc病毒，2，000Μ0Ι感染HeLa細胞，感染前I小時和感染時2小時，同時紫草素5 μ M處理或DMSO處理，感染48小時後檢測相對Fluc信號信號強度。(C) Cy3染料標記的rAAV2-CB_Fluc病毒感染HeLa細胞，感染前I小時和感染時2小時，同時DMSO或紫草素5 μ M或MG132 5 μ M處理，分別在感染後2小時和24小時後衝洗並固定細胞，DAPI染色細胞核，拍攝共聚焦照片。綠色:細胞核，藍色:細胞質，紅色:Cy3。
[0019]圖6.紫草素增強rAAV感染效率的機理。(A) HeLa細胞，如圖所示藥物處理I小時，然後5，000 MOI感染rAAV2-CB-EGFP病毒，並藥物共同作用2小時。感染24小時後分離細胞質和細胞核，分別提取全DNA，用EGFP基因特異性引物進行qPCR檢測。(B)HeLa細胞，如圖所示藥物處理I小時，然後5，000 MOI感染rAAV2-CB-EGFP病毒，並藥物共同作用2小時。24小時後提取細胞總RNA，用隨機引物進行逆轉錄，並用EGFP特異性引物進行定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)。(C)HeLa細胞，如圖所示藥物處理I小時，然後5，000 MOI感染rAAV2-CB-EGFP病毒，並藥物共同作用2小時。2小時後收集獲取細胞並裂解，用泛素蛋白特異性抗體做western blot，GAPDH作為參照。(D) C57BL/6小鼠，尾靜脈注射rAAV8_UF50病毒，I X 109vgs/mouse, 100天後腹腔注射DMSO或紫草素lmg/kg/day,連續5天，並在如圖所示時間點拍攝活體螢光照片並統計分析。
[0020]圖7.紫草素對肝細胞癌的體外抑制作用。(A)所示細胞系同樣數量培養在96孔板中，用等倍稀釋的紫草素作用24小時，CCK-8試劑盒檢測活細胞相對數量，未加藥組設為100%。(B)所示細胞系同樣數量培養在96孔板中，用等倍稀釋的紫草素作用24小時，CCK-8試劑盒檢測活細胞相對數量，未加藥組設為100%。(C)實驗(B)同樣處理的細胞用LDH試劑盒檢測殺傷細胞相對數量，加細胞裂解液組設為100%。
[0021]圖8.紫草素對肝細胞癌的體內抑制作用。(A) NSG小鼠，右前肢腋窩皮下種植Huh7-Fluc腫瘤,待腫瘤生長至5mmX 5mm時開始腹腔注射紫草素lmg/kg/day,連續注射10天後活體螢光成像儀圖片。(B)實驗A的小鼠體內腫瘤在不同時間點的螢光信號強度量化數據。(C)停止用藥後第5天兩組小鼠的體重。
[0022]圖9.紫草素對小鼠正常臟器的影響。健康C57BL/6雄性小鼠15隻，如圖隨機分為三組，腹腔注射DMSO或紫草素lmg/kg/day，或紫草素4mg/kg/day，連續注射10天後處死小鼠，檢測血清 AST (A)、ALT (B)、ALP (C)值。
[0023]圖10.試驗中使用的rAAV基因組圖譜及TCS基因序列。(A) rAAV-CBAp-FIuc,rAAV-CBAp-EGFP，rAAV-AFPp-TCS病毒基因組結構示意圖。(B ) TCS基因原始核苷酸序列，起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)分別用綠色和紅色標記。(C)添加旗幟標籤的(Flag-tagged)TCS基因。Eco TtV和ZAo I限制性內切酶位點(加粗斜體)用於克隆化學方法合成的TCS基因，下劃線字體為包含終止密碼子(TAA)的旗幟標籤序列。
[0024]圖11.TCS基因載體的構建。(A)質粒pdsAAV-AFP-EGFP圖譜；(B)質粒pdsAAV-AFP-TCS-Flag 圖譜；(C)質粒 pdsAAV-AFP-TCS-TAA 圖譜。
[0025]圖12.天花粉基因體外對肝癌細胞的殺傷作用。(A)如圖所示質粒PEI方法轉染Huh7細胞，48小時後CCK-8試劑盒檢測存活細胞相對量；(B)如圖所示病毒100，000Μ0Ι感染Huh7細胞，48小時後CCK-8試劑盒檢測存活細胞相對量。
[0026]圖13.攜帶TCS基因的rAAV3對肝癌的體內殺傷作用。(A)第O天荷Huh7_Fluc腫瘤的小鼠尾靜脈注射病毒5 X 101° vgs/mouse,從第O天到第11天多次活體成像儀檢測腫瘤表達的Fluc信號；(B)第8天各組具有代表性的小鼠照片；(C)第11天處死小鼠後檢測血清中AST，ALT濃度。
[0027]圖14.紫草素與攜帶TCS基因的優化rAAV3共同治療肝癌的體內效果。如圖所示組別在第O天尾靜脈注射rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP病毒或rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS-Flag或PBS，並在第O天到第11天腹腔注射紫草素或PBS，活體成像儀在圖示的時間拍攝小鼠全身活體照片讀取並統計腫瘤部位Fluc信號。
[0028]圖15.聯合治療終點小鼠腫瘤直徑。圖9試驗中小鼠第11天處死並解剖獲取腫瘤，遊標卡尺測量腫瘤最大直徑。
[0029]圖16.紫草素與攜帶TCS基因的rAAV3共同治療肝癌對小鼠的肝功能影響。圖9試驗中小鼠第11天處死後取血檢測血清中AST (A)、ALT (B)濃度。
[0030]圖17.乙醯紫草素對rAAV感染效率的影響。
[0031]圖18.β，β -二甲基丙烯醯紫草素對rAAV感染效率的影響。
[0032]【【具體實施方式】】
下面結合附圖對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0033]實施例1紫草素對rAAV感染效率的影響一、實驗材料與方法
1.化合物，質粒，引物
高效液相層析(HPLC)級別的雷公藤紅素、扁蒴藤素、紫草素、薑黃素、芹黃素、白楊素、木禪草素和丹酌.酸 B 鹽購於 Sigma-Aldrich C0.LLC, St.Louis, USA,溶解於 DMSO, 5mg/ml濃度作為儲存液。HPLC 級別的 MG132 購於 Calb1chem, Merck KGaA, Darmstadt, Germany,5mg/ml 溶解於 DMSO。HPLC 級別的硼替佐米購於 Santa Cruz B1technology, Inc.SantaCruz, USA, 5m g/ml 溶解於 DMSO。
[0034]pHelper 質粒購於 Agilent Technologies, Santa Clara, USA。pdsAAV-CBAp-EGFP和pAAV-CBAp-Fluc，製備方法如下:利用分子克隆技術，將雞肌動蛋白啟動子(CBAp)驅動的增強型綠色螢光蛋白基因(EGFP)或螢光素酶基因(Fluc)嵌入到攜帶AAV2的末端重複序列(ITR)的質粒中，使嵌入的基因位於兩個ITR之間。pACG2質粒和 pdsAAV-CBAp-Fluc 質粒分別由 Wu 等(Wu J, Zhao ff, Zhong L, Han Z, Li B, Ma W,Weigel-Kelley KA, Warrington KH, Srivastava A: Self-complementary recombinantadeno—associated viral vectors: packaging capacity and the role of rep proteinsin vector purity.Human gene therapy 2007, 18 (2): 171-182.),和 Wang 等(Wang Y,Ling C, Song L, Wang L, Aslanidi GV, Tan M, Ling C, Srivastava A: Limitat1ns ofencapsidat1n of recombinant self-complementary adeno—associated viral genomesin different serotype capsids and their quantitat1n.Human gene therapymethods 2012，23 (4): 225-233.)構建。所有質粒均在使用之前進行了測序。
[0035]引物EGFP-F(5 ' -AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3 ' ) (SEQ ID N0.1)和 EGFP-R(5' -TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3' ) (SEQ ID N0.2)用來做逆轉錄聚合酶鏈反應(qTR-PCR)檢測。
[0036]2.細胞系培養
人宮頸癌細胞系HeLa，胚胎腎細胞系HEK293，和肝癌細胞系Huh7，均購於AmericanType Culture Collect1n (Manassas, VA,USA)。上述細胞均由完全 Dulbecco，s modifiedEagle medium 培養液(C-DMEM, Mediatech Inc.Herndon, USA)加 10% 熱滅活的胎牛血清(FBS, Sigma-Aldrich C0.LLC, St.Louis, USA), 1% 青黴素和鏈黴素(Lonza,ffalkersville, MD)。細胞貼壁培養在加溼，37°C，5% CO2環境下，需要時用胰酶-EDTA混合液(LonZa，Walkersville，MD，USA)室溫消化2-5分鐘，C-DMEM衝懸後傳代培養。人原代肝細胞購於 Triangle Research Labs (Research Triangle Park, North Carolina, USA),貝佔壁培養在加溼，37°C，5% CO2環境下原代培養。
[0037]3.rAAV 的製備
包裝:高純度的rAAV儲存液由三質粒轉染法製造(Ling C，Lu Y, Cheng B, McGooganKE, Gee Sff, Ma W, Li B, Aslanidi GV, Srivastava A: High-efficiency transduct1nof liver cancer cells by recombinant adeno—associated virus serotype 3 vectors.Journal of visualized experiments: JoVE 2011 (49).):
使用聚乙烯亞胺(polyethelenimine,PEI, linear, MW 25000, Polysciences, Inc.Warrington, PA，USA)將三種質粒共同轉染進HEK293細胞，6小時後更換細胞培養液。轉染72小時後收穫細胞,經過3次反覆凍融後用限制性內切酶及?flzoftase (Life Technology,Grand Island, USA)酶切破壞細胞基因組DNA。
[0038]純化:碘克沙醇(1dixanol,Sigma-Aldrich C0.LLC, St.Louis,USA)分層超高速離心法離心，然後用HiTrap SP/Q HP過濾柱(GE Healthcare,Piscataway,USA)離子交換法純化病毒顆粒，然後用磷酸鹽緩衝液(PBS，Mediatech Inc.Herndon, USA)衝洗，並用150K分子量尚心分尚濃縮器濃縮。
[0039]鑑定:病毒的物理基因組由southern blot測定。方法如下:10 μ I病毒儲存液稀釋到 100 μ I 加入限制性內切酶(Novagen, Darmstadt, Germany)在 37°C酶切 I小時，破壞所有病毒外殼蛋白以外DNA，加入相同體積的10mM NaOH在65°C作用30分鐘，便Benzonase酶失活並破壞外殼蛋白釋放病毒基因組DNA，並解鏈，放冰水混合物中快速冷卻。一種已知濃度且與病毒基因組相同序列的片段DNA同時相同方法解鏈。將含有DNA的溶液和進行凝膠電泳，ssAAV基因組選擇鹼性1.2%瓊脂糖凝膠，scAAV基因組選擇中性1.2%瓊脂糖凝膠。將DNA轉移到尼龍膜上，用Southern公布的方法(1975年)進行檢測。先將膠在I號溶液(0.25M HCl)中進行平衡，室溫，20分鐘；2號溶液(1M NaCl, 0.5M NaOH)，室溫，40分鐘；3號溶液(1M NaCl, 0.5M Tris-HCl)，室溫，40分鐘。在20xSSC溶液中，將膜上的 DNA 轉移到 Immobilon-NY +TM 膜(Millipore,Billerica,MA)上。經過交聯，將膜放置在25ml雜交液(6x SSC, 100 ug/ml煮沸過的魚精蛋白DNA，0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)，和5x Denhardfs溶液)中，68°C，6小時預雜交。將膜放置在含有煮沸過的32P-標記的DNA探針的雜交液中，68°C雜交18-20小時。用50ml的I號衝洗液(2x SSC,0.1% SDS)衝洗膜2次，室溫，每次15分鐘；再用50ml的2號衝洗液(0.1xSSC, 0.1% SDS)衝洗2次，68。。，30分鐘,在-70°C，使用 B1MAX MRTM X-ray 感光膠片(Kodak，Rochester，NY)曝光。
[0040]滴度測定:滴度由定量DNA slot blot方法測得，具體如下:高度純化的rAAV的物理顆粒滴度由定量DNA slot blot方法檢測。10 μ I病毒儲存液稀釋到100 μ I加入Benzonase限制性內切酶在37°C酶切I小時，破壞所有病毒外殼蛋白以外的DNA，加入相同體積的10mM NaOH在65°C作用30分鐘，使此瓜ase酶失活並破壞外殼蛋白釋放病毒基因組DNA，並解鏈。然後放冰水混合物中快速冷卻。一種已知濃度且含有與病毒基因組相同序列的質粒DNA同時相同方法解鏈。所有解鏈的DNA兩倍稀釋法點樣到Immobilon-NY +TM膜上(Millipore，Bedford，MA)。經過交聯，將膜放置在 25ml 雜交液(6x SSC, 100 ug/ml煮沸過的魚精蛋白DNA，0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)，和5x DenhardtJ s溶液)中，68°C，6小時預雜交。將膜放置在含有煮沸過的32P-標記的DNA探針的雜交液中，68V雜交18-20小時。50ml的I號衝洗液(2xSSC,0.1% SDS)衝洗膜2次，室溫，每次15分鐘；再用50ml的2號衝洗液(0.1xSSC, 0.1% SDS)衝洗 2 次，68°C，30 分鐘，在-70°C，使用 B1MAX MRTM X-ray感光膠片(Kodak, Rochester, NY)曝光。
[0041]4.篩選對rAAV感染效率增強效果最好的中藥單體
rAAV體外感染:細胞放置於普通96孔板，C-DMEM培養液中，5，000或10，000個細胞每孔。24小時後，細胞被空白處理或用相關藥物處理I小時，rAAV在C-DMEM中感染細胞2小時，同時伴有或不伴有相關的藥物處理。PBS衝洗細胞，並換C-DMEM繼續培養。感染48小時之後進行螢光檢測、螢光素酶信號檢測或流式細胞術檢測，分析轉基因表達。
[0042]螢光顯微鏡檢測:兩次獨立實驗，每次4個重複孔，拍照後使用ImageJ軟體定量分析。轉基因強度由統計整個視野的螢光像素數來判斷。
[0043]螢光素酶信號檢測:細胞培養並處理於白色底部透明96孔板中(Corning，cat#3610, Tewksbury, MA, USA),按說明書加入 Bright-Glo ?突光素酶檢測試劑(PromegaCorporat1n, Madison, WI, USA),使用 Fluoroskan Ascent FL 光度計(Thermo FisherScientific, USA)檢測各孔螢光素酶信號強度。
[0044]流式細胞術檢測:6孔板進行細胞培養，每組設3個副孔，實驗重複3次。藥物處理後的細胞經胰酶消化並用含2%FBS的PBS衝懸細胞，離心棄上清再用含2%FBS的PBS衝懸細胞，離心 _ 衝懸 2 次。FACS Calibur 流式細胞儀(Beckton Dickinson B1sciences,San Jose, CA，USA)分析螢光細胞數量、比例。
[0045]5.檢測不同中藥單體的細胞毒性
細胞存活量分析:細胞計數試劑盒-8 (Cell Counting Kit-8 CCK-8, DojindoMolecular Technologies, Gaithersburg, USA)被用來評價存活的細胞數。細胞放置在96孔板，C-DMEM培養液中，5，000個細胞每孔，24小時後空白處理或相關藥物在不同濃度處理，從0.16 μ Mo I/L到20 μ Mol/L。CCK-8溶液按照製造商推薦的方法加入每個孔中。相同培養條件下培養4小時後，用VERSAmax可調節微板檢測器(Sunnyvale，CA，USA)檢測450nm峰值下的吸光度。
[0046]6.分析中藥單體提高rAAV感染效率的機理
提取RNA，逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR):使用RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN，Gaithersburg, USA)獲取全 RNA, Reverse Transcript1n 系統(Promega, Fitchburg, USA)進行逆轉錄。然後使用 SYBR GreenER qRT-PCR SuperMix for iCycIer (Life Technology,Grand Island,USA)進行qRT-PCR擴增。中性膠分離的銳利的S28和18S rRNA條帶為完整的細胞RNA。
[0047]7.分析中藥單體提高rAAV感染效率的機理
細胞質核分離:6孔板每孔收集的細胞用175μ I預冷的RLN緩衝液(50 mmol/LTris-HCl,pH 8.0,140 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2 和0.5% Nonidet P_40)輕輕衝懸細胞。渦旋震蕩樣本10秒，放置冰上5分鐘，300 g離心2分鐘。收集上清液作為細胞質部分，沉澱作為細胞核部分。用western blot檢測細胞不同部分的純度,抗體如下:SantaCruz B1technology公司相關抗體和適合的二抗:抗IkB多克隆抗體(C_21)(細胞質部分)和antilamin B多克隆抗體(C-20)(細胞核部分)。
[0048]DNA 提取:使用 PureLink Genomic DNA Mini 試劑盒(Life Technology, GrandIsland, USA)從全細胞、細胞核、細胞質或動物組織中抽取全DNA，使用NanoDrop Lite分光光度計(Thermo Fisher Scientific，USA)測定DNA濃度，稀釋後每個qPCR反應體系加入300ng DNA並應用病毒基因組特異性引物來檢測病毒基因組DNA數量。
[0049]8.分析中藥單體提高rAAV感染效率的機理
Western blot分析:二燒基硫酸鈉(SDS), 1% Nonidet P-40,0.25%脫氧膽酸鈉和
Immol/L乙二胺四乙酸加蛋白酶抑制劑混合物，I mmol/L NaF和I mmol/L Na3VO4)裂解細胞。使用Bradford試劑(B1-Rad, Hercules, USA)檢測蛋白質濃度並將所有蛋白質濃度均一化，用12%SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離樣本，電轉到硝酸纖維膜上(B1-Rad，Hercules, USA)，將膜與相關的抗體在4°C孵育過夜。然後將膜與辣根過氧化物酶共軛二抗(GE Healthcare, Piscataway, USA)孵育，用增強化學突光底物(MEMD Millipore,Darmstadt, Germany)檢測。所有的膜都經過洗脫之後進行了抗-甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體的再次檢測，作為點樣參照。抗GAPDH抗體購於Thermo Scientific，USA，抗-泛素多克隆抗體購於 Santa Cruz B1technology, Inc.Santa Cruz, USA。
[0050]9.分析中藥單體提高rAAV感染效率的機理
共聚焦顯微鏡檢測rAAV在細胞內位置:Cellmask Orange plasma membrane染料購於 Life Technology, Grand Island, USA。單次反應 Cy3 染料購於 GE HealthcareB1-Sciences, Pittsburgh, USA。將 rAAV 保存液加入 Microcon YM-100 (EMD MilliporeCorporat1n, Billerica, MA, USA)離心過濾器按說明書濃縮，將濃縮的rAAV保存液與Cy3染料室溫孵育，並不斷震蕩。使用20K MWCO Slide-a-Lyzer MINI透析單元(ThermoFisher Scientific Inc, Rockford, IL, USA)按說明書透析。將透析產物加入 MicroconYM-100離心過濾器再次過濾，即獲得Cy3染色的rAAV。用Flurodish細胞培養盤(WorldPrecis1n Instruments C0.Sarasota, FL, USA)培養細胞，C-DMEM, 5，000 個細胞每盤。感染Cy3標記的rAAV，2或24小時後PBS衝洗，4%多聚甲醛37°C 10分鐘固定，再用PBS衝洗，用 20 μ g/ml DAPI (4' ,6-Diamidino-2_Phenylindole, Dihydrochloride, Sigma-AldrichC0.LLC, St.Louis，USA) 37。。10分鐘染色細胞核，再換成PBS，用Leica TCS SP5共聚焦顯微鏡63x油浸物鏡觀察並拍照。
[0051]10.rAAV體內感染效率的檢測及分析
實驗動物:所有的動物實驗由美國動物保護與使用委員會批准，並且按照佛羅裡達大學(Gainesville，FL, USA)或上海第二軍醫大學動物保護規範進行操作。6_10周鼠齡，體重 15_20g 的 nonobese diabetic/severe combined immunodeficient gamma (NSG)或C57BL/6，雄性或雌性小鼠購於Jackson實驗室(Bar Harbor, ME, USA)，餵養在佛羅裡達大學醫學院(Gainesville，FL, USA)，室溫，小鼠自由取水取食。
[0052]rAAV體內感染與螢光素酶信號分析:對小鼠進行rAAV尾靜脈注射，或直接腫瘤內注射。對於螢光報告基因，注射病毒8周之後獲取小鼠肝臟，然後對每個肝葉切片再用螢光顯微鏡觀察。對於Fluc報告基因，先對小鼠稱重計算獲得底物注射劑量，然後腹腔注射按 5 mg/mL 稀釋在 PBS 中的 D-1uciferin-K+ salt (Caliper Life Sciences, Hopkinton,USA)底物,4 mg/kg體重,並且麻醉小鼠,用裝備冷卻電子稱合器的Xenogen活體成像儀(Xenogen,Alameda, USA)拍攝突光素酶照片。信號密度用相機控制軟體Living Image統計，單位為光子/秒/平方釐米/球面度(p/s/cmVsr)。
[0053]11.統計
結果以中位數土標準差表示，採用SPSS 19.0統計軟體分析，多組均數比較用單因素方差分析，兩組均數比較用t檢驗，P〈0.05視為有統計學意義。
[0054]二、結果
1.紫草素對rAAV感染效率的影響
根據已有的報導，本發明選擇了共8種中藥單體提取物，分別是雷公藤紅素(Celastrol)、扁蒴藤素(Pristemerin)、紫草素(Shikonin)、薑黃素(Curcumin)、療黃素(Apigenin)、白楊素(Chrysin)、木禪草素(Luteolin)和丹酌.酸 b (Salvianolic acid b),測試了它們在HeLa細胞中對rAAV2_CMVp_hrGFP感染的增強作用，發現其中紫草素的效果最佳[圖1.A]。圖中紫草素從2.5 μ M組到5 μ M組的轉基因表達效率有一個突然的提高，為了進一步驗證其濃度依賴性的真實性，又檢測了紫草素從2.5 μ M到6 μ M更小濃度階梯變化對rAAV2介導的轉基因效率影響，證實了之前實驗的可信性[圖1.B]。另外，更換了包含另外一種報告基因的rAAV2-CB-EGFP病毒，選取前面實驗中效果最好的4種中藥單體提取物的最佳濃度再次檢測，紫草素的效果仍然最強[圖1.C]。此外流式細胞術檢測到了同樣的結果[圖1.D]。
[0055]我們的目標是用篩選出來最優的中藥單體聯合rAAV3治療肝癌，所以接下來測試了紫草素[圖2.E]在人肝癌細胞系——Huh7中對rAAV3-CB-EGFP感染效率的增強作用及濃度依賴性[圖2.A]，結果顯示紫草素仍然具有顯著的增強作用，但最佳濃度與在HeLa細胞系中有所區別。同樣在Huh7細胞系中，同樣濃度的紫草素也可以增強rAAV2-CB-EGFP的感染效率[圖2.B]。然後選取最佳濃度的紫草素作用於Huh7細胞系，換另外一種包含兩種報告基因的rAAV3-UF50，並檢測了兩種報告基因的表達情況，結果顯示兩種報告基因趨勢相同，並與之前實驗的增強趨勢相同[圖2.C，圖2.D]。
[0056]rAAV2在正常小鼠體內靶向肝臟最明顯，而rAAV3在正常小鼠體內幾乎不靶向任何器官。使用攜帶殺傷基因rAAV治療肝癌要避免殺傷正常肝臟細胞，接下來檢測了購於三角研究實驗室有限責任公司(Triangle Research Labs, LLC)的2位臨床捐贈者的人肝臟細胞。首先用rAAV2-UF50病毒感染，紫草素在一定濃度可以明顯增強感染效率[圖3.A]。rAAV3本身對肝細胞感染能力較弱，用攜帶CB啟動子加Fluc基因的rAAV3_UF50病毒感染人肝臟細胞效率較低，與紫草素聯合應用有一定提高，但與rAAV2相比有顯著差距[圖
3.B]。攜帶AFP啟動子加EGFP基因的雙鏈rAAV3可以高效感染Huh7細胞，但感染人肝細胞後不能檢測出轉基因表達，即使與紫草素聯用也無法檢測到綠色螢光[圖3.C]。這說明攜帶AFP特異性啟動子基因的rAAV3在體外可以選擇性的感染肝癌細胞系而不感染正常人肝細胞，並且紫草素不能增加這種rAAV3對人肝細胞的感染效率。至此，得出的結論是:紫草素作用於多種細胞時可以增強多種不同血清型rAAV的體外感染效率，但對攜帶AFP特異性啟動子的rAAV3，並不能在人肝臟細胞增強其感染效率，用於針對肝癌的靶向性基因治療相對安全。
[0057]2.紫草素對rAAV體內感染效率的影響
rAAV8在體外幾乎不能感染任何細胞，但其對小鼠肝臟的體內感染效率要遠高於其他任何rAAV血清型。為了檢測紫草素在體內能否增強感染效率已經很高的rAAV8，這次選用攜帶 Fluc 基因的 rAAV8-CB-Fluc-EYFP，I X 109vgs/mouse,尾靜脈注射 C57BL/6 品系小鼠，並在注射病毒的當天及前後2天，共5天連續腹腔注射紫草素lmg?3mg/kg/day，然後在不同時間段用活體成像儀拍攝小鼠照片[圖4.A]，並量化分析[圖4.B]。數據顯示紫草素Img組小鼠肝臟報告基因表達量在30天時開始顯著性高於對照組，在90天時Img組和2mg組均顯於對照組(P〈0.05)。說明紫草素可以在體內提高rAAV8的感染效率。第90天處死小鼠並獲取DMSO組和紫草素Img組小鼠的肝組織，提取全DNA後qPCR檢測rAAV8病毒基因組數量[圖4.C]，紫草素Img組明顯高於DMSO組。這說明紫草素可以幫助rAAV病毒基因組DNA更多保留在其靶器官細胞中，也進一步驗證了體外實驗的結果。
[0058]實施例2紫草素增強rAAV感染效率的機理 1.紫草素體外增強rAAV感染效率的機理
首先設計用Cy3染料標記rAAV2-CB-Fluc的外殼蛋白，然後用萊卡TCS SP5共聚焦顯微鏡觀察標記後的rAAV2-CB-Fluc-Cy3病毒外殼在HeLa細胞內的轉運情況。正式觀察之前，先檢測了標記後的rAAV2-CB-Fluc-Cy3病毒的生物活性，感染HeLa細胞，高劑量組和低劑量組的報告基因表達量都可以檢測到，但比同等劑量的未標記組有明顯降低[圖5.A]；另外，又檢測了紫草素對rAAV2-CB-Fluc-Cy3感染效率的影響，結果顯示紫草素仍然可以顯著增強其感染效率[圖5.B]，說明Cy3染料標記對rAAV生物活性有一定負影響，但可以接受。然後用rAAV2-CB-Fluc-Cy3感染HeLa細胞2小時和24小時，並用藥物幹預，觀察rAAV2-CB-Fluc-Cy3外殼在不同時間段細胞內的轉運情況。圖片顯示在紫草素和MG132作用下，細胞內rAAV外殼量略微更多，並且更多地聚集在細胞核周圍，但很少進細胞核[圖
5.C]。
[0059]下一步，檢測了細胞感染rAAV後，病毒基因組DNA在細胞質部分和細胞核部分比例的情況。rAAV2-CB-EGFP病毒感染24小時後，分離HeLa細胞的細胞質和細胞核，然後從兩部分提取全部DNA，做qPCR檢測病毒基因組DNA數量，可以看到紫草素和MG132處理過後，HeLa細胞的細胞核內的病毒基因組DNA數量與細胞質內病毒基因組DNA數量的比例都顯著高於單純病毒感染組。這說明紫草素可以幫助病毒基因組更多地進核[圖6.A]。本發明還檢測了總細胞內病毒基因組DNA轉錄的mRNA的數量，同樣是rAAV2_CB_EGFP病毒感染HeLa，24小時後提取細胞總RNA，用隨機引物進行逆轉錄，並用病毒基因組特異性引物進行定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)[圖6.B]。圖中可以看出不同濃度紫草素組的細胞內目標mRNA數量比DMSO組都有提高，而且從2.5μ M到5μ M有一個明顯的大幅度升高，這也跟報告基因的蛋白表達量的趨勢是一致的[圖1.Α]。以上都是從增加感染效率的方面驗證紫草素對rAAV的增強作用，接下來檢測了紫草素對細胞內的蛋白酶體通路的影響作用。HeLa細胞被紫草素或MG132處理過後，感染rAAV2_CB_EGFP病毒，2小時後收集全細胞，並裂解細胞做western blot，圖片中可以看到HeLa細胞被紫草素和MG132處理過後，全細胞的泛素蛋白含量明顯增高[6.C]，提示處理過這些藥物之後細胞內蛋白酶體對泛素化蛋白的降解作用被抑制。而且紫草素各組隨著用藥濃度的提高，泛素化蛋白的累計也逐步增多，有濃度依賴性。
[0060]2.紫草素體外、體內增強rAAV感染效率的作用階段
為了明確紫草素是否能幫助已經由rAAV介導表達相關蛋白質的細胞進一步增加蛋白質表達量，用rAAV2-CB-EGFP病毒感染HeLa細胞48小時後再用紫草素處理細胞，再過48小時後觀察，GFP螢光強度沒有顯著變化[圖1.E]。說明紫草素對rAAV轉基因表達的增強作用發生於病毒感染早期。
[0061]除了與rAAV同時給藥，我們還測試了在rAAV之後給藥。C57BL/6正常小鼠尾靜脈注射rAAV8-UF50病毒，I X 109vgs/mouse, 100天之後，按照肝臟Fluc強度平均分成兩組(每組5隻)，分別腹腔注射DMS0，或紫草素lmg/kg/day，連續5天，然後多次拍攝活體螢光照片，Fluc信號統計數據顯示兩組之間沒有統計學差異[圖6.D]。說明rAAV感染小鼠穩定表達蛋白質之後，注射紫草素並不能增加rAAV攜帶外源蛋白質基因表達量，提示紫草素作用於rAAV感染早期。
[0062]實施例3紫草素聯合攜帶殺傷基因的rAAV3治療肝癌
天花粉蛋白(Trichosanthin, TCS)來源於傳統中藥天花粉(Radicestrichosanthis),天花粉為多年生攀援草本植物，葫蘆科括樓屬，熱後iTrichosantheskirilowii Maxim)或雙邊括樓(,ricAosafliAes rosthornii Herms)的根。天花粉的功效為:清熱瀉火，生津止渴，消腫排膿，主治:熱病口渴、消渴、黃疸、肺燥咳血、癰腫、痔漏，等。TCS由247個胺基酸殘基組成，屬於I型核糖體失活蛋白(Ribosome-1nactivatingproteins, RIP),具有抑制多種腫瘤細胞生長、抗病毒、免疫調節、抗愛滋病病毒等多種藥理活性。Shaw PC等最早確認了 TCS基因的序列，其長度為870bp。本發明試圖將這段基因包裝進rAAV3並將其與紫草素聯合應用進行治療肝癌的研究。
[0063]一、實驗材料與方法 1.化合物，質粒，引物
HPLC 級別的紫草素購於 Sigma-Aldrich C0.LLC, St.Louis, USA,溶解於 DMSO, 5mg/ml 濃度作為儲存液。HPLC級別的MGl32 購於 Calb1chem,Merck KGaA, Darmstadt, Germany,5mg/ml 溶解於 DMSO。
[0064]pdsAAV-AFPp-EGFP 質粒由 Glushakova 等構建(Mingozzi F，High KA:Therapeutic in vivo gene transfer for genetic disease using AAV: progress andchallenges.Nature reviews Genetics 2011, 12 (5):341-355.)。TCS 基因由 LifeTechnologies 公司合成，基於公布的序列(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/M34858.1; T.kirilowii trichosanthin (TCS) mRNA, complete cds; GenBank:M34858.1)，並用限制性內切酶J職I細ind JJJ進行亞克隆，放進pdsAAV-AFPp-EGFP質粒中。所有質粒均在使用之前進行了測序。
[0065]2.細胞系培養
人宮頸癌細胞系HeLa，胚胎腎細胞系HEK293，肝癌細胞系Huh7，慢性髓細胞性白血病細胞系 K562,均購於 American Type Culture Collect1n (Manassas, VA, USA)。新型肝癌細胞系LH86由佛羅裡達大學醫學院病理科提供(Zhu H, Dong H, Eks1glu E, HemmingA, Cao M, Crawford JM, Nelson DR, Liu C: Hepatitis C virus triggers apoptosisof a newly developed hepatoma cell line through antiviral defense system.Gastroenterology 2007, 133 (5): 1649-1659.)。以上細胞均由 C-DMEM 培養液加 10% 熱滅活的FBS，1%青黴素和鏈黴素(L0nZa，WalkerSVille，MD)。一種新建立的人肝癌細胞系(Hep293TT) (Gao GP, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM: Noveladeno—associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy.Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences of the United States of America2002，99(18):11854-11859.)用完全 RPMI 1640 培養基(Life Technologies)培養，添加15%熱滅活FBS和1%青黴素和鏈黴素(Lonza，Walkersville，MD)。人原代肝細胞購於Triangle Research Labs, Research Triangle Park, North Carolina, USA 。細胞貝佔壁培養在加溼，37°C，5% CO2 環境下，胰酶-EDTA 混合液(Lonza, ffalkersville, MD，USA)室溫消化2-5分鐘，C-DMEM衝懸後傳代培養。
[0066]3.rAAV 的製備同實施例1。
[0067]4.細胞存活量及殺傷量分析
LDH 細胞毒性試劑盒(Thermo Fisher Scientific Inc.Waltham, MA, USA)被用來評價細胞殺傷情況。細胞計數試劑盒 _8 (Cell Counting Kit-8 CCK-8,Dojindo MolecularTechnologies, Gaithersburg, USA)用來評價存活的細胞數。細胞放置在96孔板，C-DMEM培養液中，5，000個細胞每孔，24小時後空白處理或相關藥物在不同濃度處理，從
0.16 μ Mol/L到20 μ Mol/L。LDH試劑盒:藥物處理24小時每孔取培養液50 μ I轉移到另一塊96孔板，每孔加50 μ I反應混合物室溫孵育30分鐘，加入30 μ I終止溶液，然後VERSAmax可調節微板檢測器(Sunnyvale, CA, USA)檢測490nm和680nm波段的吸光度,判斷細胞毒性。CCK-8試劑盒:相同96孔板中的細胞，CCK-8溶液按照製造商推薦的方法加入每個孔中。相同培養條件下培養4小時後,用VERSAmax可調節微板檢測器(Sunnyvale, CA, USA)檢測450nm峰值下的吸光度。
[0068]5.實驗動物同實施例1。
[0069]6.人肝癌異種接種小鼠模型
6-10周鼠齡的雄性或雌性NSG小鼠右前肢腋窩皮下注射約5 X 16個Huh7或H印293TT細胞。小鼠在無菌環境中培養直到實驗結束。
[0070]7.紫草素/rAAV3體內殺傷肝癌
rAAV體內感染與Fluc信號分析:同實施例1。
[0071]8.統計
結果以中位數土標準差表示，採用SPSS 19.0統計軟體分析，多組均數比較用單因素方差分析，兩組均數比較用t檢驗，P〈0.05視為有統計學意義。
[0072]二、紫草素對肝癌的殺傷作用及對臟器的影響 1.紫草素對肝細胞癌的體外殺傷作用
我們選用了 3種不同肝癌細胞系:常用的肝癌細胞系Huh7、一種在2009年初次報導的取自兒童的侵襲性肝癌細胞系ifep293TT (Chen TTj Rakheja D，Hung JYjHornsby PJj Tabaczewski P， Malogolowkin M， Feusner J， Miskevich F， SchultzRj Tomlinson GE: Establishment and characterizat1n of a cancer cell linederived from an aggressive childhood liver tumor.Pediatric blood & cancer2009，53(6):1040-1047.)、一種在2007年初次報導的從一個分化較好的人肝癌組織中分離的細胞系 LH86 (Zhu H, Dong H, Eks1glu E, Hemming A, Cao M, Crawford JM,Nelson DR, Liu C: Hepatitis C virus triggers apoptosis of a newly developedhepatoma cell line through antiviral defense system.Gastroenterology 2007,133(5): 1649-1659.)，以及正常肝臟原代培養細胞，在用不同濃度的紫草素處理24小時後用CCK-8試劑盒檢測了其對這些細胞的增殖抑制作用[圖7.A]。檢測結果顯示，紫草素對肝癌細胞系普遍具有增殖抑制作用，而對於原代培養的人肝細胞增殖抑制作用相對較弱，這也符合了其他人研究的發現:人的癌細胞比正常細胞對於蛋白酶體的抑制作用更為敏感。這種現象也更利於將來的臨床應用:選擇性抑制癌細胞而對正常細胞影響較小。為了鑑別紫草素是直接殺傷肝癌細胞，還是抑制細胞增值，接下來針對Huh7和HepRG兩種細胞系進行了 CCK-8試劑盒與LDH檢測試劑盒同時進行的檢測比較。同樣濃度梯度的紫草素處理，CCK-8試劑盒檢測活細胞比例[圖7.B]，LDH試劑盒檢測被殺傷細胞比例[圖7.C]。結果顯示紫草素有明確的直接殺傷作用。
[0073]2.紫草素對肝細胞癌的體內殺傷作用
選用免疫缺陷性小鼠品系，NSG小鼠，皮下種植Huh7-Fluc (攜帶Fluc基因的Huh7細胞系)腫瘤，待腫瘤生長至5_X 5mm時開始腹腔注射紫草素lmg/kg/day (實施例1中測得的小鼠體內增強rAAV感染效率的最佳濃度)，連續注射2周，活體螢光成像儀圖片[圖8.A]及螢光信號[圖8.B]統計顯示:用藥期間，用藥組的腫瘤細胞螢光強度顯著性低於DMSO對照組。而停止用藥後，用藥組小鼠的腫瘤螢光強度再次快速上升。這說明:紫草素可以抑制NSG小鼠體內Huh7-Fluc移植瘤的生長。在停止用藥5天後對小鼠稱重，兩組間沒有發現顯著性差異[圖8.C]，提示治療劑量紫草素對NSG小鼠的毒性作用不明顯。
[0074]3.對正常臟器的影響。
[0075]為了解紫草素對小鼠主要臟器功能的毒性，我們進行了一系列檢測。健康C57BL/6雄性小鼠15隻，隨機分為三組:DMS0組，紫草素Img組和紫草素4mg組，同時開始腹腔注射DMSO或紫草素lmg/kg/day,或紫草素4mg/kg/day,連續注射10天後處死小鼠,檢測血清AST、ALT、ALP值。結果顯示:AST兩個不同劑量治療組與空白對照組之間沒有顯著性差異[圖9.A] ；ALT和ALP，Img治療劑量組與空白對照組沒有顯著性差異，4倍治療劑量組對比空白對照組均有明顯降低[圖9.B.C]。
[0076]三、攜帶天花粉蛋白基因的優化rAAV3對肝癌的殺傷作用 1.天花粉蛋白基因對肝癌細胞的體外影響
根據已知的TCS基因序列[圖10.BKSEQ ID N0.3)，我們對其進行了合成，為了方便檢測其合成的蛋白質的表達，我們還在其基因序列末端加入了一個旗幟標籤(Flag tag)[圖10.C] (SEQ ID N0.4)。
[0077]基於已有包含報告基因的rAAV基因組質粒:含有肝癌特異性AFP啟動子pdsAAV-AFP-EGFP [圖11.A]，我們將含有旗幟標籤或不含有旗幟標籤的TCS基因序列通過分子克隆技術分別替換質粒中原有的EGFP基因，得到2種新的質粒:pdsAAV-AFP-TCS-Flag [圖 11.B]，pdsAAV-AFP-TCS-TAA [圖 11.C]。在包裝病毒之前，我們進行了質粒轉染實驗來測試上述6種質粒對肝癌細胞生長的影響。Huh7細胞轉染48小時後CCK-8試劑盒檢測存活細胞相對數量[圖11.A]。結果顯示pdsAAV-AFP-TCS-Flag質粒組細胞數量最少，與pdsAAV-CB-EGFP組相比有顯著差異(p〈0.01)。
[0078]根據轉染效果，我們選擇包裝了 rAAV3-T492V+S663V-AFP-TCS-Flag病毒來進一步研究。此病毒由突變型外殼蛋白攜帶一個由人甲胎蛋白啟動子(AFPp)驅動的TCS基因。這種AFPp啟動子理論上只有在高表達AFP的肝癌細胞內才可以被提高效率。首先我們進行了體外感染實驗，100, 000Μ0Ι感染Huh7細胞48小時，然後用CCK-8試劑盒檢測判斷細胞存活量，吸光度數值提示攜帶TCS基因的優化rAAV3在體外對肝癌細胞的生長有明顯抑制作用[圖12.B]。
[0079]2.TCS基因對肝癌細胞的體內影響
接下來進行了體內試驗。為了在腫瘤的早期，未觸摸到明顯腫瘤的時候就開始治療，我們還構建了一個基因修飾的人肝細胞癌細胞系:Huh7-Fluc，這個細胞系被一個由CBAp啟動子驅動Fluc基因的質粒穩定轉染，可以隨著細胞分裂在子代細胞中穩定表達Fluc蛋白，這樣的細胞形成的體內腫瘤在無法觸及的時候就可以被活體成像儀探測到。NSG小鼠右前肢腋窩皮下種植Huh7-Fluc腫瘤，2周後經拍攝活體螢光照片判斷移植成功，小鼠分為
2組，一組尾靜脈注射 rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS 病毒(第 O 天)，5X 101° vgs/mouse ；另外一組尾靜脈注射 rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP 病毒，5 X 101° vgs/mouse,作為對照。病毒注射的第O天、第3天、第8天和第11天，拍攝小鼠全身活體螢光照片。結果如[圖13.A]，儘管rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP組的小鼠Huh7_Fluc腫瘤漸進地生長，但rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS組小鼠的腫瘤卻被明顯抑制，直到第11天(p〈0.05)，而最大的腫瘤抑制效果出現在第8天(p〈0.01)。第8天各組具有代表性的小鼠全身Fluc信號照片見[圖13.B]。第11天處死小鼠後獲取血清檢測AST，ALT，兩組之間無明顯差別[圖13.C]，提示rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS病毒有效抑制小鼠體內肝癌生長的同時對肝功能無明顯損傷。
[0080]四、紫草素與攜帶TCS基因的優化rAAV3共同治療肝癌
1.紫草素與攜帶TCS基因的優化rAAV3共同治療肝癌的體內效果接下來我們將紫草素和攜帶TCS基因的優化rAAV3聯合在小鼠體內應用，來觀察聯合抗肝癌效果。
[0081]NSG小鼠共20隻，全部右前肢腋窩皮下接種Huh7_Fluc腫瘤，2周後經活體成像儀檢測接種成功後，隨機分為5組，每組4隻。分別是:①空白對照組:第O天尾靜脈注射PBS，第O天至第11天腹腔注射PBS;②非治療基因組:第O天尾靜脈注射rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP 病毒 5 X 101° vgs/mouse,第 O 天至第 11 天腹腔注射 PBS ；③紫草素加非治療基因組:第O天尾靜脈注射rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP病毒5 X 101°vgs/mouse,第O天至第11天腹腔注射紫草素lmg/kg/day ;④治療基因組--第O天尾靜脈注射 rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS-Flag 病毒 5 X 101° vgs/mouse,第 O 天至第 11 天腹腔注射PBS 紫草素加治療基因組:第O天尾靜脈注射rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS-Flag病毒SXlOw vgs/mouse,第O天至第11天腹腔注射紫草素lmg/kg/day。病毒注射日期為第O天，在第0、3、8、11天使用活體成像儀拍攝小鼠全身照片，分析腫瘤組織中Fluc信號強度。結果如[圖14]，第11天時，非治療基因組與紫草素加非治療基因組之間有明顯差異(p〈0.05)，紫草素加非治療基因組更低，提示紫草素對腫瘤的生長有抑制作用；另外，非治療基因組與治療基因組之間有明顯差異(P〈0.05)，治療基因組更低，提示攜帶TCS基因的優化rAAV3對腫瘤的生長有抑制作用；還有，治療基因組與紫草素加治療基因組之間也有明顯差異(P〈0.05)，紫草素加治療基因組更低，提示紫草素聯合攜帶TCS基因的優化rAAV3可以更大程度抑制腫瘤的生長。據此得出的結論是:紫草素聯合攜帶TCS基因的外殼蛋白優化rAAV3對小鼠體內人肝癌種植瘤的抑制效果，比單獨使用紫草素或單獨使用攜帶TCS基因的外殼蛋白優化rAAV3都更強。
[0082]第11天處死小鼠，解剖獲得腫瘤，並測量直徑，結果如[圖15]，與腫瘤細胞表達的Fluc信號呈相同趨勢。
[0083]2.紫草素與攜帶TCS基因的優化rAAV3共同治療肝癌對小鼠的肝功能影響在上述實驗中，第11天處死小鼠時獲得血清，並檢測AST、ALT[圖16]，各組之間均無顯著差異，提示治療劑量的紫草素和/或攜帶TCS基因的優化rAAV3治療小鼠肝癌時，對肝功能影響不明顯。
[0084]五、結論
1.紫草素本身具有體外、體內抗肝癌的作用；
2.TCS基因經過介導具有在體外、體內抗肝癌的作用；
3.紫草素與攜帶TCS的優化rAAV3聯合應用，對小鼠體內人肝癌移植瘤的抑制效果優於紫草素或攜帶TCS的優化rAAV3任何一個單獨使用；
4.有效治療劑量的紫草素和/或攜帶TCS基因的rAAV3不會對小鼠肝臟造成明顯損害。
[0085]通過一系列的體外和動物體內實驗研究，證明了「紫草素聯合攜帶天花粉蛋白基因的優化3型重組腺相關病毒用於治療人肝細胞癌比單獨應用紫草素或攜帶天花粉蛋白基因的優化3型重組腺相關病毒能獲得更好的治療效果」，此結果為在基因治療領域開展中西醫結合研究提供了科學的實驗依據。
[0086]實施例4紫草素衍生物對rAAV感染效率的影響一、實驗材料與方法
1.化合物
高效液相層析(HPLC)級別的乙醯紫草素(Acetylshikonin)，β, β-二甲基丙烯醯紫草素(β , β -Dimethylacrylshikonin),溶解於 DMS0,20mmol 濃度作為儲存液。
[0087]2.細胞系培養
人宮頸癌細胞系 HeLa,由完全 Dulbecco』 s modified Eagle medium 培養液(C-DMEM，Mediatech Inc.Herndon, USA)加 10% 熱滅活的胎牛血清(FBS, Sigma-Aldrich C0.LLC,St.Louis，USA)，1%青黴素和鏈黴素(Lonza，Walkersville，MD)。細胞貼壁培養在加溼，37°C, 5% CO2環境下，需要時用胰酶-EDTA混合液(Lonza，ffalkersville, MD，USA)室溫消化2-5分鐘，C-DMEM衝懸後傳代培養。
[0088]3.rAAV體外感染
細胞放置於白色96孔板，C-DMEM培養液中，10，000個細胞每孔。24小時後，細胞被空白處理或用相關藥物處理I小時，rAAV2-UF50在C-DMEM中感染細胞2小時，同時伴有或不伴有相關的藥物處理。PBS衝洗細胞，並換C-DMEM繼續培養。感染48小時之後進行螢光檢測、螢光素酶信號檢測或流式細胞術檢測，分析轉基因表達。
[0089]4.統計
結果以中位數土標準差表示，採用SPSS 19.0統計軟體分析，多組均數比較用單因素方差分析，兩組均數比較用t檢驗，兩個構成比比較用卡方檢驗。P〈0.05視為有統計學意義。
[0090]5.結論
請參見附圖17和附圖18，由圖示結果可知，乙醯紫草素，β，β - 二甲基丙烯醯紫草素，在一定濃度下作用細胞，可以顯著增強rAAV的感染效率。
[0091]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本【技術領域】的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.紫草素及其衍生物在製備基因治療增敏劑中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的基因治療是指基於病毒為載體的基因治療。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述的病毒是腺相關病毒。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述的腺相關病毒是2型、3型、8型腺相關病毒。
5.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的基因治療是以腺相關病毒為載體對肝癌的基因治療。
6.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的紫草素衍生物是乙醯紫草素、去氧紫草素、消旋乙醯紫草素、1-甲氧基乙醯紫草素、β，β二甲基丙烯醯紫草素、2，3-二甲基戊烯醯紫草素、β -羥基異戊醯紫草素、β，β - 二甲基丙烯阿卡寧、乙醯阿卡寧、β -乙醯氧基異戊醯阿卡寧、羥基異戊醯阿卡寧。
7.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的紫草素衍生物是乙醯紫草素、β， 二甲基丙烯醯紫草素。
8.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的基因治療是以攜帶天花粉蛋白基因的優化3型腺相關病毒為載體對肝癌的基因治療。
【文檔編號】A61K48/00GK104127885SQ201410334493
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】凌昌全, 王園, 王麗娜, 張院輝 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學