螢光標記益生菌菌液及分析益生菌在腸道內吸附、定植狀況的方法
2023-10-07 05:01:44 2
專利名稱：螢光標記益生菌菌液及分析益生菌在腸道內吸附、定植狀況的方法
螢光標記益生菌菌液及分析益生菌在腸道內吸附、定植狀況的方法 技術領域-
本發明涉及一種操作簡單、形象生動、能準確地描述益生菌在動物腸道內 吸附、定植狀況的螢光標記益生菌菌液及用螢光標記益生菌菌液分析益生菌在 腸道內吸附、定植狀況的方法。
背景技術：
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益生菌是一類來源於自然界和健康動物腸道的微生物，通過分泌、產生短 鏈脂肪酸、H202和細菌素等物質，對病原微生物具有顯著的抑制和殺滅作用，
從而具有對動物腸道菌群的調節功能；同時，能分泌B簇維生素、胺基酸和多 種消化酶類，可促進動物腸絨毛的發育、促進營養物質的消化和吸收、加快動 物生長，達到了替代飼用抗生素的目的；另外，益生菌還具有剌激和激活免疫 細胞活性、調節免疫功能的作用。
隨著人們對食品安全越來越重視，益生菌作為動物飼料添加劑也越來越受 到人們的關注，上述益生菌對動物的作用效果與其在動物腸道內的生長、繁殖 有著直接關係，即益生菌在動物腸道內吸附、定植狀況是確保益生菌發揮作用 的主要因素之一。多年來，人們對益生菌的研究從未間斷，使益生菌從理論到 實際應用都有了較快的發展。但迄今為止，對於益生菌在腸道中如何吸附、定 植的機理研究及排洩過程的研究等一直無法客觀評價，絕大多數採用體外上皮 細胞吸附試驗進行研究，亦有科研人員採用腸道超薄切片等方法觀察益生菌在 腸道內的定植情況，然而，這些研究方法都不能正確描述益生菌在動物腸道內 的動態過程，具有一定的局限性。
發明內容
本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種操作簡單、 形象生動、能準確地描述益生菌在動物腸道內的吸附、定植狀況的螢光標記益 生菌菌液及用螢光標記益生菌菌液分析益生菌在腸道內吸附、定植狀況的方法。
本發明的技術解決方案是 一種螢光標記益生菌菌液，其特徵在於由下述 方法製成
a.將益生菌按0.2~20%接種量接種於初始pH5.5~8.5的液體MRS培養基
中，於30 45"C振蕩培養至對數生長期；
b. 使用高速冷凍離心機2 1(TC、 5000 15000rpm離心2 20min，去掉上清 液，用pH5.5 8.5PBS洗滌3次後，重新懸浮，使濃度達到106'9CFU / ml;
c. 將b步驟所得菌液與溶解於0.01~0.5mol/lNa2COj[] 0.05~0.25mol/lNacl 緩衝液中螢光標記物溶液混合，螢光標記物的濃度是0.5 5mg/ml溶液混合，菌 液與螢光標記物溶液體積比為5 20: 1， 4'C標記0.5 3h後用pH5.5 8.5PBS洗 滌3次，重新懸浮，使濃度達到106-9CFU/ml。
應用上述的螢光標記益生菌菌液分析益生菌在腸道內吸附、定植狀況的方 法，步驟如下
a. 每隻雞飼餵0.2 2ml螢光標記益生菌菌液，為飼餵螢光標記益生菌組；
b. 飼餵後0.5~2h開始採集雞糞，用5mlpH5.5-8.5PBS溶解後，取少許於載 玻片上，塗布均勻；倒置螢光顯微鏡配置激發光主波長為334nm的UV激發濾 色鏡，使用20 80倍物鏡進行觀察；
c. 飼餵0.5 3h後，隨機抽取對照組及飼餵螢光標記益生菌菌液的肉雞各
一隻，放血致死，分別取每隻雞的腺胃、肌胃、十二指腸、空迴腸、盲腸或大
腸，使用pH5.5 8.5 PBS衝洗，除去內容物後再放入滅菌的平皿中，然後再用
pH5.5-8.5 PBS反覆洗滌3次，刮取各部位上皮細胞，懸浮於0.2~2.0ml
pH5.5-8.5PBS中，分別取少許於載玻片上，塗布均勻，於倒置螢光顯微鏡下觀 察；
d. 分別取l~5ml pH5.5 8.5PBS、肉雞飲用水、肉雞專用飼料PBS溶解物 於載波片上塗布均勻，於倒置螢光顯微鏡下觀察。
本發明是利用螢光標記物標記益生菌，通過跟蹤監測螢光標記益生菌在肉 雞消化道各段的情況，以準確地確定益生菌在動物消化道各段的吸附、定植狀 況。操作簡單、形象生動，可用於判斷每種益生菌或其他病原菌能否在動物體 內繁殖及其確定在體內的代謝周期，從而可了解益生菌或其他病原菌對動物作 用的過程，便於掌握益生菌對腸道定植或機體清除病原菌的動態變化。
圖1是本發明實施例詞餵螢光標記益生菌菌液3小時的肉雞十二指腸上皮 細胞照片。
圖2是本發明實施例飼餵螢光標記益生菌菌液18小時的肉雞十二指腸上皮 細胞照片。 圖3是本發明實施例詞餵螢光標記益生菌菌液30小時的肉雞十二指腸上皮 細胞照片。
圖4是本發明實施例飼餵螢光標記益生菌菌液110小時的肉雞十二指腸上 皮細胞照片。
圖5是本發明實施例飼餵螢光標記益生菌菌液134小時的肉雞十二指腸上 皮細胞照片。
圖6是本發明實施例飼餵螢光標記益生菌菌液254小時的肉雞十二指腸上 皮細胞照片。
圖7是本發明實施例飼餵螢光標記益生菌菌液326小時的肉雞十二指腸上 皮細胞照片。
圖8是本發明實施例對照組肉雞十二指腸上皮細胞照片。 圖9是本發明實施例飼餵螢光標記益生菌菌液2小時的肉雞排洩物照片。 圖10是本發明實施例伺餵螢光標記益生菌菌液18小時的肉雞排洩物照片。 圖11是本發明實施例飼餵螢光標記益生菌菌液74小時的肉雞排洩物照片。 圖12是本發明實施例詞餵螢光標記益生菌菌液110小時的肉雞排洩物照片。
圖B是本發明實施例飼餵螢光標記益生菌菌液158小時的肉雞排洩物照片。
圖14是本發明實施例詞餵螢光標記益生菌菌液230小時的肉雞排洩物照片。
圖15是本發明實施例飼餵螢光標記益生菌菌液326小時的肉雞排洩物照片。
圖16是本發明實施例對照組肉雞排洩物照片。
圖17是pH5.5~8.5PBS照片。
圖18是本發明實施例肉雞飲用水照片。
圖19是本發明實施例肉雞專用詞料PBS溶解物照片。
具體實施方式
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1. 進雛前準備徹底清掃雞舍，進行常規消毒，入雛前3天進行燻蒸消毒 24小時(高錳酸鉀福馬林=1: 2)，燻蒸時舍溫控制在15度以上。
2. 雞舍管理採用網上平養，統一飼餵肉雞專用飼料(不含任何微生態制
劑)，飼養期間按常規程序進行免疫、消毒。 3. 飼餵至20日齡，將肉雞隨機分為對照組和詞餵螢光標記益生菌組。
4. 將益生菌FQ15按0.2~20%接種量接種於初始pH5.5-8.5的液體MRS培 養基中，於30 45。C振蕩培養至對數生長期後，在每隻EP管中加入0.5~2.5ml 培養液，使用高速冷凍離心機2 10。C、 5000~15000rpm離心2 20min，去掉上 清液，使用pH5.5 8.5PBS洗滌3次後，重新懸浮，使濃度達到106.9CFU / ml。 然後與溶解於0.01 0.5mol/LNa2CO3和0.05~0.25mol/LNacl緩衝液中的螢光標 記物FITC混合，FQ15菌液與FITC溶液比為5~20: 1， 4。C標記0.5~3h後用 pH5.5-8.5PBS洗滌3次，重新懸浮，使濃度達到IO"CFU / ml，(濃度檢測參 考GB/T 4789.2-2003)。
5. 對飼餵螢光標記益生菌組的每隻雞飼餵0.2-2ml螢光標記的益生菌菌液；
6. 分別採集飼餵螢光標記益生菌2小時、18小時、74小時、110小時、 158小時、230小時、326小時排洩物，用5mlpH5.5-8.5PBS溶解後，取少許於 載玻片上，塗布均勻，固定。倒置螢光顯微鏡配置激發光主波長為334nm的 UV激發濾色鏡，使用20-80倍物鏡進行觀察，照片分別為圖9、 10、 11、 12、 13、 14、 15。圖16是對照組肉雞的排洩物照片。
7. 隨機抽取飼餵採集飼餵螢光標記益生菌3小時、18小時、30小時、110 小時、134小時、254小時、326小時以及對照組的肉雞，放血致死，進行雞活 體解剖。使用解剖剪將腹腔剪開，分別取每隻雞的十二指腸放置於滅菌的乾淨 平皿中。將各部位剪開(腸道各段只取中間部位一段)，使用pH5.5~8.5PBS衝 洗除去內容物，再放入另一個滅菌的乾淨平皿中，然後再用pH5.5~8.5PBS反 復洗滌3次。用乾淨的載玻片邊緣輕輕刮取各部位上皮細胞，懸浮於0.2~2.0ml pH5.5 8.5PBS中，分別取少許於載玻片上，塗布均勻，固定，於倒置螢光顯微 鏡下觀察，照片分別為圖1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8。
8. 分別取l~5ml pH5.5-8.5PBS、肉雞的飲用水、肉雞專用伺料PBS溶解 物(lg飼料溶解於10mlpH5.5 8.5PBS中)於載波片上塗布均勻，固定，於倒 置螢光顯微鏡下觀察，照片分別為圖17、 18、 19，作為對照。
實施例中的具體數值可在所列範圍內選取，螢光標記物(FITC、 DTAF、 RBITC、 HRP、 Biotin、 Co-Au)益生菌(AS 1. 131，來源於中國微生物菌種保 藏中心)，除可螢光標記益生菌AS 1. 131夕卜，還可螢光標記其他益生菌或各種 病菌等。
通過觀察排洩物中吸附有螢光標記益生菌的細胞脫落情況以及與1 5mlpH5.5-8.5PBS、肉雞的飲用水、肉雞專用飼料PBS溶解物照片對比，發現益生 菌在進入體內後可迅速吸附於細胞周圍，在飼餵0.5 2h後就可在雞的糞便中看 到帶有螢光的細胞，而且在體內停留的周期可達到60~150小時。同時從螢光 標記的益生菌與消化道各段上皮細胞的吸附情況可以得出結論，功能性益生菌 能夠在肉雞體內定植並生長，定植的部位為十二指腸，體內生長周期為60 150 小時。
權利要求
1.一種螢光標記益生菌菌液，其特徵在於由下述方法製成a.將益生菌按0.2～20％接種量接種於初始pH5.5～8.5的液體MRS培養基中，於30～45℃振蕩培養至對數生長期；b.使用高速冷凍離心機2～10℃、5000～15000rpm離心2～20min，去掉上清液，用pH5.5～8.5PBS洗滌3次後，重新懸浮，使濃度達到106-9CFU/ml；c.將b步驟所得菌液與溶解於0.01～0.5mol/lNa2CO3和0.05～0.25mol/lNacl緩衝液中螢光標記物溶液混合，螢光標記物的濃度是0.5～5mg/ml，菌液與螢光標記物溶液體積比為5～20∶1，4℃標記0.5～3h後用pH5.5～8.5PBS洗滌3次，重新懸浮，使濃度達到106-9CFU/ml。
2. 應用權利要求1所述的螢光標記益生菌菌液分析益生菌在腸道內吸附、 定植狀況的方法，其特徵在於步驟如下a. 每隻雞飼餵0.2~21111螢光標記益生菌菌液，為飼餵螢光標記益生菌組；b. 飼餵後0.5~2h開始採集雞糞，用5mlpH5.5-8.5PBS溶解後，取少許於載 玻片上，塗布均勻；倒置螢光顯微鏡配置激發光主波長為334nm的UV激發濾 色鏡，使用20-80倍物鏡進行觀察；c. 飼餵0.5 3h後，隨機抽取對照組及飼餵螢光標記益生菌菌液的肉雞各 一隻，放血致死，分別取每隻雞的腺胃、肌胃、十二指腸、空迴腸、盲腸或大 腸，使用pH5.5 8.5 PBS衝洗，除去內容物後再放入滅菌的平皿中，然後再用 pH5.5-8.5 PBS反覆洗滌3次，刮取各部位上皮細胞，懸浮於0.2 2.0ml pH5.5-8.5PBS中，分別取少許於載玻片上，塗布均勻，於倒置螢光顯微鏡下觀 察；d. 分別取l~5ml pH5.5~8.5PBS、肉雞飲用水、肉雞專用飼料PBS溶解物 於載波片上塗布均勻，於倒置螢光顯微鏡下觀察。
全文摘要
本發明公開一種螢光標記益生菌菌液，是將益生菌按0.2～20％接種量接種於初始pH5.5～8.5的液體MRS培養基中，於30～45℃振蕩培養至對數生長期；使用高速冷凍離心機2～10℃、5000～15000rpm離心2～20min，去掉上清液，用pH5.5～8.5PBS洗滌3次後，重新懸浮，使濃度達到106-9CFU/ml；將b步驟所得菌液與溶解於0.01～0.5mol/lNa2CO3和0.05～0.25mol/lNacl緩衝液中的螢光標記物溶液混合，螢光標記物的濃度是0.5～5mg/ml，菌液與螢光標記物溶液體積比為5～20∶1，4℃標記0.5～3h後用pH5.5～8.5PBS洗滌3次，重新懸浮，使濃度達到106-9CFU/ml。利用螢光標記物標記益生菌，通過跟蹤監測螢光標記益生菌在肉雞消化道各段的情況，以準確地確定益生菌在動物消化道各段的吸附、定植狀況。
文檔編號G01N21/64GK101178359SQ20071001294
公開日2008年5月14日 申請日期2007年9月25日 優先權日2007年9月25日
發明者江國託 申請人:大連三儀動物藥品有限公司