柯薩奇病毒a16型病毒樣顆粒疫苗的製作方法
2023-05-21 02:41:41 1
專利名稱：柯薩奇病毒a16型病毒樣顆粒疫苗的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術和生物醫藥領域；更具體地，本發明涉及柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒疫苗。
背景技術：
手足口病是兒童的常見疫病，目前仍無有效的疫苗和治療藥物。柯薩奇病毒 A16(CVA16)和人腸道病毒71(EV71)是手足口病的兩個最主要病原，屬於小核糖核酸病毒科腸道病毒屬，單鏈正義RNA病毒，基因組約7400bp (Xu, J.，Y. Qian, S. Wang，J. Μ. Serrano, W. Li, Ζ. Huang, and S. Lu. 2010. EV71 :anemerging infectious disease vaccine target in the Far East Vaccine28 :3516-21 禾口 Zhang, Y. , D.Wang, D. Yan, S. Zhu, J. Liu, H. Wang, S. Zhao, D. Yu, L. Nan, J. An, L. Chen, H. An, A. Xu, and W. Xu. 2010. Molecular evidence of persistentepidemic and evolution of subgenotype Bl coxsackievirus A16_associated hand, foot, and mouth disease in China. J Clin Microbiol 48 619-22)。腸道病毒屬基因組編碼單股長鏈多肽，由結構蛋白Pl和非結構蛋白P2、P3組成。病毒蛋白酶將Pl切割為VP0、VPl和VP3，三者組裝形成病毒衣殼(Ranganathan， S. , S. Singh, C. L. Poh, and V. Τ. Chow. 2002. The hand, foot and mouth disease virus capsid :sequence analysis and prediction of antigenic sites from homology modelling. ApplBioinformatics 1 :43-52)。其中的一些腸道病毒，如脊髓灰質炎病毒，VPO 蛋白被進一步切割為 VP2 和 VP4 (Kitamura, N.，B. L. Semler, P. G. Rothberg, G. R. Larsen, C. J. Adler, A. J. Dorner, E. A. Emini, R. Hanecak, J. J. Lee, S. van derfferf, C. W. Anderson, and Ε. ffimmer. 1981. Primary structure, gene organizationand polypeptide expression of poliovirus RNA. Nature 291 :547-53)。過去的幾年，手足口病在遠東地區的很多國家和地區流行，包括中國、香港、日本、 新加坡和臺灣。在今年的一月一日到九月三十日期間，中國報導了 1，567，2M例手足口病，其中8 例死亡。EV71被發現與手足口病重症和死亡病例相關聯，因此已有的和正在進行的病毒學調查和手足口病疫苗的研發主要集中在EV71。但最近的臨床病例研究表明， 中國最近爆發的手足口病與 CVA16 和 EV71 有關(Zhang, Y.，X. J. Tan, H. Y. Wang，D. Μ. Yan, S. L. Zhu, D. Y. Wang, F. Ji, Χ. J. Wang, Y. J. Gao, L. Chen, H. Q. An, D. X. Li, S. W. Wang, A. Q. Xu, Z. J. Wang, and W. B. Xu. 2009. An outbreak of hand,foot, and mouth diseaseassociated with subgenotype C4 of human enterovirus 71 in Shandong, China. JClin Virol 44 262-7 禾口 Zhang, Y. , D. Wang, D. Yan, S. Zhu, J. Liu, H. Wang, S. Zhao, D. Yu, L. Nan, J. An, L. Chen, H. An, A. Xu, and W. Xu. 2010. Molecularevidence of persistent epidemic and evolution of subgenotype Bl coxsackievirusA16-associated hand, foot, and mouth disease in China. J Clin Microbiol48 :619-22)，患者有可能共感染 EV71 和 CVA16，並在體內同時存在這兩種病毒，因而導致CVA16和EV71發生重組，導致EV71新亞型D的出現。 CVA16單獨感染也可能引起了兒童的死亡。這些研究表明，開發兼抗CVA16和EV71的多價廣譜疫苗，才能有效預防和控制手足口病。很多病毒的病毒結構蛋白重組表達後可以自發組裝成病毒樣顆粒 (virus-likeparticle, VLP)，其結構和抗原性與真病毒沒有區別，但缺少病毒核酸，是沒有感染性的。病毒樣顆粒已經成為開發安全有效的病毒性疾病疫苗的一個有效策略，例如，基於病毒樣顆粒的B型肝炎和人類皰疹病毒疫苗已經獲得審批。針對EV71的病毒樣顆粒已在昆蟲細胞中表達，它能產生中和活性的抗體，從而保護致死劑量病毒攻擊的小鼠。然而，目前本領域還沒有一種有效的針對柯薩奇病毒的理想疫苗。
發明內容
本發明的目的在於提供一種柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒疫苗。在本發明的第一方面，提供一種表達載體，其包括至少一個表達盒1 (如1、2或3個)，所述的表達盒1含有柯薩奇病毒A16型病毒 (CVA16)的Pl蛋白的編碼序列；和至少一個表達盒2(如1、2或3個)，所述的表達盒2含有柯薩奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的編碼序列。在另一優選例中，所述的表達載體是PFastBacTM Dual (pFBD)載體。在本發明的另一方面，提供一種重組杆狀病毒，所述杆狀病毒的基因組中包括至少一個表達盒(如1、2或3個)，所述的表達盒1含有柯薩奇病毒A16型病毒 (CVA16)的Pl蛋白的編碼序列；和至少一個表達盒(如1、2或3個)，所述的表達盒2含有柯薩奇病毒A16型病毒的 3⑶蛋白的編碼序列。在另一優選例中，所述的重組杆狀病毒用於感染昆蟲細胞而獲得重組蛋白。在另一優選例中，所述杆狀病毒通過以下步驟製備(A)將柯薩奇病毒A16型病毒(CVA16)的Pl蛋白的編碼序列和柯薩奇病毒A16型病毒的3⑶蛋白的編碼序列克隆入杆粒中，獲得重組的杆粒；(B)將(A)獲得的重組的杆粒轉染昆蟲細胞，培養轉染後的昆蟲細胞；和(C)收穫重組的杆狀病毒。在另一優選例中，所述的杆粒是Bac-mid杆粒。更優選的，所述的Bacmid來源於大腸桿菌DHlOBac。在另一優選例中，所述的昆蟲細胞是sf9昆蟲細胞。在本發明的另一方面，提供所述的表達載體或的所述的重組杆狀病毒的用途，用於製備病毒樣顆粒。在本發明的另一方面，提供一種產生病毒樣顆粒的系統，包括(1)所述的重組杆狀病毒；和(2)昆蟲細胞。在另一優選例中，所述的昆蟲細胞是sf9昆蟲細胞。在本發明的另一方面，提供一種製備病毒樣顆粒的方法，包括(a)將所述的重組杆狀病毒感染昆蟲細胞；(b)從昆蟲細胞的裂解物中分離獲得病毒樣顆粒。
在另一優選例中，通過蔗糖密度梯度離心分離病毒樣顆粒。在本發明的另一方面，提供一種具有免疫原性的病毒樣顆粒，其由所述的方法產生，其平均直徑為20-30nm。在本發明的另一方面，提供所述的病毒樣顆粒的用途，用於製備預防柯薩奇病毒 A16型病毒感染相關疾病的組合物。在另一優選例中，所述的疾病是手足口病(Hand，foot and mouth disease, HFffl))。在本發明的另一方面，提供一種具有免疫原性的組合物，所述的組合物包含(a)所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒；和(b)藥學上可接受的載體。在本發明的另一方面，提供一種製備預防柯薩奇病毒A16型病毒感染相關疾病的方法，所述方法包括給予需要預防的對象有效量的所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒，或所述的具有免疫原性的組合物。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
圖1、各杆狀病毒表達載體Tn7內片段結構示意圖。圖2、用杆狀病毒系統表達CVPl和CV3⑶。Sf9昆蟲細胞用重組杆狀病毒感染，2 天后收集細胞用抗VPO抗體進行(A)免疫螢光；(B)ELISA ；(C)Western blot 分析。圖3、VLP的蔗糖密度梯度離心分析。細胞裂解物被鋪在10-50%的蔗糖梯度上進行超速離心後，從上到下收集10個組分進行分析。(A)用抗VPO抗體進行ELISA分析；(B)用抗 VPO 抗體進行 Wfestern blot 分析；(C)用抗 VP3 抗體進行 Wfestern blot 分析；(D)用抗 VPl 抗體進行 Wfestern blot 分析。圖4、CVA16病毒樣顆粒的電鏡分析。圖5、免疫小鼠血清中CVA16衣殼亞單位蛋白特異性IgG抗體反應。血清稀釋度為 1 100。Y軸數值為450nm的吸光度。圖6、免疫小鼠血清對CVA16活病毒的中和效價。Sf9免疫血清在檢測最小稀釋度 1 32時沒有中和作用，因此被賦予一個虛擬中和效價1 16進行計算。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現採用杆狀病毒感染昆蟲細胞來表達 CVA16的Pl蛋白和CVA16的3⑶蛋白，可獲得具有比較好的空間構型且經適當切割的蛋白， 所述蛋白可自動組裝為病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒具有高的免疫原性。在此基礎上完成了本發明。杆狀病毒本發明提供了一種重組的杆狀病毒，其可用於感染昆蟲細胞而獲得經適當切割的蛋白。所述的杆狀病毒的基因組中含有至少一個含有柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的編碼序列的表達盒1 ；和至少一個含有柯薩奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的編碼序列的表達盒2。所述的重組的杆狀病毒可以穩定傳代，零下70°C可以長期保存並具有高的滴度。 利用該病毒感染昆蟲細胞後1-2天後可以得到重組蛋白，且表達穩定。作為本發明的優選方式，所述杆狀病毒通過以下步驟製備(A)將柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的編碼序列和的柯薩奇病毒A16型病毒的 3⑶蛋白的編碼序列克隆入杆粒中，獲得重組的杆粒；(B)將㈧獲得的重組的杆粒轉染昆蟲細胞，培養轉染後的昆蟲細胞；和(C)收穫重組的杆狀病毒。作為本發明的優選方式，所述的杆粒是Bac-mid杆粒。更優選的，所述的Bac-mid 來源於大腸桿菌DHlOBac。作為本發明的優選方式，所述的昆蟲細胞選自sf9昆蟲細胞，HighFive昆蟲細胞； 最優選的，所述昆蟲細胞是sf9昆蟲細胞。作為本發明的優選方式，將柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的編碼序列和的柯薩奇病毒A16型病毒的3⑶蛋白的編碼序列及其兩端重組序列，在轉座酶的作用下重組入 Bacmid杆粒的Tn7位點。更優選的，所述的轉座酶由大腸桿菌DHlOBac中攜帶的輔助質粒 (helper)所表達。作為本發明的優選方式，在步驟(A)中，所述重組的杆粒通過以下步驟獲得(a)將柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的編碼序列和的柯薩奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的編碼序列插入穿梭載體(優選pFASTBac-Dual載體)的多克隆位點中，獲得插入了外源編碼序列的重組載體；(b)將(a)獲得的重組載體轉入宿主細胞DHlOBac，獲得轉化的宿主細胞，所述轉化的宿主細胞中含有重組杆粒，所述的重組杆粒攜帶所述的外源編碼序列；和(c)從所述轉化的宿主細胞中提取重組杆粒。作為本發明的優選方式，所述的柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白具有SEQID NO 1所示的胺基酸序列。所述的柯薩奇病毒A16型病毒的CD3蛋白具有SEQ ID NO :2所示的
胺基酸序列。作為本發明的優選方式，所述的外源蛋白(柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白或柯薩奇病毒A16型病毒的CD3蛋白)的編碼序列的兩端還含有多克隆位點的編碼序列。作為本發明的優選方式，所述的杆狀病毒是通過將外源基因柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的編碼基因和柯薩奇病毒A16型病毒的CD3蛋白的編碼基因克隆進入 PFASTBac的多克隆位點內，然後將pFASTBAC轉化DHlOBac基因工程菌，在轉座酶的作用下發生重組，獲得杆粒後轉染昆蟲細胞獲得的。將這種病毒感染昆蟲細胞後數小時，病毒即可進入昆蟲細胞，開始複製病毒，並且轉錄病毒重組區域中蛋白翻譯區的外源核酸序列，在該段序列中含有所述外源的核酸序列。感染約1-2天後表達具有病毒重組區域中蛋白翻譯區所對應的胺基酸序列的蛋白。此外，在所述的杆狀病毒感染昆蟲細胞並表達外源蛋白後，還可以通過例如密度梯度離心等方法從培養物中回收重組杆狀病毒，用於下次感染。具有免疫原性的病毒樣顆粒本發明人提供了一種製備病毒樣顆粒的方法，該方法包括步驟(1)將所述的杆狀病毒感染昆蟲細胞，培養感染後的昆蟲細胞，使之表達所述的外源蛋白(2)從昆蟲細胞的裂解物中分離獲得病毒樣顆粒。作為本發明的優選方式，所述的昆蟲細胞選自sf9昆蟲細胞，HighFive昆蟲細胞；最優選的，所述昆蟲細胞是sf9昆蟲細胞。本發明還提供一種具有免疫原性的病毒樣顆粒，其基本上由上述方法製備獲得。機體免疫系統的MHC I型和MHC II型對以顆粒狀形式存在的外源性抗原的提呈較對可溶性單體抗原的提呈要強1000或10000倍，即以顆粒狀形式存在的抗原比可溶性單體抗原具有更強的免疫原性，機體免疫系統的MHC I型和MHC II途徑對以顆粒狀形式存在的外源性抗原的提呈較對可溶性單體抗原的提呈要強1000或10000倍，即以顆粒狀形式存在的抗原比可溶性單體抗原具有更強的免疫原性。本發明獲得的病毒樣顆粒的平均直徑 (粒徑)為 20-30nm。本發明還提供所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒的用途，用於製備預防人柯薩奇病毒A16型病毒感染相關疾病的組合物。所述的疾病例如是手足口病。組合物本發明還提供一種具有免疫原性的組合物(預防性或治療性疫苗)，所述的組合物包含有效量的本發明所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒，和藥學上可接受的載體。如本文所用，「藥學上可接受的」的成分是適用於人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如毒性)的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語「藥學上可接受的載體」指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身並不是必要的活性成分，且施用後沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在 Remington』 s PharmaceuticalSciences (Mack Pub. Co.，N. J. 1991)中可找至Ij 關於藥學上可接受的載體的充分說明。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、 鹽水、甘油和山梨醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如潤滑劑、助流劑、潤溼劑或乳化劑、PH緩衝物質和穩定劑，如白蛋白等。可將所述的組合物製成各種適合於哺乳動物給藥的劑型，所述劑型包括但不限於注射劑、膠囊劑、片劑、乳劑、栓劑；較佳地為注射劑。動物實驗表明，利用本發明的具有免疫原性的病毒樣顆粒製成的疫苗免疫動物後，可在動物體內產生高效價的抗體。在使用時，是將安全有效量的本發明所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒施用於哺乳動物(如人)，其中該安全有效量通常至少約1微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約1微克/千克體重-約1毫克/千克體重。 當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
本發明的主要優點在於本發明首次製備了 CVA16的重組病毒樣顆粒(CVA16-LP)，免疫小鼠後獲得了高中和活性的抗體，表明CVA16-LP是預防柯薩奇病毒的理想疫苗。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。材料細胞和病毒RD (人橫紋肌肉瘤細胞，購自ATCC)細胞含10 % FBS、100unit/mL青黴素和 100ug/mL鏈黴素的DMEM培養基37°C，5% CO2培養。病毒CVA16 shzh05-l(基因組序列參見GenBank登錄號EU262658)(參見Wu， Ζ. , Y. Gao, L. Sun, P. Tien, and Q. Jin. 2008. Quick identification of effectivesmall interfering RNAs that inhibit the replication of coxsackievirus A16. AntiviralRes 80 :295-301. Yang, F. ， Q. Jin, Y. He, L. Li, and Y. Hou. 2001. The completegenome of Enterovirus 71 China strain. Sci China C Life Sci 44 :178-83) 在RD細胞中增殖；微量滴定法測定CVA16病毒滴度，根據Reed-Muench方法測定半數組織 ^ (TCID50) (Reed, L. J. Μ. ， H. 1938. A simple method ofestimating 50 percent endpoints. Am J Hyg 27 :493-499)。採用SF90 Oil SFM 培養基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)於 27°C培養昆蟲細胞 Sf9。抗體抗EV71的鼠單克隆抗體MAB979(與CVA16有交叉反應)購於 Millipore (Billerica, MA, USA)；豚鼠的抗VP0、VPl或VP3的抗血清通過用大腸桿菌表達 (常規方法表達)的重組VP0、VPl或VP3免疫(常規免疫方法)豚鼠三次製備得到。製備重組杆狀病毒CVA16 shzh05-l 感染 RD 細胞，Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)法提取病毒 RNA，oligo(dT)為引物，M-MLV(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)反轉錄酶進行反轉錄， 以獲得的第一鏈cDNA為模板擴增編碼CVA16的Pl蛋白和3CD蛋白的基因片段，分別命名為 CV Pl和 CV 3CD。採用5，-CACTCTAGAATGGGGTCACAAGTCTCC-3，(SEQID NO 3)為上遊引物，5，-CCA AAGCTTTTACAATCTTGTTATCTTGTC-3，(SEQ ID NO 4)為下遊引物，擴增 CV Pl ；Xba I 和 Hind III雙酶切後，亞克隆到同樣酶切處理的pFBD(piiastBacTM Dual的縮寫(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA))，構建 pFBD-CVPl。以 5，-TCACCATGGGACCGAGCTTAGACTT-3，(SEQ ID NO :5)為上遊引物，5，-CACATGCATCTAAAATAATTCGAGCCA-3，(SEQ ID NO :6)為下遊引物，擴增 CV 3CD ；Nco I 禾Π Nsi I 雙酶切後，亞克隆到同樣酶切處理的PFBD，構建pFBD-CV3⑶。Xba I和Hind III雙酶切pFBD-CVPl獲得CVP1，亞克隆到同樣酶切的pFBD_CV3CD， 構建 PFBD-CVP1/CV3CD。上述三個質粒通過Bac-t0-Bac 系統 Qnvitrogen, Carlsbad, CA, USA)製備相應的杆狀病毒，分別命名為Bac-CVPl、Bac-CV3CD和Bac_CVPl/3CD。按照hvitrogen說明書將重組質粒轉化DHlOBac E. coli，鑑定重組質粒Bac-mid，Bac-mid轉染Sf9細胞，篩選擴增重組杆狀病毒。按^witrogen說明書指定的MOI用重組杆狀病毒感染Sf9細胞，表達目的蛋白。感染後48h收集感染的細胞和上清，準備做生化分析和電鏡試驗。免疫螢光試驗重組病毒感染Sf9細胞4 後，PBS洗細胞兩次，4% (w/v)多聚甲醛室溫固定細胞20min，PBS洗三次，(v/v)NP40作用室溫lOmin，PBS洗三次，10% (ν/ν)正常羊血清 (NGS) 37 °C 作用 30min，PBS 洗三次，豚鼠抗 CVVPO (1 100) 37°C 作用 30min，PBS 洗三次， FITC標記的羊抗豚鼠(1 500) 37°C作用30min，PBS洗三次，DAPI室溫染核5min，PBS洗五次，50% (ν/ν)甘油封片，螢光顯微鏡觀察。ELISA 禾口 Western blot收集杆狀病毒感染的細胞，預冷的PBS緩衝液重懸細胞，FastprepFP120(Biol01, Vista, CA, USA)破碎細胞，12000rpm 4°C離心15min，收集上清。以牛血清白蛋白為標準蛋白，Bradford蛋白分析試劑盒(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)測定上清中可溶性總蛋白的濃度。直接ELSA檢測，PBS為包被液，細胞裂解物離心後上清50uL/孔，37°C包被96孔 ELISA板 2h，PBST (含 0.05% (ν/ν)吐溫-20 的 1XPBS)漂洗 3 次，5% (w/v)脫脂奶粉 37°C 封閉lh，PBST漂洗3次，一抗為1 2000豚鼠抗CVVPO (大腸桿菌表達的重組CVA16 VPO 免疫豚鼠三次後的抗血清)37°C作用》!，PBST漂洗3次，二抗為1 5000 HRP標記的羊抗豚鼠IgG(sigma)37°C作用lh，PBST漂洗5次，四甲基聯苯胺(TMB)-過氧化氫系統為底物顯色，IM H3PO4中止，酶標儀450nm檢測，同時設陰性對照和空白對照。Western bloting檢測，製備樣品先進行12%凝膠SDS-PAGE電泳，然後轉印PVDF 膜，5% (w/v)脫脂奶粉室溫封閉2h，PBST (0. 05% (ν/ν)的吐溫20)漂洗3次，1 1000 稀釋的一抗(豚鼠的抗VP0、VP1或VP3的抗血清，通過用大腸桿菌表達的重組VP0、VPl或 VP3免疫豚鼠三次製備得到)室溫孵育2h，PBST漂洗3次，HRP標記的相應二抗(羊抗豚鼠IgG)室溫孵育lh，PBST漂洗5次，加適當量的BeyoECL發光試劑LAS-4000冷光分析儀 (Fujifilm Life Science)顯影。蔗糖密度梯度及部分純化VLP感染細胞裂解物12000rpm 4°C離心15min，收集上清加到10%-50%的蔗糖梯度上層，Beckman離心機39000rpm 4°C離心3h，收集10個蔗糖梯度(0. 4mL/梯度)，做ELISA 和Wfestern blot檢測分析。依據ELISA和^festern blot結果，收集CV VPO富集的梯度，Centrifugal Filter Units (Millipore, UFC800396, USA)濃縮蛋白樣品，據已建立的 Western blot方法定量收集的病毒樣顆粒，準備免疫動物。電鏡分析
0. 5% (w/v)水溶性乙酸雙氧鈾負染上述部分純化的病毒樣顆粒，飛利浦CM-12S 掃描電鏡分析。小鼠免疫程序和抗體效價檢測將抗原蛋白和鋁佐劑(Pierce，Rockford, IL)按照鋁佐劑自帶操作說明書進行混合，腹腔免疫6隻雌性Balb/c小鼠(6-8周齡)，Iug/只病毒樣顆粒(據VPO定量)，同樣處理空白細胞Sf9，設立陰性對照組。第3和6周分別進行第二和三次免疫，每次免疫前採血，第八周小鼠眼球採血，收集血清，_80°C分裝保存。原核表達的CVA16的VP0、VP1和VP3各IOOng/孔包板，按照已建立的ELISA方法 (6)測定血清中特異的IgG，以大於相應陰性孔(免疫前血清)0. 1個OD值的檢測孔為陰陽性判定，其血清稀釋倍數的倒數即為血清ELISA效價。中和試驗通過在RD細胞上進行TCID5tl減數試驗分析血清的中和滴度，簡述如下RD細胞接種96孔板，1 X IO4/孔細胞，過夜培養到細胞達70%匯合度時，進行中和試驗。2% (v/v)FBS 的DMEM梯度稀釋血清樣品，CVA16病毒稀釋到2TCID5(1/uL，50uL稀釋的血清樣品和50uL稀釋的CVA16病毒(IOOTCID5ci)混合37°C孵育lh，血清病毒混合物加到長有RD細胞的孔內 37°C培養3d，能減少50%細胞病變(CPE)的血清稀釋度為該血清的中和滴度。
實施例實施例1、杆狀病毒的構建CVA16/shzh05的編碼Pl和3⑶的基因片段通過反轉錄第一鏈cDNA後由PCR擴增合成，然後克隆到PFBD載體，分別命名為pFBD-CVP 1和pFBD_CV3CD。CVP1基因通過 pFBD-CVPl中的polyhedrin啟動子調控，CV3CD基因則由pFBD_CV3CD內的plO啟動子直接調控。同時裝載了兩個基因的PFBD-CVP1/3⑶(圖1)也成功構建，其可以在同種細胞裡共同有效表達兩種蛋白。上述三種結構再隨後構建到相應的杆狀病毒，分別命名為Bac-CVPl，Bac_3⑶， Bac-CVP1/3CDο實施例2、在昆蟲細胞內表達CVA16VLPs用Bac-CVPl，Bac_3CD，Bac_CVPl/3CD 分別感染 Sf9 昆蟲細胞。首先用抗-CVA16VP0 的多抗通過免疫螢光方法來檢測感染昆蟲細胞中目的蛋白表達。結果如圖2A所示， Bac-CVPl和Bac-CVPl/3⑶有明亮綠色螢光；空白組和Bac_3⑶感染組並未檢測到螢光信號。Bac-CVPl在昆蟲細胞的表達同時通過ELISA實驗也得到證實抗CVA16 VPO的抗體檢測到Bac-CVPl和Bac-CVPl/3⑶的細胞裂解的表達，而空白組和Bac_3⑶感染組並未檢測到信號(圖2B)。其次，抗VPO抗體Wfestern blot分析了 Pl被3CD的剪切過程。如圖2C所示，空白組和Bac-3⑶感染組未檢測到條帶，而Bac-CVPl的裂解物有一分子量約為60KDa的條帶， Bac-CVPl/3CD有兩條分別為39KDa和^KDa的條帶，這些條帶與預期的VPO和VP2被正確切割所產生的目的條帶大小一致。同樣的條帶形式與在野生型CVA16上已發現的一致。總之，這些結果證明，在Bac-CVPl/3⑶感染的細胞中Pl蛋白可以有效產生並被正確切割。Bac-CVPl/3⑶用於下一步的研究。
ELISA*WfeStern blot分析Bac-CVPl/3CD感染細胞後病毒樣顆粒的構成，蔗糖密度梯度離心分離細胞裂解物，ELISA檢測不同蔗糖梯度CVA16的特異蛋白。抗CVVPO多克隆抗體檢測到目的蛋白主要存在梯度6#(圖3A)，證明病毒樣顆粒的存在。分別利用CVA16 的三個多克隆抗體抗CVVP0、抗CVVPl和抗CVVP3 Western bloting進一步分析不同的蔗糖梯度發現組分#6均出現針對這三個抗體的強烈信號，與ELISA結果相一致(圖3B、3C和 3D)。更重要的是目的條帶的分子量和已報導的野生毒株亞結構蛋白分子量一致，即VPO大小為39KDa，VP2為^KDa，VPl為33KDa，VP3為^KDa。結果表明，病毒樣顆粒是由正確切割修飾的衣殼亞結構蛋白形成。為直接確定病毒樣顆粒的形成，梯度6#樣品負染後，電鏡觀察分析，結果觀察到直徑約25nm的病毒樣顆粒(圖4)。實施例3、CVA16病毒樣顆粒在小鼠中的免疫原性動物實驗評價CVA16病毒樣顆粒的免疫原性，於第0、3和6周用粗提純的病毒樣顆粒腹腔注射Iug/只小鼠，鋁佐劑為佐劑，同樣處理的未感染的Sf9細胞作為對照。最後一次免疫後兩周收集小鼠血清，用重組抗原包被ELISA檢測特異的抗體，結果表明VLP免疫組血清可以和重組的亞單位外殼蛋白反應，而對照Sf9血清不反應(圖5)。實施例4、VLP免疫血清的中和活性中和試驗評估VLP免疫血清的中和活性，兩倍梯度稀釋的血清與100TCID50的 CVA16病毒混合，加入RD細胞，據能引起減少50%細胞病變(CPE)的血清稀釋度判定血清的中和滴度。結果表明，Sf9細胞裂解物免疫小鼠獲得的血清在檢測的最低稀釋度(1 32)沒有中和活性，而病毒樣顆粒免疫小鼠血清的中和效價高達1 4096(圖6)。這一結果表明， 重組的CVA16病毒樣顆粒能引起機體產生較高中和活性的抗體，因而可以作為防治CVA16 的疫苗。討論世界範圍內，柯薩奇病毒(CVA16)和腸道病毒71(EV71)病毒是手足口病的最主要病原。最近的研究發現，CVA16和EV71病毒發生共感染和重組，這可能是過去幾年中國大陸手足口病大規模爆發的主要原因。因此，CVA16和EV71病毒都應該是手足口病疫苗研究的靶點，從而廣泛有效地防治手足口病。本發明首次報導了 CVA16病毒樣顆粒的製備及其誘導高效價中和抗體的能力。利用重組的杆狀病毒在昆蟲細胞共表達Pl和3CD製備CVA16的病毒樣顆粒，生化試驗和電鏡分析發現CVA16病毒樣顆粒為約25nm的球形結構，主要由病毒的衣殼蛋白VP0、VP1、VP3和少量的VP2亞結構蛋白組成。CVA16病毒樣顆粒免疫小鼠後製備的抗血清與衣殼亞單位蛋白有特異的反應，更有意義的是，該血清能在體外有效地中和CVA16活病毒，中和效價高達 1 4096。本發明說明CVA16病毒樣顆粒誘導產生的抗體對CVA16有強有效的保護作用， 因此CVA16病毒樣顆粒可作為預防CVA16引起的手足口病的疫苗。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種表達載體，其包括表達盒1，所述的表達盒1含有柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的編碼序列；和表達盒2，所述的表達盒2含有柯薩奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的編碼序列。
2.一種重組杆狀病毒，所述杆狀病毒的基因組中包括表達盒1，所述的表達盒1含有柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的編碼序列；和表達盒2，所述的表達盒2含有柯薩奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的編碼序列。
3.權利要求1所述的表達載體或的權利要求3所述的重組杆狀病毒的用途，用於製備病毒樣顆粒。
4.一種產生病毒樣顆粒的系統，包括(1)權利要求2所述的重組杆狀病毒；和(2)昆蟲細胞。
5.如權利要求4所述的系統，其特徵在於，所述的昆蟲細胞是sf9昆蟲細胞。
6.一種製備病毒樣顆粒的方法，包括(a)將權利要求2所述的重組杆狀病毒感染昆蟲細胞；(b)從昆蟲細胞的裂解物中分離獲得病毒樣顆粒。
7.一種具有免疫原性的病毒樣顆粒，其由權利要求6所述的方法產生，其平均直徑為 20-30nm。
8.權利要求7所述的病毒樣顆粒的用途，用於製備預防柯薩奇病毒A16型病毒感染相關疾病的組合物。
9.如權利要求8所述的用途，其特徵在於，所述的疾病是手足口病。
10.一種具有免疫原性的組合物，其特徵在於，所述的組合物包含(a)權利要求8所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒；和(b)藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明涉及柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒疫苗。意外地發現採用杆狀病毒感染昆蟲細胞來表達CVA16的P1蛋白和CVA16的3CD蛋白，可獲得具有比較好的空間構型且經適當切割的蛋白，所述蛋白可自動組裝為病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒具有高的免疫原性。
文檔編號A61K39/125GK102465144SQ201010553419
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月19日 優先權日2010年11月19日
發明者劉慶偉, 蔡一村, 黃忠 申請人:中國科學院上海巴斯德研究所