一種能夠去除熱原及病毒的尿激酶的製備方法

2023-11-04 09:07:37 1

專利名稱：一種能夠去除熱原及病毒的尿激酶的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地說涉及一種製備尿激酶精品的方法。
背景技術：
尿激酶是人血液中的尿激酶原在部分降解後從尿液中排出的一種絲氨酸蛋白酶， 為血纖蛋白溶酶原激活劑，可將纖溶酶原轉化為纖溶酶，臨床上主要用於治療急性心肌梗塞、急性腦血栓形成、腦血管栓塞、血栓性閉塞性疾病、肺栓塞以及視網膜中央靜脈血栓形成等疾病。
《中國藥典》2005版和2010版，明確規定「本品在生產過程中需經60°C加熱10小時，以使病毒滅活」；且質量標準要求尿激酶的細菌內毒素小於1. OEU/萬單位。
目前，國內不少專家針對尿激酶的製備工藝進行了深入的試驗研究，如一種特異性純化高分子尿激酶層析介質及製備方法和應用(楊華英等專利號CN101693748A)、一種尿激酶製備方法(張志武等專利號CN101701215A)等，都結合使用離子交換層析法、凝膠分子篩法、免疫親和層析、對氨基苯甲脒-Sepharose親和層析技術，純化精製得到尿激酶。使產品的比活、高分子尿激酶相對含量以及尿激酶生物活性的回收率不斷提高。
但是針對尿激酶產品中病毒及熱原的去除研究，發表的文獻較少。
細菌內毒素屬於熱原的一種，而熱原係指由微生物產生的能引起恆溫動物體溫異常升高的致熱物質。它包括細菌性熱原、內源性高分子熱原、內源性低分子熱原及化學熱原等。這裡所指的「熱原」，主要是指細菌性熱原，是某些細菌的代謝產物、細菌屍體及內毒素。 致熱能力最強的是革蘭氏陰性桿菌的產物，其次是革蘭陽性桿菌類，革蘭陽性球菌則較弱， 黴菌、酵母菌、甚至病毒也能產生熱原。當含有熱原的物質進入人體以後，人體會產生發冷、 寒顫、發熱、出汗、噁心、嘔吐等症狀，有時體溫可升至40°C以上，嚴重者甚至昏迷、虛脫，如不及時搶救，可危及生命。因此去熱原是本品生產工序中不可缺少的一步。發明內容
本發明的目的是提供了一種能夠去除病毒及熱原的尿激酶製備方法。
本發明的技術方案是將尿激酶粗品經DEAE-纖維素層析、CMC層析、親和層析、去熱原後得到尿激酶精品，包括如下步驟
(I)粗品提取取尿激酶粗品，加磷酸鹽緩衝液進行溶解，尿激酶粗品與磷酸緩衝液的比例為lg 10 14ml ;攪拌；過濾，將濾餅再加磷酸緩衝液進行溶解，濾餅與磷酸緩衝液按的比例為Ig 2 5ml ;攪拌，過濾；合併兩次的濾液，調節濾液pH至7. O 8. O;
(2)超濾將粗提液用超濾膜超濾至原體積的1/5至1/20 ;加水至原體積後，繼續超濾至原體積的1/5至1/15 ;加O. 025mol/L PB S平衡液至原體積後，繼續超濾至原體積的 1/2 至 1/5 ；
(3)DEAE-纖維 素層析取經0.025mol/L PB S平衡液平衡的DEAE-纖維素，加入超濾液中，攪拌，過濾；在濾液中加入上一次量1/2的0.025mol/L PB S平衡液平衡的DEAE-纖維素，攪拌，過濾；合併二次濾液；(4) CMC層析調節濾液pH至3. 0 5. 0，調整電導率至15 20 ii S/cH。CMC柱先用0. 05 0. 2mol/L醋酸緩衝液平衡，再將濾液上CMC柱，用0. 05% 0. 2%氨水溶液洗脫，得洗脫液。將洗脫液在60°C水浴滅菌10小時；(5)親和層析將 Tryp sin-1nhibitor-Sepharose 裝柱，用含 lmol/L NaCl的0. 01mol/L PBS平衡液洗滌平衡；將已滅菌的洗脫液進行上柱；用含lmol/L NaCl的
0.OlmoI/LPBS平衡液洗滌I 3個床體積，再用含0. 5mol/L NaCl的0. OlmoI/LPBS平衡液洗滌0.1 I個床體積；最後用0. Olmol/LPBS洗脫液洗脫，收集洗脫液。(6)沉澱、乾燥調節洗脫液pH至6.0 7.0，用こ醇進行沉澱，洗脫液與こ醇的體積比為1: 3 8;再用こ醇洗滌沉澱，重複2 4次；乾燥，得乾燥品。(7)去熱原1:將乾燥品加水，按Ig 60 75ml的比例進行溶解，在攪拌下加入等體積-20 0°C的こ醇，再按溶液總體積Iml : 5 IOg的比例加入醋酸銨，然後緩慢加入0.1 0. 3mol/L磷酸鈉溶液，其用量與乾燥品的比例為1ml 10 14g，攪拌，最後加入0.1 0. 5mol/L醋酸鈣溶液，其用量與乾燥品重量的比例為1ml 10 14g ;調節pH至8. 5，攪拌，離心，取上清液。(8)去熱原I1:上清液調pH至6. 0 7. 0，在攪拌時，加入こ醇進行沉澱，上清液與加入こ醇的體積比為1 4 6，離心。再用こ醇洗滌沉澱物，離心，反覆2 4次；然後沉澱物乾燥，得尿激酶精品。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進ー步說明。實施例 所述的利用尿激酶粗品經DEAE-纖維素層析、CMC層析、親和層析、去熱原後得到尿激酶精品，包括如下步驟1. DEAE-纖維素層析1.1粗品提取取粗品420g，溶解於12倍量lmol/L磷酸緩衝液中，攪拌提取2小時後，過濾得濾液。濾餅再次溶解於4倍量lmol/L磷酸緩衝液中，攪拌，過濾得濾液。合併二次濾液，用5mol/LHCl 調 pH 至 7. 5。1. 2 超濾將已調pH至7. 5的粗提液用Cut-off 10000MW的超濾膜超濾至原體積的1/12吋，加水至原體積，繼續超濾至原體積的1/10，然後加0. 025mol/LPBS平衡液至原體積，繼續超濾至原體積的1/3。1. 3DEAE-纖維素層析1. 3.1取經0. 025mol/LPB S平衡液平衡的DEAE-纖維素，按超濾液30個OD (280nm)加ー克的比例加入超濾液中，攪拌，過濾得濾液。1. 3. 2 用 0. 025mol/LPBS 平衡液洗滌 DEAE-纖維素。1. 3. 3在濾液中加入1. 3.1中一半量的DEAE-纖維素，攪拌，過濾得濾液。1. 3. 4合併二次濾液。
2. CMC 層析2.1將濾液調節pH至4. 2，並加氯化鈉調整濾液使電導在17處。2. 2濾液上經0. lmol/L醋酸緩衝液平衡過夜的CMC柱，流速控制在125ml/min ;用
0.1 %氨水溶液洗脫,得洗脫液。2. 3將洗脫液在60°C水浴滅菌10小吋。3.親和層析3.1 將 Trypsin-1nhibitor-Sepharose 裝柱，用 25 倍床體積的含 lmol/LNaCl 的
0.Olmol/LPBS平衡液洗滌平衡12小吋。3. 2將已滅菌的洗脫液上柱，流速控制在42ml/min。3. 3上柱結束後，用含lmol/LNaCl的0. Olmol/LPBS平衡液洗滌2個床體積，再用含0. 5mol/L NaCl的0. Olmol/LPBS平衡液洗滌I個床體積。3. 4 洗脫用0. Olmol/LPBS洗脫液洗脫，流速控制在40ml/min，收集流出液。3. 5 沉澱 用NaOH溶液調節pH至6. 51，再用こ醇進行沉澱，加入的こ醇與洗脫液的體積比為5 1，攪拌，靜置沉澱12小吋。3. 6 乾燥沉澱結束後，離心，用こ醇洗滌沉澱，重複二次；將沉澱物乾燥，乾燥後得乾燥品
11.5g。4.去熱原4.1將上述乾燥品加入788ml水攪拌溶解；在攪拌下加入等體積こ醇，然後再加入醋酸銨，醋酸銨的用量與溶液總體積的比例為8g 1ml，溶液澄清；4. 2再緩慢加入0. 2mol/L磷酸鈉溶液189ml，攪拌15分鐘後，加入0. 3mol/L醋酸鈣溶液189ml ；4. 3然後，用5mol/L NaOH調節pH至8. 5，攪拌I小時，離心，棄去沉澱物；4. 4最後用5mol/L HCl調節上清液pH至6. 68，在攪拌下，加入9860mlこ醇，沉澱析出，置冰箱靜置12小時；4. 5沉澱結束後，離心，用こ醇洗滌沉澱，反覆2次；4. 6最後,將沉澱物乾燥,得乾燥品29. 6g,即為成品。以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述掲示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬於本發明技術方案的保護範圍。
權利要求
1.一種能夠去除熱原及病毒的尿激酶的製備方法，其特徵在於將尿激酶粗品經 DEAE-纖維素層析、CMC層析、親和層析、去熱原後得到尿激酶精品。
2.根據權利要求1所述的提取尿激酶精品的方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟:(1)粗品提取取尿激酶粗品溶解於磷酸緩衝液中，攪拌，過濾，調節PH；(2)超濾將粗提液超濾；加水，超濾；加PBS平衡液，超濾；(3)DEAE-纖維素層析用PBS平衡液平衡DEAE-纖維素，加入超濾液中，攪拌，過濾；在濾液中加PBS平衡液平衡的DEAE-纖維素，攪拌，過濾；(4)CMC層析調節濾液pH和電導率，再將濾液上CMC柱，用氨水溶液洗脫，得洗脫液， 滅菌；(5)親和層析將樹脂裝柱，用含NaCl的PBS平衡液洗滌平衡，將已滅菌的洗脫液上柱，洗滌；用PBS洗脫液洗脫，收集流出液；(6)沉澱、乾燥調節流出液pH，加入乙醇沉澱，離心，沉澱物用乙醇洗滌，乾燥，得乾燥品O(7)去熱原1:將乾燥品用水溶解，依次加入乙醇、醋酸銨、磷酸鈉溶液、醋酸鈣溶液，攪拌，調節 pH，攪拌，離心，取上清液；I1:調節上清液PH，攪拌，加入乙醇進行沉澱，離心，並用乙醇洗滌沉澱，乾燥，得去除熱原及病毒的尿激酶。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(I)中，將尿激酶粗品用磷酸緩衝液溶解；尿激酶粗品與磷酸緩衝液的比例為lg 10 14ml ;調節pH至7. O 8. O。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(2)中，將粗提液用超濾膜超濾至原體積的1/5至1/20 ;加水至原體積後,再超濾至原體積的1/5至1/15 ;加O. 025mol/L PBS 平衡液至原體積後，繼續超濾至原體積的1/2至1/5。
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(3)中，DEAE-纖維素用0.025mol/L PBS平衡液平衡。
6.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(4)中，調節濾液pH至3.O 5.0， 調整電導率至15 20 μ S/cm ；CMC柱用O. 05 O. 2mol/L醋酸緩衝液平衡；氨水溶液體積濃度為O. 05% O. 2% ;將洗脫液在60°C水浴滅菌10小時。
7.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(5)中，樹脂柱用含lmol/LNaCl的O.01mol/L PBS平衡液平衡；將洗脫液上柱，上柱結束後，先用含lmol/L NaCl的O. Olmol/ LPBS平衡液洗滌柱子，再用含O. 5mol/L NaCl的O. Olmol/LPBS平衡液洗滌；最後用0.Olmol/LPBS洗脫液洗脫，收集洗脫液。
8.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(6)中，調節pH至6.O 7.0，加入乙醇的體積是洗脫液體積的3 8倍。
9.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(7)的I中，用水量與乾燥品的比例為60 70ml Ig ;醇的溫度_20 0°C ;醋酸銨的用量與溶液總體積的比例為5 IOg Iml ;磷酸鈉溶液的濃度0.1 0. 3mol/L，磷酸鈉溶液的用量與乾燥品的比例為 10 14ml Ig ;醋酸鈣溶液的濃度0.1 0. 5mol/L，醋酸鈣溶液的用量與乾燥品的比例為10 14ml Ig ;調節 pH 為 8. 5。
10.根據權利要求2所述的方法，其特徵在幹步驟(7)的II中，上清液調pH至6.0 ,7. O。
全文摘要
本發明公開了一種能夠去除熱原及病毒的尿激酶的製備方法。本發明的技術方法是將尿激酶粗品經DE AE-纖維素層析、CMC層析、親和層析、去熱原後得到尿激酶精品。該技術的優點在於在生產過程中採用60℃水浴滅菌處理使病毒失活以及用磷酸三鈉和醋酸鈣吸附去除產品中的熱原，保證產品的質量。該方法得到的尿激酶無病毒無熱原，且精品的比活能夠達到13萬單位/mg以上。
文檔編號C12N9/72GK103060294SQ20121059801
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者呂金花, 劉翠珍, 葛翠鳳, 朱琳 申請人:青島九龍生物醫藥有限公司