一種用於純化分離含烯鍵活性物質的方法
2023-12-01 16:38:01
專利名稱：一種用於純化分離含烯鍵活性物質的方法
技術領域：
本發明涉及含烯鍵活性物質的純化，具體來說，涉及一種採用銀 化反相高壓液相層析技術從油脂或天然藥物中分離得到高純度含烯 鍵活性物質，特別是不飽和脂肪酸及其衍生物的方法。
背景技術：
含烯鍵活性物質廣泛存在於油脂或天然藥物體內，對人體具有保 健和藥理活性作用。如油脂中的油酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸 等不飽和脂肪酸有明顯降低高密度脂蛋白、血清膽固醇的作用，進而 減少高血壓、心臟病及中風等疾病發病率，同時在維護生物膜的結構 和功能方面有重要作用，該類產品可以廣泛應用於醫藥、營養補充劑、 保健食品等領域。天然藥物含有揮髮油、有機酸、生物鹼、黃酮、皂 甙等各種活性物質，其中很多化合物含有烯鍵，結構十分類似，難以 分離純化，但藥理活性卻有差別甚至毒性差別很大，因此發展針對含 烯鍵化合物的高選擇性的純化技術十分必要。目前主要用於油脂中不飽和脂肪酸的分離純化技術有低溫結晶、 尿素包結技術、超臨界萃取技術、精餾和分子蒸餾技術。這些分離技 術在生產中還存在著一些不足，主要是損失大，收率低，不穩定，分離 困難，純度不高，某些技術成本太高(如分子蒸餾)等。目前用於天 然藥物中含烯鍵活性物質的分離純化技術比較少，常用銀化矽膠層析 技術，該技術是在矽膠表面浸漬硝酸銀後在常壓或中壓下對樣品進行 分離。然而，這種技術有很多缺點硝酸銀在矽膠柱上的浸漬不均勻而影響分離效率；在中常壓下柱分離效率不高；銀化矽膠柱對光敏感， 只可現用現製備，手工製備過程複雜繁瑣，重現性差；分離消耗時間 長；分離消耗有機溶劑量大。本發明將銀離子添加到洗脫劑中，採用普通反相液相層析柱，在 高壓下對樣品進行分離純化，具有純化能力強、分離效率高、速度快、 有機溶劑消耗量小、重現性好等優點。經檢索尚未見到銀化反相高壓 液相層析有關的專利文獻報導。發明內容本發明的目的是提供一種工藝簡單快速、收率高、純度高(純度 95%以上)的含烯鍵活性物質的純化方法。本發明採用的技術方案是將銀離子添加到洗脫劑中，採用反相 高壓液相層析法對油脂或天然藥物中的含烯鍵活性物質進行分離或 純化，其中使用的反相高壓液相層析系統包括高壓輸液泵、進樣器、 反相製備層析柱、檢測器、自動餾分收集器和數據採集處理系統。其 中，層析柱為反相製備層析柱(C18, C8等)，柱長20 50 cm，內徑 1 20 cm,填料顆粒5 30 |om，流量10 mL 100 mL/min，壓力2 50 MPa。進一步地，所述含烯鍵活性物質在自然界中主要以不飽和脂肪酸 及其衍生物形式存在，包括油酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸等等。進一步地，洗脫劑優選二元洗脫劑， 一相為甲醇或類似溶劑，例 如乙腈或乙醇等，另一相為銀離子酸性水溶液。進一步地，所述銀離子酸性水溶液中的銀離子以硝酸銀形式存 在，濃度為O. l 0.5mol/l，酸為醋酸，水溶液中酸的濃度為0. 1% 1% (重量百分比濃度)，其中的水優選二次蒸餾水。根據油脂或天然藥物中含烯鍵活性物質對的分離難易程度，採用等度或梯度洗脫劑洗脫，檢測器檢測目標餾分，將自動餾分收集器收 集到的目標餾分合併，用脂溶性溶劑萃取，濃縮至幹或結晶，可得純度在95%以上的含烯鍵活性物質純品。本發明的優點是採用銀化洗脫劑，可根據目標物質純化的難易 程度，在線調節銀離子濃度繼而調節系統的分離純化能力，具有可控 性好、自動化程度高的特點；採用普通反相製備層析柱，具有經濟、 方便的特點，本發明採用高壓液相層析系統，具有純化能力強、分離 效率高、速度快、有機溶劑消耗量小、重現性好等優點，適合油脂或 天然藥物中含烯鍵活性物質的製備和純化。
圖1為N—異丁基十二碳四烯醯胺的銀離子反相高壓液相層析 圖。其中1為(2E，4Z，8Z，10Z)- N-異丁基十二碳四烯醯胺；2為 (2E， 4E， 8Z， 10E) - N-異丁基十二碳四烯醯胺。圖2為亞油酸的銀離子反相高壓液相層析圖。其中3為亞油酸。 圖3為牆草鹼的銀離子反相高壓液相層析圖。其中4為牆草鹼。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明的具體實施過程作進一步地詳細說明。 本發明的從油脂或天然藥物中純化含烯鍵活性物質的方法先採用合適的溶劑(如正己烷)，從油脂或天然藥物中提取出含烯鍵活性物質，並經柱層析粗分離，再將所得到的粗分離組分採用銀化反相高壓液相層析進行精分離，合併目標餾分可製備得到純品，具體過程為 將銀離子添加到洗脫劑中，優選二元洗脫劑，採用反相高壓液相層析 對油脂或天然藥物中的含烯鍵活性物質進行分離。所述的反相高壓液 相層析系統包括高壓輸液泵、進樣器、反相製備層析柱、檢測器、自動餾分收集器和數據採集處理系統(未示出具體結構圖)。所述的層析柱為反相製備層析柱(C18， C8等)，柱長20 50 cm，內徑1 20 cm, 填料顆粒5 30 (om，流量IO mL 100 mL/min，壓力2 50 MPa。所 用的二元洗脫劑， 一相為甲醇或乙醇或乙腈，另一相為銀離子酸性水 溶液。銀離子酸性水溶液中的銀離子以硝酸銀形式存在，其濃度為 0. 1 0.5M，酸性水溶液中的酸指醋酸，其濃度為0. lwt% lWto/。， 水為二次蒸餾水。根據油脂或天然藥物中的含烯鍵活性物質對的分離 難易程度，採用等度或梯度洗脫劑洗脫，檢測器檢測目標餾分，將自 動餾分收集器收集到的目標餾分合併，用脂溶性溶劑萃取，濃縮至幹 或結晶，可得純度在95。/。以上的含烯鍵活性物質。實施例1從杜衡中製備(2E， 4Z， 8Z， 10Z)-N-異丁基十二碳四烯醯胺(2E， 4Z， 8Z， 10Z)-N-異丁基十二碳四烯醯胺存在於藥用植物杜衡 中，具有解熱鎮痛等藥理活性。與(2E，4E，8Z，10E)-N-異丁基十二碳四烯醯胺是順反異構體，同時存在於杜衡中。將杜衡全草於6(TC下恆溫乾燥20min,粉碎至50目，準確稱取 1 kg，用正己烷兩次回流提取(2X2 L) 24 h，濃縮的樣品進行矽膠 柱層析，以正己烷一無水乙醚(l:l)為洗脫劑，得到含烯鍵的醯胺粗 品。取l/10份樣品溶解於5mL甲醇中，進行銀化反相高壓液相層析 分離。在Waters Delta Pr印4000製備級高壓液相層析儀(996光 電二極體陣列檢測器、Millennium 32層析工作站)上完成。層析柱 採用日本資生堂C18高壓製備層析柱(250x25 mm， 5 pm); 二元洗脫 劑， 一相為甲醇，另一相為濃度0.5wt。/。的醋酸水溶液，其中添加有 0. 3 mol/L的銀離子，梯度洗脫條件20分鐘從40%甲醇升高到100%甲醇。流速為20 mL/min，檢測波長為254 nm，進樣體積5 mL， 柱溫為室溫。製備層析圖見圖l。分別將12. 4min 13. 4 min流出的餾分及15. 2 min 18min流出 的餾分收集，用正己烷萃取，重結晶，即可得到兩個異構體的純品(純 度為99%，氣相色譜檢測)。第一個餾分的物理性質和光譜數據如下無色晶體，mp 63°C，
UV max (MeOH): 261.7， 235. 8 nm; IR v max Cm—1: 3300 (NH) ， 2910 (CH)， 1720 (C=0)， 1650 (C0NH)， 1550， 990 (trans, C=C), 690 (cis, C二C); EI/MS: 70 eV， m/z 247. 2 [M]+ (0.02)， 246.2 [M-H]+ (0.04), 167.1 [M-C6H8]+ (5.6)， 81.0 [M-C10H16N0] + (100)， 67.0 [!^1^0] + (3.2)， 41.0 [M-C13H2。N0]+ (5.5); 1H—NMR (400 MHz, CDC13) S 5. 82 (IH， d， J = 15 Hz H-2)， 7. 54(1H， dd， J 二 15， 11. 5 Hz H-3)， 6.11 (IH， dd， J = 11.5， 11.5 Hz H-4)， 5,78 (1H， dt， J 二 11.5， 7 Hz H—5)， 2.33 (2H， br dt， J 二 7， 7 H_6)， 2.27 (2H， br dt， J 二 7, 7 H-7)， 5.42 (1H, dt， J = 10， 7 Hz H-8)， 6.32 (1H， brt， J 二 10 HzH-9)， 6.25 (1H， tq， J = 10， 7 Hz H-10) ， 5.55 (1H， dq， J = 10， 7 Hz H-ll)， 1.75 (3H， dd， J = 7， 2 Hz H-12)， 3. 16 (2H， t， J : 7HzH-1，)， 1.80 (IH， m， H-2，)， 0.93 (6H， d， H-3， ， 4，)。通過 結構解析可證明為(2E, 4Z， 8Z， lOZ)-N-異丁基十二碳四烯醯胺。 實施例2從大豆油中製備亞油酸將100g大豆油用200mL正己垸溶解後用矽膠層析柱進行粗分離， 採用正己烷一乙酸乙酯(1:1)為洗脫劑，用氣相色譜追蹤亞油酸粗組 分。將50mL甲醇萃取後進行銀化反相高壓液相層析分離。在Waters Delta Pr印4000製備級高壓液相層析儀(996光電二極體陣列檢測 器、Millennium 32層析工作站)上完成。層析柱採用日本資生堂C18高壓製備層析柱(250x25 mm， 5 pm); 二元洗脫劑， 一相為甲醇，另 一相為0. 5%醋酸溶液並添加0. 3 M的銀離子，梯度洗脫條件30分 鍾從40%甲醇升高到100%甲醇，保持20分鐘。流速為20 mL/min， 檢測波長為254 nm，進樣體積5 mL,柱溫為室溫。製備層析圖見圖 2。將22min 24min流出的餾分收集，用正己垸萃取，即可得到亞 油酸的純品(純度為98Q^，氣相色譜檢測)。採用質譜定性。 實施例3從北細辛中製備牆草鹼牆草鹼存在於中藥北細辛中，具有解熱鎮痛等藥理活性。結構為 (2E， 4E)-N-異丁基-2， 4-癸二烯醯胺。將北細辛根於60。C下恆溫幹 燥20min，粉碎至50目，準確稱取1 kg，用正己烷兩次回流提取(2 X2L) 24 h，濃縮的樣品進行矽膠柱層析，以正己垸一乙酸乙酯(l:l) 為洗脫劑，氣相色譜跟蹤目標成分，以獲得粗組分。取l/3份樣品溶 解於5mL甲醇中，進行銀化反相高壓液相層析分離。在Waters Delta Pr印4000製備級高壓液相層析儀(996光電二極體陣列檢測器、 Millennium 32層析工作站)上完成。層析柱採用日本資生堂C18高 壓製備層析柱(250x25 mm, 5 pm); 二元洗脫劑， 一相為甲醇，另一 相為濃度0.3wty。的醋酸水溶液，其中添加有0.2 mol/L的銀離子， 梯度洗脫條件40分鐘從40%甲醇升高到100%甲醇並保持10分鐘。 流速為20 mL/min，檢測波長為254 nm，進樣體積5 mL，柱溫為室 溫。製備層析圖見圖3。值得注意的是，儘管本文只給出了一些具體的含烯鍵活性物質， 特別是不飽和脂肪酸及其衍生物從油脂或天然藥物中分離(純化)的 實施例，但是，由於本發明的方法的普適性，本領域的技術人員能夠 基於本領域的公知常識進行概括，確定任何常規的從油脂或天然藥物中分離(或純化)的含烯鍵活性物質都可以採用本發明的方法進行分 離純化，其它具體的含烯鍵活性物質的實施例不再一一贅述。儘管上文對本發明的具體實施方式
進行了詳細的描述和說明，但 應該指明的是，我們可以對上述實施方式進行各種等同改變和修改， 但這些都不脫離本發明的精神和所附的權利要求所記載的範圍。
權利要求
1、一種從油脂或天然藥物中分離得到高純度含烯鍵活性物質的方法，其特徵在於將銀離子添加到洗脫劑中，採用反相高壓液相層析系統對油脂或天然藥物中的含烯鍵活性物質進行分離。
2、 按照權利要求1所述的方法，進一步包括在銀化反相高壓液相層 析之前用合適的溶劑從油脂或天然藥物中提取出含烯鍵活性物質，並 經柱層析粗分離的步驟。
3、 按照權利要求2所述的方法，進一步包括在銀化反相高壓液相層析之後用適當的溶劑萃取的步驟。
4、 按照權利要求3所述的方法，進一步包括在萃取後重結晶的步驟。
5、 按照權利要求1-4任一項所述的方法，其特徵在於所述含烯鍵 活性物質為在自然界中主要以不飽和脂肪酸或其衍生物形式存在的 活性物質。
6、 按照權利要求1-4任一項所述的方法，所述反相高壓液相層析系統包括高壓輸液泵、進樣器、反相製備層析柱、檢測器、自動餾分收集器和數據採集處理系統。
7、 按照權利要求1所述的方法，其特徵在於所述反相高壓液相層析系統中的層析柱為反相製備層析柱，柱長20 50 cm，內徑1 20 cm，填料顆粒5 30(im，洗脫劑流量10 mL 100 mL/min，系統壓力 2 50 MPa。
8、 按照權利要求1-4任一項所述的方法，其特徵在於所述洗脫劑 為二元洗脫劑，其中一相為銀離子酸性水溶液，洗脫為等度洗脫或梯 度洗脫。
9、 按照權利要求8所述的方法，其特徵在於所述二元洗脫劑的另一相為甲醇或乙腈或乙醇。
10、按照權利要求8所述的方法，其特徵在於所述銀離子酸性水溶液中的銀離子以硝酸銀形式存在，濃度為0. 1 0.5 mo1/1，所述酸 為醋酸，酸性水溶液中醋酸的濃度為0. lwt% lwt%。
全文摘要
本發明公開了一種從油脂或天然藥物中分離出高純度含烯鍵活性物質的方法，包括將銀離子添加到洗脫劑中，使用反相高壓液相層析系統對難分離的含烯鍵活性物質進行高選擇性分離，收集合併目標餾分可得到高純度的目標化合物。本發明使用銀化洗脫劑，可根據目標物質純化的難易程度，在線調節銀離子濃度繼而調節系統的分離純化能力，具有可控性好、自動化程度高的優點；本發明使用了普通的反相製備層析柱，具有經濟、方便的特點，本發明採用高壓液相層析系統，具有純化能力強、分離效率高、速度快、有機溶劑消耗量小、重現性好等優點，適合油脂或天然藥物中含烯鍵活性物質的製備和純化。
文檔編號B01D15/32GK101234944SQ20081010144
公開日2008年8月6日 申請日期2008年3月6日 優先權日2008年3月6日
發明者儲曉剛, 雲 凌, 峰 張, 李秀琴, 煒 雍 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院