一種小窩蛋白‑1腳手架區融合多肽的製備方法及其應用與流程

2023-12-02 17:08:56 1

本發明涉及一種小窩蛋白-1腳手架區融合多肽的製備方法及其應用，屬於生物醫藥領域。

背景技術：

有各種感染疾病誘發的急性肺損傷及其嚴重階段的急性呼吸窘迫綜合症，發病率高，並且目前尚無有效治療藥物故死亡率也極高。因此研發有效治療急性肺損傷疾病的藥物是具有非常重要的臨床意義。

小窩蛋白-1是細胞膜小窩的重要組成蛋白，其第82～101位胺基酸被稱為小窩蛋白-1腳手架區在細胞信號轉導、跨膜物質轉運等生物學功能發揮重要作用。最近的研究表明，利用腺病毒或者慢病毒為載體能夠治療各種肝、肺和腎臟等臟器纖維化疾病。但由於基因治療所用載體腺病毒或者慢病毒具有諸如費用昂貴、操作複雜、誘導宿主免疫反應和潛在的致病風險等嚴重缺陷，無法在醫院廣泛推廣。最近的研究發現小窩蛋白-1腳手架區能夠替代小窩蛋白-1的功能，同樣具有多種治療作用。

生物活性多肽作為藥物具有其獨特的優點：首先，分子量小，無免疫原性，比較安全：其次，結構相對簡單，功能較明確，特異、副作用小；第三，分子小，易於合成，結構易於改造，生產成本低；第四，多肽藥物易於從多途徑吸收，因此給藥途徑可多樣化(如口服、噴霧、透皮吸收等)；第五，合成的多肽純度較高，不存在熱源問題。正因為如此，國內外對多肽藥物的研究特別重視。

技術實現要素：

為了解決上述問題，本發明提供了具有抗炎作用的小窩蛋白-1腳手架區融合多肽及其製備方法，以及融合多肽在製備抗炎藥物方面的應用。

本發明的第一個目的是提供一種具有抗炎作用的小窩蛋白-1腳手架區融合多肽，所述多肽的胺基酸序列為dgiwkasfttftvtkywfyrrqikiwfqnrrmkwkk(序列如seqidno:1所示)。

本發明的第二個目的是提供編碼所述多肽的核苷酸序列。

本發明的第三個目的是提供一種抗炎藥物，所述抗炎藥物以胺基酸序列為seqidno:1所示的多肽作為有效成分或者主要有效成分。

在一種實施方式中，所述藥物中還包括藥學上可接受的賦型劑。所述藥學上可接受的賦型劑是指任何可用於藥學領域的稀釋劑、輔助劑和/或載體。

在一種實施方式中，本發明的多肽可以與其他活性成分組合使用，只要它們不產生其他不利的作用，例如過敏反應。

在一種實施方式中，本發明的藥物可配製成若干種劑型，其中含有藥學領域中常用的一些賦形劑；例如，口服製劑(如片劑，膠囊劑，溶液或混懸液)；可注射的製劑(如可注射的溶液或混懸液，或者是可注射的乾燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部製劑(例如軟膏或溶液)。

在一種實施方式中，用於本發明藥物的載體是藥學領域中可得到的常見類型，包括：口服製劑用的粘合劑、潤滑劑、崩解劑、助溶劑、稀釋劑、穩定劑、懸浮劑、無色素、矯味劑等；可注射製劑用的防腐劑、加溶劑、穩定劑等；局部製劑用的基質、稀釋劑、潤滑劑、防腐劑等。藥物製劑可以經口服或胃腸外方式(例如靜脈內、皮下、腹膜內或局部)給藥，如果某些藥物在胃部條件下是不穩定的，可將其配製成腸衣片劑。

本發明的第四個目的是提供一種所述多肽的製備方法。

在一種實施方式中，所述多肽是採用微波輔助固相合成法製備得到的。

在一種實施方式中，所述多肽的製備方法，以吡啶/二甲基甲醯胺為溶劑，苯丙三氮唑/二四甲基脲六氟磷酸酯為縮合試劑，反應物濃度為0.113mmol/l，反應時間為4分鐘，反應溫度為20℃。此時腳手架區多肽的產率最高，為87.7％，純度為97％。

在一種實施方式中，所述多肽的製備方法，是先製備fmoc-tyr(t-bu)-wang樹脂並封閉未反應羥基，然後採用微波輔助脫除fmoc保護基，再微波輔助縮合fmoc-tyr(t-bu)-0h反應，按照腳手架區多肽中胺基酸從羧基到氨基端的順序，重複縮合和脫保護兩步反應，合成腳手架區多肽。

在一種實施方式中，所述多肽的製備方法，包括下列步驟：

1)fmoc-tyr(t-bu)-wang樹脂的製備及未反應羥基的封閉

稱量wang樹脂置於反應器中，加入二氯甲烷溶脹樹脂，抽濾脫去二氯甲烷溶劑，將fmoc-tyr(t-bu)-0h連接到樹脂上；分別加入二氯甲烷，甲醇和二甲基甲醯胺各洗滌樹脂三次；向上面得到的樹脂中加入乙酸酐和吡啶，反應2h；最後加入二氯甲烷和甲醇各漂洗樹脂以封閉未反應羥基。

2)微波輔助脫除fmoc保護基

將上一步得到的fmoc-tyr(t-bu)-wang樹脂置於反應管中，然後加入哌啶/二甲基甲醯胺溶液，反應在微波反應器中進行，時間為6min-10min；

3)微波輔助縮合fmoc-tyr(t-bu)-0h反應

稱量fmoc-tyr(t-bu)-0h，ⅳ-羥基-7-偶氮苯丙三氮唑和羥基一苯並三氮唑，其中胺基酸過量1倍，用適量的二甲基甲醯胺溶解；然後加入到樹脂中，同時加入的二異丙基乙基胺，微波輻射下反應；然後抽濾掉反應液，分別加入二氯甲烷、甲醇和二甲基甲醯胺各洗滌3次；

4)肽鏈的延長

按照腳手架區多肽中胺基酸從羧基到氨基端的順序，重複縮合和脫保護兩步反應，合成腳手架區多肽，此過程中各個胺基酸的過量倍數均為1倍。

本發明還要求保護表達所述多肽的轉基因細胞系、含有編碼所述多肽的載體、含有編碼所述多肽的宿主等等。

本發明的優點和效果：

本發明製備得到的小窩蛋白-1腳手架區多肽純度大於97％，產量達到87.7％。體外實驗和體內實驗表明，該多肽能夠明顯降低炎症環境中原代培養的大鼠巨噬細胞和小鼠肺組織中白介素-1、腫瘤壞死因子-α、單核細胞趨化蛋白-1和誘導型一氧化氮合酶等各種促炎症因子的表達，從而達到抗炎的目的。

具體實施方案

下面的實例將具體說明本發明的操作方法，但不能作為對本發明的限定。

實施例1：微波輔助固相合成小窩蛋白-1腳手架區多肽的具體主要操作步驟

(1)fmoc-tyr(t-bu)-wang樹脂的製備及未反應羥基的封閉

稱量wang樹脂2g置於反應器中，加入二氯甲烷15ml溶脹樹脂30min，抽濾脫去二氯甲烷溶劑，將fmoc-tyr(t-bu)-0h連接到樹脂上。反應結束後，分別加入二氯甲烷，甲醇和二甲基甲醯胺各2ml各洗滌樹脂三次。未反應羥基的封閉：向上面得到的樹脂中加入乙酸酐和吡啶，反應2h。反應結束後，加入二氯甲烷和甲醇各漂洗樹脂3次。

(2)微波輔助脫除fmoc保護基

將0.1mmolfmoc-tyr(t-bu)-wang樹脂置於反應管中，然後加入2ml20％哌啶/二甲基甲醯胺溶液，反應在微波反應器中進行，時間為6min-10min。反應結束後，分別加入二氯甲烷、甲醇和二甲基甲醯胺各2ml洗滌樹脂3次。

(3)微波輔助縮合反應

1)縮合fmoc-tyr(t-bu)-0h稱量fmoc-tyr(t-bu)-0h0.1g，ⅳ-羥基-7-偶氮苯丙三氮唑0.1g和羥基一苯並三氮唑0.23g，胺基酸過量1倍，用二甲基甲醯胺溶解。然後加入到樹脂中，同時加入0.34mmol的二異丙基乙基胺，微波輻射下反應；然後抽濾掉反應液，分別加入二氯甲烷、甲醇和二甲基甲醯胺各2ml洗滌樹脂3次。

2)肽鏈的延長按照腳手架區多肽中胺基酸從羧基到氨基端的順序，重複縮合和脫保護兩步反應，合成腳手架區融合多肽，此過程中各個胺基酸的過量倍數均為1倍。最終得到以吡啶/二甲基甲醯胺為溶劑，苯並三氮唑/二四甲基脲六氟磷酸酯為縮合試劑，反應物濃度為0.113mmol/l，反應時間為4分鐘，反應溫度為20℃為最佳反應條件，此時腳手架區多肽的產率最高，為87.7％，純度為97％。比傳統單純固相合成的方法相比，微波將縮合反應速率提高了15倍以上，胺基酸過量倍數也從傳統的3倍降低到過量1倍，減少腳手架區多肽的合成成本約40％。

最終合成得到序列如seqidno:1所示的csd多肽。

實施例2：小窩蛋白-1腳手架區多肽降低原代培養的大鼠巨噬細胞中白介素-1、腫瘤壞死因子-α、單核細胞趨化蛋白-1和誘導型一氧化氮合酶等各種促炎症因子的表達

分離培養原代大鼠肺泡巨噬細胞，將細胞分為5組，(1)normal組(即對照組)：完全培養基培養；(2)ap組：預處理10μmap多肽；(3)lps組：100ng/mllps處理16h；(4)lps+hemin組：20μmhemin和lps處理16h；(5)lps+hemin+csd多肽組：10μmcsd多肽預處理6h後，lps和hemin處理16h。

1.原代肺泡巨噬細胞的分離純化培養：通過氣管插管用冷的生理鹽水對雄性sd大鼠進行肺泡灌洗，將獲得灌洗液4℃，1,000rpm離心10min後，將沉澱重懸與dmem完全培養基中，2h後換液，貼壁的為原代大鼠的肺泡巨噬細胞。

2.實時螢光定量pcr法檢測炎症因子和m1/m2表型標誌物：提取給藥處理後細胞的總rna，將其分別逆轉為等量的cdna，通過syrbgreen實時螢光定量pcr法檢測相關基因的表達水平。測定結果：lps組與正常組和ap組相比，可以明顯增加炎症因子白介素-1(il-1β)和單核細胞趨化蛋白-1(mcp-1)以及經典活化巨噬細胞型(m1型)標誌物腫瘤壞死因子α(tnf-α)和誘導型一氧化氮合酶(inos)的基因表達水平(p<0.05)，說明lps可以誘導巨噬細胞炎症損傷。

而細胞預處理6hcsd多肽組則可以降低炎症因子及m1表型標誌物的基因表達水平，並且增加替代性活化巨噬細胞型(m2型)標誌物白細胞分化抗原163(cd163)，白介素-10(il-10)的表達水平，說明csd多肽的預處理可有效增強巨噬細胞抵抗炎症損傷的能力，並且使得巨噬細胞從m1到m2表型極化增多，進而起到抗炎保護作用。其中，與lps+hemin組相比，lps+hemin+csd多肽組的il-1β、mcp-1、tnf-α、inos的表達量分別降低了61％、43％、50％、44％左右；而cd163和il-10的表達量分別提高了62％、98％。

3.griess法檢測細胞培養基中一氧化氮的表達量：收集給藥處理細胞培養基上清，通過griess顯色法檢測其中一氧化氮的表達量。正常組，ap組一氧化氮的表達量分別為4.92±1.35，5.01±1.51，兩者之間無顯著性差異。lps組，lps+hemin組，lps+hemin+csd組培養基中一氧化氮的表達量分別為120.22±9.65，113.92±9.85，90.33±15.62，較正常組lps可顯著增加一氧化氮表達量(p<0.05)，lps+hemin組較lps組可降低一氧化氮的表達量但兩者無顯著性差異，而較lps+hemin組csd預處理可明顯降低一氧化氮的表達水平(p<0.05)。說明csd多肽的預處理不但可以降低基因水平炎症因子的表達水平且可以降低胞外一氧化氮的表達量。

4.ho-1活性檢測：通過檢測血紅素的分解代謝產物膽紅素的含量比較ho-1活性高低。正常組，ap組，lps組，lps+hemin組，lps+hemin+csd組的ho-1活性分別為1124±92、1179±31、1776±82、2410±131、3677±270。lps組較正常組可增加ho-1活性(p<0.05)，lps+hemin組較lps組可顯著增加ho-1活性(p<0.05)，csd預處理組可更進一步顯著增加ho-1活性(p<0.05)。說明csd是通過增加ho-1活性產生的對巨噬細胞的抗炎保護作用。

實施例3：小窩蛋白-1腳手架區多肽降低肺組織中白介素-1、腫瘤壞死因子-α、單核細胞趨化蛋白-1和誘導型一氧化氮合酶等各種促炎症因子的表達

將清潔級成年雄性balb/c小鼠60隻隨機分為6組，(1)sham組(即假手術組)：小鼠腹腔注射300μl生理鹽水；(2)ap組：腹腔注射4mg/kgap多肽；(3)lps組：小鼠氣管滴注5mg/kglps溶液；(4)lps+hemin組：小鼠腹腔注射50μmol/kghemin溶液，24h後氣管滴注lps溶液；(5)lps+hemin+csd組：小鼠腹腔注射50μmol/kghemin和4mg/kgcsd多肽，24h後氣管滴注溶液；(6)lps+hemin+csd+znpp組：小鼠第一天腹腔注射hemin，連續兩天腹腔注射csd多肽，lps氣管滴注前2h腹腔注射50μmol/kgznpp。

1.肺組織病理形態改變：將取下的左肺在中性甲醛溶液中固定24h後,脫水、石蠟包埋、切片，經蘇木素伊紅(hematoxylineosin,he)染液染色觀察肺損傷程度。正常組及ap組小鼠肺泡結構完整，肺泡腔無炎性細胞浸潤；而lps組小鼠肺部可以觀察到炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚，大量紅細胞滲出，肺泡斷裂，肺泡腔萎縮不張；lps+hemin+csd組肺組織損傷明顯減輕，lps+hemin+csd+znpp組出現嚴重的肺結構破壞情況。

2.肺溼幹比檢測：分離小鼠肺組織後，肺組織稱溼重後置於60℃溫箱，72h後至恆重後再記錄肺組織乾重，計算溼/乾重比。正常組、ap組、lps組、lps+hemin組、lps+hemin+csd組及lps+hemin+csd+znpp組肺溼幹比分別為4.06±0.08、4.06±0.39、5.02±0.24、4.80±0.21、4.31±0.11以及5.29±0.31。較lps組和lps+hemin組，csd多肽可以有效地降低lps引起的肺水腫表現為溼幹比降低。

3.小鼠血清乳酸脫氫酶(ldh)活力檢測：分離小鼠血清，分別設定空白孔、標準孔、測定孔和對照孔測定血清ldh活力。正常組、ap組、lps組、lps+hemin組、lps+hemin+csd組及lps+hemin+csd+znpp組ldh活力分別為1501±136、1526±160、3933±453、3740±182、3555±343以及4250±102。csd多肽預處理可以明顯降低血清中ldh活性。

4.實時螢光定量pcr檢測小鼠肺組織炎症因子的表達：稱取20mg小鼠肺組織，提取組織總rna，將其分別逆轉為等量的cdna，通過syrbgreen實時螢光定量pcr法檢測相關基因的表達水平。與正常組比較，lps組肺組織中il-1β、il-6、tnf-α、mcp-1和inos等炎症因子表達明顯增高(p<0.05)；而與lps組相比，lps+hemin+csd組各炎症因子的表達明顯降低(p<0.05)；與lps+hemin+csd組相比，lps+hemin+csd+znpp組肺組織中各炎症因子表達明顯增高(p<0.05)。說明csd多肽在體內也具有抗炎保護作用。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。

序列表

江南大學

一種小窩蛋白-1腳手架區融合多肽的製備方法及其應用

1

patentinversion3.3

1

36

prt

人工序列

1

aspglyiletrplysalaserphethrthrphethrvalthrlystyr

151015

trpphetyrargargglnilelysiletrppheglnasnargargmet

202530

lystrplyslys

35