一株殺鞘翅目害蟲的蘇雲金芽孢桿菌的製作方法

2023-11-07 04:29:07 1

專利名稱：一株殺鞘翅目害蟲的蘇雲金芽孢桿菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及芽孢桿菌，更具體涉及殺鞘翅目害蟲的蘇雲金芽孢桿菌。
蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)，本發明所稱的一株殺鞘翅目害蟲的蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis yc-03)，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NOM201003，培養物名稱為Bacillusthuringiensis yc-03(cry3A)，該菌株是從我國土壤樣品中分離、並以柳蘭葉甲、馬鈴薯甲蟲為試蟲，經過毒力生物測定所篩選出的對鞘翅目害蟲有高毒力的菌株。根據分離該菌株的土壤樣品來源地的名稱和殺鞘翅目昆蟲的特點，取雲南(Yunnan)、鞘翅目(Coleoptera)的第一個字母組成其代碼YC，又因該菌株是從同一土壤樣品中分離的多株芽孢桿菌中篩選出來的、且編號為03的一株，因此將該蘇雲金芽孢桿菌命名為YC-03。
基本的技術原理是利用芽孢可耐80℃高溫的特性，在80℃高溫下通過彈土法分離蘇雲金芽孢桿菌。以2齡柳蘭葉甲和馬鈴薯甲蟲的幼蟲為試蟲，進行毒力生物測定，經過比較毒力致死中量Lc50，篩選到該高毒力菌株。
鞘翅目害蟲的危害僅次於鱗翅目害蟲，對農林牧業生產有重大危害，1991年我國新疆霍城地區首次發現馬鈴薯甲蟲入侵，迅速蔓延並對農作物造成巨大危害。因此，篩選出對鞘翅目有高效的蘇雲金芽孢桿菌並運用其生產新型殺蟲劑具有現實意義和緊迫性。為了擴大蘇雲金芽孢桿菌的殺蟲譜和提高殺蟲活性，目前國內外均致力於新菌株的分離鑑定和新的殺蟲基因的開發。在蘇雲金芽孢桿菌菌株的分離鑑定、篩選方面，文獻「土壤來源的蘇雲金芽孢桿菌的形態、δ-內毒素蛋白質及其毒力特性(微生物學報，1992，32(6)387-393)」、「從土壤分離的410株蘇雲金芽孢桿菌的鑑定(華中農業大學學報，1994，第二期)、「我國南北方土壤中蘇雲金芽孢桿菌的分布及殺蟲特性」(微生物學報，1996，36(4)；295-302)、及「土壤來源的五個蘇雲金芽孢桿菌新亞種的鑑定(微生物學報，1999，39(2)154-159)等對我國蘇雲金芽孢桿菌的分離、鑑定、分布特點、晶體蛋白質形態、殺蟲特性等進行了研究。在高效、特異性菌株的篩選方面，文獻「對斜紋夜蛾高毒力的Bt新分離株及其特性的研究(微生物學通報，1997，24(5)262-265)」、「對夜蛾幼蟲高毒力的蘇雲金芽孢桿菌菌株及其晶體蛋白質特徵(中國生物防治，1997，13(2)82-85)」、及「蘇雲金芽孢桿菌對甜菜夜蛾毒性的篩選(中國病毒學，2000，Vol.1598-101)」等分別從眾多的蘇雲金芽孢桿菌菌株中篩選到了殺鱗翅目夜蛾科害蟲的高效特異性菌株；在殺蟲基因克隆和工程菌構建方面，目前全世界已克隆了33類近200個蘇雲金芽孢桿菌的基因，文獻「抗鞘翅目δ-內毒素及毒素基因文庫的構建(生物工程學報，1994，10(2)103-108)」、「蘇雲金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質基因的啟動子及其轉錄調控(微生物學通報，1999，26(2)130-134)」、「蘇雲金芽孢桿菌高效菌株cry基因分析及多價基因組合的研究(南開大學學報，1999，32(3)163-168)」等分別建立了抗鞘翅目δ-內毒素的基因文庫、克隆了殺鱗翅目害蟲的基因，對蘇雲金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質基因的表達與調控進行了闡述。文獻「殺蟲防病基因工程枯草芽孢桿菌的構建」(生物工程學報，-1999，15(2)215-220)以枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭質粒載體pHB201和pRP22為載體，通過感受態轉化方法，將蘇雲金芽孢桿菌HD-1殺蟲蛋白質基因crylAc導入水稻紋枯病生防菌株枯草芽孢桿菌B916。工程菌株質粒酶切電泳分析，核酸印記(Southern)分析和殺蟲生物活性測定結果證實了crylAc基因的導入及其在B916中的有效表達。抑菌測定證明了工程菌保持了原野生型菌株良好的抑菌活性。文獻「蘇雲金芽孢桿菌以色列亞種130000道爾頓殺蚊蛋白質基因在枯草芽孢桿菌中的表達」將蘇雲金芽孢桿菌以色列亞種殺蚊蛋白質基因亞克隆到pNQ122載體上，通過枯草芽孢桿菌原生質體轉化，得到KMr-CMs的正反向克隆子。蛋白質免疫雜交(Western-blotting)證明殺蚊蛋白質基因在枯草芽孢桿菌中表達了具有免疫活性的殺蚊蛋白質。所表達的殺蚊蛋白在實驗中具有殺蚊活性。
YC-03是國內首次分離獲得的殺鞘翅目害蟲的蘇雲金芽孢桿菌，並對其有關特性進行了研究。該蘇雲金芽孢桿菌菌株的殺蟲特點和毒力水平國內領先，達到國際先進水平。
本發明的目的是，提供一株對鞘翅目害蟲具有特異性毒殺作用的蘇雲金芽孢桿菌。
為了達到上述目的，本發明利用芽孢可耐80℃高溫的特性，在80℃高溫下通過彈土法從我國雲南的土壤樣品中分離出蘇雲金芽孢桿菌。以2齡柳蘭葉甲和馬鈴薯甲蟲的幼蟲為試蟲，進行毒力生物測定，經過比較毒力致死中量Lc50，篩選到該高毒力菌株。
該菌株的具體特徵如下1、血清型以YC-03的鞭毛抗原與Bt的標準抗血清進行交叉凝集反應及交叉吸收凝集反應試驗，YC-03的H血清型為H8ab，屬蘇雲金芽孢桿菌的莫氏亞種(Bacillus thuringiensissubsp.morrisoni)。
2、生化特性按Barjac的經典方法進行生理生化試驗。
蘇雲金芽孢桿菌YC-03菌株的生化特徵
圖5(c)為對比樣CaS∶Eu的餘輝特性曲線(發紅光)圖6為實例2材料的X射線衍射圖為了更詳細地說明本發明，下面結合實例進行詳細描述。實例1Me＝Ca， Ln＝Y， Yb，R＝NH4Cl，Na2CO3a＝0.004， b＝0.9945， c＝0.81x＝0.0015， y＝0原料配方
將上述原料放入研缽中仔細研細混勻後，放入剛玉坩堝中，在1200℃的通98％N2/2％H2的還原爐中燒結4小時，冷卻後研細，用水仔細洗滌後烘乾即得實施例樣品。該材料呈橙紅髮光。實例2Me＝Ca， Ln＝La， R＝Li3PO4，K2CO3Re＝Sia＝1.0，b＝0.994， c＝0.9x＝0.001， y＝0.001原料配方
不汙染環境，有良好的經濟和生態效益。因而，從優越而獨特的殺蟲特性、生產和使用成本低、對人和動植物安全、不汙染環境及市場需求等方面考慮，蘇雲金芽孢桿菌YC-03有良好的推廣應用前景。並且由於該菌株遺傳特性比較穩定，故該菌適合用作構建廣譜或高效工程菌的受體菌。
用本發明製備的殺鞘翅目害蟲的蘇雲金芽孢桿菌YC-03殺蟲劑經發酵小試及中試、菌劑生產、田間試驗、示範應用，其質量達到農業部規定的一級標準；防治馬鈴薯甲蟲、猿葉蟲等鞘翅目害蟲的防效達到80％以上；並用該菌株的高含量粉劑製備了殺鞘翅目害蟲的蘇雲金芽孢桿菌殺蟲劑的質量檢測標準。
權利要求
1.一株殺鞘翅目害蟲的蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis yc-03)，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NOM 201003，培養物名稱為Bacillusthuringiens yx-03 (cry3A)其特徵在於，該菌株是具有如下特性的蘇雲金芽孢桿菌a、以該菌株的鞭毛抗原與Bt的標準抗血清進行交叉凝集反應及交叉吸收凝集反應試驗，該菌株的H血清型為H8ab，屬蘇雲金芽孢桿菌的莫氏亞種(Bacillus thuringiensis subsp.morrisoni)；b、按Barjac的經典方法進行生理生化試驗，該菌株的生化特徵為
c、經SDS-PAGE分析，該菌株產生68-70kD的殺蟲晶體蛋白質；d、該菌株至少含64、45及9.0MD三種質粒；e、該菌株的殺蟲晶體蛋白質基因為cry3A，並且殺蟲晶體蛋白質基因的表達為非芽孢依賴型，即殺蟲晶體蛋白質的形成不依賴於芽孢的形成。
全文摘要
一株殺鞘翅目害蟲的蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensisyc－03),中國典型培養物保藏中心保藏號:CCTCCNO:M 201003,該菌株以柳蘭葉甲、馬鈴薯甲蟲為試蟲,經過毒力生物測定篩選對鞘翅目害蟲有高毒力的菌株,利用該菌株生產的殺蟲劑,可擴大蘇雲金芽孢桿菌殺蟲劑的使用範圍,降低農藥防治費用、減少化學農藥的汙染,對人、畜及動植物無害,具有良好的經濟和生態效益,由於該菌株遺傳特性比較穩定,故適合用作構建廣譜或高效工程菌的受體菌。
文檔編號C12N1/20GK1330140SQ01114288
公開日2002年1月9日 申請日期2001年6月15日 優先權日2001年6月15日
發明者高梅影, 戴順英, 彭可凡 申請人:中國科學院武漢病毒研究所