產生IL‑13的Tr1‑樣細胞及其用途的製作方法

2023-11-06 15:41:12

本申請是申請日為2011年6月30日的pct國際專利申請pct/ib2011/002269進入中國國家階段的中國專利申請號201180042091.x、發明名稱為「產生il-13的tr1-樣細胞及其用途」的分案申請。

本發明涉及分離的產生il-13的tr1細胞，用於鑑定/分離/富集它們的方法以及使用分離的產生il-13的tr1細胞用於診斷或者治療炎症性疾病、自身免疫病、過敏疾病和器官移植病的方法和試劑盒。

背景技術：

免疫系統的穩態依賴於對侵入病原體的免疫反應與對自身抗原的免疫耐受之間的平衡。中心和外周耐受是誘導和維持t細胞耐受的重要機制。在近十年內，許多注意力集中於在維持外周免疫耐受中起重要作用的調節性t細胞(treg)。現在已經堅定地確定treg可以分成兩個不同的亞型：天然treg(ntreg)和可誘導treg群體，例如tgf-β誘導的treg細胞、tr1細胞或者th3細胞。

ntreg主要作為foxp3+t細胞描述而tr1細胞描述為產生il-10的調節性t細胞(allan等，2008，immunologicalreviews，223：391-421)。foxp3+ntregs抑制/調節廣泛多種的不同免疫細胞，包括初始cd4+和cd8+t效應細胞和記憶cd4+和cd8+t效應細胞、b細胞、單核細胞和樹突細胞。tr1細胞通過分泌il-10和轉化生長因子β(tgf-β)調節免疫反應並具有抑制初始t細胞反應和記憶t細胞反應兩者的能力。

已經證明tr1細胞在細胞治療中是有用的，因為向具有克隆病的患者注射tr1細胞改善了他們的病症。然而，持續需要改善使用tr1細胞的這種細胞治療的有效性。

令人驚奇地是，發明人發現了能夠產生il-13的tr1細胞亞群。發明人證明，這些細胞除了具有tr1細胞標誌性的il-10抑制性作用之外，還具有通過il-13誘導的抑制性效應。

技術實現要素：

本發明的一個目標是能夠產生il-13的分離的tr1-樣細胞群體，優選地，分離的人tr1-樣細胞群體。在一個實施方案中，本發明的分離的tr1-樣細胞群體能夠在本發明所述測試a的條件下產生il-13。在本發明的一個實施方案中，所述分離的tr1-樣細胞群體產生低數量的il-4。在本發明的另一個實施方案中，所述分離的tr1-樣細胞群體表達：

‐cd4和

‐低水平cd127和

‐低水平cd62l。

在本發明的另一個實施方案中，所述分離的tr1-樣細胞是靜息細胞並表達低水平cd25和低水平foxp3。在本發明的另一個實施方案中，所述分離的tr1-樣細胞群體是活化的並表達cd25和中等水平的foxp3。

在本發明的另一個實施方案中，所述分離的tr1-樣細胞是抗原特異性的，優選地抗原是ii型膠原、卵清蛋白、髓磷脂鹼蛋白、髓磷脂少突膠質細胞蛋白或hsp。

在本發明的一個實施方案中，分離的tr1-樣細胞群體是能夠產生il-13的tr1-細胞群體，優選地人tr1細胞群體，優選在測試a條件下能夠產生il-13的tr1-細胞群體，優選地人tr1細胞群體。在本發明的一個實施方案中，本發明的tr1-樣細胞群體，優選本發明的tr1細胞群體，產生il-10，優選在測試a的條件下產生il-10。

本發明的另一目標是能夠產生il-13的分離的tr1-樣克隆，優選人分離的tr1-樣克隆。在一個實施方案中，本發明的分離的tr1-樣克隆能夠在本發明所述的測試a的條件下產生il-13。在本發明的一個實施方案中，所述分離的tr1-樣克隆產生少量的il-4。在另一個實施方案中，所述tr1-樣克隆表達：

‐cd4和

‐低水平cd127和

‐低水平cd62l。

在本發明的另一個實施方案中，所述分離的tr1-樣克隆是抗原特異性的，優選地抗原是ii型膠原、卵清蛋白、髓磷脂鹼蛋白、髓磷脂少突膠質細胞蛋白或hsp。

在本發明的一個實施方案中，分離的tr1-樣克隆是在測試a的條件下能夠產生il-13的tr1克隆，優選人tr1克隆。在本發明的一個實施方案中，本發明的tr1-樣克隆，優選本發明的tr1克隆在測試a的條件下產生il-10。

本發明的另一個目標是鑑定產生il-13的tr1-樣細胞群體的方法，包括：

-檢測cd127和cd62l標誌物中的至少一個和cd4在細胞群體上的細胞表面表達，

-檢測il-13的產生，

其中表達cd4和低水平cd127和/或低水平cd62l並產生il-13的細胞是產生il-13的tr1-樣細胞群體。

在一個實施方案中，本發明的方法用於鑑定分離的產生il-13的人tr1細胞群體，其中方法還包括檢測il-10的產生。

本發明的另一個目標是用於使細胞群體中富集產生il-13的tr1-樣細胞的方法，包括：

‐鑑定表達cd4和低水平cd127和/或低水平cd62l並產生il-13的細胞，

‐選擇所述細胞，

由此得到富集產生il-13的tr1-樣細胞的細胞群體，其中產生il-13的tr1-樣細胞百分數是富集前產生il-13的tr1-樣細胞百分數的至少兩倍。

在一個實施方案中，本發明的方法用於使細胞群體富集產生il-13的人tr1細胞群體，其中方法還包括檢測il-10的產生。

本發明的另一個目標是根據本文上述方法得到的富集的產生il-13的tr1-樣細胞群體。在本發明的一個實施方案中，群體富含產生il-13的人tr1細胞。

本發明的另一個目標是用於鑑定或者分離產生il-13的tr1-樣細胞群體，優選產生il-13的人tr1細胞群體的試劑盒，包括用於檢測cd4、cd25、cd127和cd62l細胞表面表達的工具和用於檢測il-13的產生或il-10和il-13的產生的工具。

本發明的另一個目標是分離的和/或富集的產生il-13的tr1-樣細胞群體，優選分離的和/或富集的產生il-13的人tr1細胞群體，或者產生il-13的tr1-樣克隆，優選產生il-13的人tr1克隆，用於預防或者治療免疫反應、移植物抗宿主疾病和器官排斥、過敏疾病、炎症性疾病或者自身免疫病。

本發明的另一目標是去除細胞群體中產生il-13的tr1-樣細胞的方法，包括：

‐如上所述鑑定產生il-13的tr1-樣細胞，

‐去除所述細胞，

由此得到產生il-13的tr1-樣細胞被去除的細胞群體，其中產生il-13的tr1-樣細胞的百分數是去除前產生il-13的tr1-樣細胞百分數的0.5倍。

在本發明的一個實施方案中，本發明的方法用於去除細胞群體中的產生il-13的人tr1細胞。

本發明的另一個目標是根據上述方法得到的去除產生il-13的tr1-樣細胞的細胞群體。在本發明的一個實施方案中，被去除處理的細胞群體是產生il-13的人tr1細胞被去除了。

本發明的另一個目標是去除產生il-13的tr1-樣細胞的細胞群體用於增強需要其的受試者中的免疫反應。在本發明的一個實施方案中，用於增強需要其的受試者中免疫反應的被去除處理的細胞群體是產生il-13的人tr1細胞被去除了。

附圖說明

圖1：t細胞增殖活性被il-13的體外抑制。重組人il-13(12.5ng/ml)加入到用抗cd3和抗cd28單克隆抗體活化的人pbmc培養物中。在培養3天後使用wst-1標記的活細胞評價細胞的增殖。

圖2：t細胞增殖活性被產生il-13的tr1-樣細胞的體外抑制。圖a顯示用抗cd3+抗cd28單克隆抗體處理後48小時過程中的產生il-13的調節細胞的體外細胞因子分泌模式。圖b顯示il-13活化細胞上清對用抗cd3+抗cd28單克隆抗體在培養中刺激3天的人pbmc增殖的抑制性潛能。組c顯示加入抗il13封閉抗體能夠逆轉產生il-13的調節細胞上清的抑制作用。

圖3：產生il-13的人調節細胞的表型。人il-13調節細胞用螢光標記的cd25、cd127、cd62l或foxp3特異性單克隆抗體染色進行流式細胞術分析。細胞在靜息狀態下分析或者在使用il-2和cd3+cd28刺激劑活化7天後分析。

圖4：不同tr1克隆的il-13和il-10的產生。來自2個不同供體的人tr1克隆使用抗cd3+抗cd28單克隆抗體體外活化。48h後，通過elisa測量上清液中il-10、ifn-γ和il-13的產生。結果顯示，在所測試的兩個不同供體中，數個克隆能夠產生il-10和ifn-γ，但不產生il-13，而其它克隆能夠產生三種細胞因子。對於每一供體顯示兩個亞群中的一個克隆。

具體實施方式

本發明提供具有免疫抑制能力的，新的分離的產生il-13的tr1-樣細胞群體，以及用途。發明人發現，這些細胞是tr1-樣細胞，因為它們表達與tr1細胞相同的表面標誌物並且這些細胞能夠產生il-13和低水平的il-4。發明人發現，它們的免疫抑制能力部分地通過il-13介導。此外，這些tr1-樣細胞中的一些細胞還能夠產生il-10。因此，發明人認為能夠產生il-10和il-13的這些細胞是tr1細胞的亞群。

發明人驚奇地發現，該tr1細胞亞群具有增強的免疫抑制效應，這在細胞治療中具有極大的興趣。

不希望被理論所束縛，發明人提出所述增強的免疫抑制效應可能是因為il-10和il-13對靶細胞具有不同且互補的效應。例如，minty等(eurcytokinenetw.1997；8(2)：189-201)證明，il-13和il-10誘導活化單核細胞中不同的細胞因子分泌譜。

本發明的一個目標是能夠產生il-13的分離的tr1-樣細胞群體，優選在測試a的條件下能夠產生il-13的分離的tr1-樣細胞群體。優選地，分離的tr1-樣細胞群體是人細胞群體。

如本文所使用，術語「il-13」指白細胞介素13。

如本文所使用，術語「產生il-13」指在培養基中il-13的分泌量大於50pg/ml，優選大於100pg/ml，更優選大於200pg/ml，甚至更優選大於500pg/ml，甚至更優選大於大約1000，2000，4000，6000，8000，10000，12000，14000，16000，18000，或20000pg/ml或更高。以另一種方式表述，該術語指il-13的分泌量大於250pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞，優選大於500pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞和更優選大於1000pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞。如本文所使用，數值之前的術語「大約」指加或減所述數值的10％。

在本發明的一個實施方案中，本發明的tr1-樣細胞是tr1細胞，因為它們產生il-10，優選在測試a的條件下產生il-10。

如本文所使用，術語「il-10」指白細胞介素10。

在本發明的一個實施方案中，本發明的人tr1細胞產生高水平il-10。

如本文所使用，術語「產生il-10」指在培養基中il-10的分泌量為至少50pg/ml，優選至少100pg/ml，更優選至少200pg/ml，至少大約500pg/ml，有代表性地大於大約1000，2000，4000，6000，8000，10000，12000，14000，16000，18000，或20000pg/ml或更高。以另一種方式表述，該術語指il-10的分泌量大於250pg/106個產生il-13的tr1細胞，優選大於500pg/106個產生il-13的tr1細胞和更優選大於1000pg/106個產生il-13的tr1細胞。

在本發明的一個實施方案中，所述分離的tr1-樣細胞群體產生少量的il-4，優選在測試a的條件下產生少量的il-4。

如本文所使用，術語「il-4」指白細胞介素4。

如本文所使用，術語「少量的il-4」指小於500pg/ml，優選小於250pg/ml，更優選小於100pg/ml的量。以另一種方式，該術語指il-4的量小於2000pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞，優選小於1000pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞，更優選小於500pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞，甚至更優選小於250pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞，甚至更優選小於100pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞。

在本發明的一個實施方案中，所述分離的tr1-樣細胞群體產生中等水平的tgf-β，優選在測試a的條件下產生中等水平的tgf-β。

如本文所使用，術語「tgf-β」指轉化生長因子β。

如本文所使用，術語「中等水平tgf-β」指tgf-β的量至少大約100pg/ml，有代表性地大於大約200，300，400，600，800，或1000pg/ml或更高。

以另一種方式，該術語指tgf-β的量至少大約400pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞，有代表性地大於大約800，1200，1600，2400，3200，或4000pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞或更高。

在本發明的一個實施方案中，所述分離的tr1-樣細胞群體產生中等水平的ifn-γ，優選在測試a的條件下產生中等水平的ifn-γ。

如本文所使用，術語「ifn-γ」指幹擾素γ。

如本文所使用，術語「中等水平ifn-γ」指ifn-γ的量介於0.1pg/ml和至少400pg/ml之間，有代表性地大於大約600，800，1000，1200，1400，1600，1800，或2000pg/ml或更高。

以另一種方式，該術語指ifn-γ的量介於0.4pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞和至少1600pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞之間，有代表性地大於大約2400，3200，4000，4800，5600，6400，7200，或8000pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞或更高。

在本發明的一個實施方案中，所述分離的tr1-樣細胞群體產生少量的il-2，優選在測試a的條件下產生少量的il-2。

如本文所使用，術語「il-2」指白細胞介素2。

如本文所使用，術語「少量的il-2」指量小於大約500pg/ml，優選小於大約250，100，75，或50pg/ml，或更少。

以另一種方式，該術語指il-2的量小於大約2000pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞，優選小於大約1000，400，300，或200pg/106個產生il-13的tr1-樣細胞，或更少。

在本發明的一個實施方案中，所述分離的tr1-樣細胞群體是分離的產生il-13的人tr1群體，並且產生il-13，il-10，中等水平ifnγ和tgfβ和少量的il-4和/或il-2。根據該實施方案，分離的tr1-樣細胞群體是人tr1細胞亞群，因為發明人證明tr1細胞在測試a的條件下會產生或者不產生il-13(見實施例)。

用於評估細胞是否能夠產生il-13，il-10，產生中等水平ifnγ和tgfβ和產生少量的il-4和/或il-2的方法是本領域眾所周知的。

如本發明中所定義的測試a在下文被描述並且使得確定在測試a的條件下培養的細胞所產生的細胞因子。測試a相當於以一種或者多種tcr活化劑活化細胞。

在一個實施方案中，tcr活化劑是t淋巴細胞的多克隆活化劑，例如抗cd3+抗cd28抗體或白細胞介素-2，pma+離子黴素。

在另一個實施方案中，tcr活化劑是由抗原呈遞細胞呈遞的抗原。

例如，在添加有10％胎牛血清的rpmi或dmem培養基中的1×106個細胞在一種或更多種tcr活化劑存在下，在48h期間被活化。然後收集培養基並通過本領域眾所周知的方法測量細胞因子產生。

這些方法中的一個實例如下：細胞在抗cd3(10μg/ml)和抗cd28(1μg/ml)存在下在48h期間被活化並且在該點通過elisa或者通過facs測量細胞因子分泌。

在本發明的另一個實施方案中，所述分離的tr1-樣細胞在它們的表面上表達cd4和低水平cd127和低水平cd62l。

在一個實施方案中，所述分離的tr1細胞亞群在它們的表面上表達cd4和低水平cd127和低水平cd62l。

在一個實施方案中，所述分離的tr1-樣細胞是靜息的並且在它們的表面上不表達cd25。在一個實施方案中，所述分離的tr1細胞亞群是靜息的並且在它們的表面上不表達cd25。

在另一個實施方案中，所述分離的tr1-樣細胞是活化的並且在它們的表面上表達cd25。在另一個實施方案中，所述分離的tr1細胞亞群是活化的並且在它們的表面上表達cd25。

如本文所使用，「分離的」指細胞或者細胞群體從其自然環境(例如外周血)被移除並且是分離的、純化的或者分開的，並且至少大約75％，80％，85％和優選大約90％，95％，96％，97％，98％，99％不含與其天然存在的但是缺乏分離細胞所依賴的細胞表面標誌物的其它細胞。

如本文所使用，術語「細胞表面標誌物」指可以用於鑑別細胞群體的細胞表面上的蛋白質、糖或者脂。

如本文所使用，術語「表達」可互換性地指基因表達或者基因產物，包括編碼的多肽或者蛋白質。基因產物的表達可以通過例如免疫測定法使用與多肽結合的一種或多種抗體測定。備選地，基因的表達可以通過測量mrna水平，例如通過rt-pcr、rt-qpcr測量mrna水平測定。

術語「初始的」是本領域眾所周知的，指還沒有接觸任何特異抗原的免疫細胞或細胞群體。

術語「靜息的」是本領域眾所周知的並且指沒有增殖，沒有產生細胞因子和沒有在表面上表達常規免疫細胞活化分子例如cd25的免疫細胞或者細胞群體。

術語「活化的」是本領域眾所周知的並且指增殖和/或產生細胞因子並且在其表面上表達常規免疫細胞活化分子例如cd25的免疫細胞或者細胞群體。

尤其對於t淋巴細胞，從靜息狀態到活化狀態的過渡由t細胞與其特異抗原相遇或者由活化細胞因子或促分裂原的活化介導。

與cd127lo/-，cd62llo/-或cd25llo/-相關使用的術語「低」或「lo」或「lo/-」是本領域眾所周知的並且指目的細胞標誌物的表達水平，其中細胞標誌物的表達水平與作為整體分析的細胞群體中該細胞標誌物的表達水平相比較低。更加具體而言，術語「lo」指以比一種或者更多種其他不同細胞群體更低的水平表達細胞標誌物的不同細胞群體。

術語「高」或「hi」或「亮」是本領域眾所周知的並且指目的細胞標誌物的表達水平，其中細胞標誌物的表達水平與作為整體分析的細胞群體中該細胞標誌物的表達水平相比較高。

術語「+」和「-」是本領域眾所周知的並且指目的細胞標誌物的表達水平，其中對應於「+」的細胞標誌物的表達水平高或中等並且對應於「-」的細胞標誌物的表達水平低或者無。通常，染色強度前2％、3％、4％或5％的細胞被稱為「hi」，落入群體前50％的那些細胞歸類為「+」。螢光強度處於後50％的那些細胞被稱為「lo」細胞並且螢光強度處於後5％的細胞被稱為「-」細胞。

如本文所使用，術語「cd127」指細胞表面上存在的「白細胞介素-7受體」(il-7r)。il-7受體α鏈在文獻中有描述(例如goodwin等.(1990)cell60：941-951)。il-7r在文獻中也稱作cd127。cd127+指當用針對cd127的標記抗體處理時染色中等或者亮的細胞。cd127lo/-指當接觸標記的cd127抗體時染色弱/不清楚或者根本不染色的細胞類型。通常，基於染色強度上容易辨別的差別，根據它們的cd127表達水平區分細胞，這是本領域普通技術人員已知的。在一些實施方案中，基於對所有細胞觀察到的螢光強度分布，可以設定將細胞稱為cd127lo/-細胞的截斷值，其中螢光強度處於後50％、40％、30％或20％的那些細胞被稱為cd127lo/-細胞。cd127-細胞可以被指定為螢光強度處於後10％的細胞。在一些實施方案中，得到所有細胞的cd127染色的頻率分布並將群體曲線擬合至較高染色和較低染色群體，並且根據對各種群分布的統計學分析，將細胞歸為統計學最有可能屬於的群體中。在一些實施方案中，cd127lo/-細胞的染色強度比cd127+細胞弱2至3倍。

如本文所使用，術語「cd62l」指l-選擇蛋白，它是淋巴細胞遷移的關鍵粘附分子。cd62l+指當用針對cd62l的標記抗體處理時染色中等或者亮的細胞。cd62llo/-指當接觸標記的cd62l抗體時染色弱/不清楚或者根本不染色的細胞類型。通常，基於染色強度上容易辨別的差別，根據它們的cd62l表達水平區分細胞，這是本領域普通技術人員已知的。在一些實施方案中，基於對所有細胞觀察到的螢光強度分布，可以設定將細胞稱為cd62llo/-細胞的截斷值，其中螢光強度處於後50％、40％、30％或20％的那些細胞被稱為cd62llo/-細胞。cd62l-細胞可以被指定為螢光強度處於後10％的細胞。在一些實施方案中，獲得所有的細胞的cd62l染色的頻率分布並將群體曲線擬合至較高染色和較低染色群體，並且根據對各種群分布的統計學分析，將細胞歸為統計學最有可能屬於的群體中。在一些實施方案中，cd62llo/-細胞的染色強度比cd62l+細胞弱2至3倍。

如本文所使用，術語「cd4」指有代表性地存在於成熟輔助t細胞和未成熟的胸腺細胞上以及單核細胞和巨噬細胞上的細胞表面糖蛋白。在t細胞上，cd4是t細胞受體(tcr)的共受體並且召募酪氨酸激酶lck。cd4使用其d1-部分附著至mhcii類分子的β2結構域。cd4+指當接觸標記的抗cd4抗體時染色亮的細胞，並且cd4-指當接觸螢光標記的cd4抗體時染色亮度最小，不清楚或者根本不染色的細胞類型。通常，基於染色強度上容易辨別的差別，根據它們的cd4表達水平區分細胞，因為cd4染色明顯雙峰。在一些實施方案中，獲得所有細胞的cd4染色的頻率分布並將群體曲線擬合至較高染色和較低染色群體，並且根據對各種群分布的統計學分析，將細胞歸為統計學最有可能屬於的群體中。在一些實施方案中，cd4-細胞的染色強度比cd4+細胞弱2至3倍。

如本文所使用，術語「cd25」指白細胞介素-2受體α亞基，它是分子量55kd的單鏈糖蛋白。當t細胞在單核因子白細胞介素-1存在下被抗原或者促分裂原活化之後，快速合成並分泌白細胞介素2(il-2)。作為對此的反應，亞群t細胞表達il-2的高親和性受體。這些細胞增殖，擴增了能夠介導輔助、阻抑制因子和細胞毒性功能的t細胞群體。il-2受體並非唯一存在於t細胞上。cd25hi指當與標記的抗cd25抗體接觸時染色亮的細胞，cd25+指當與標記的抗cd25抗體接觸時染色亮度稍差的細胞，並且cd25lo/-指當接觸標記的cd25抗體時染色亮度最小、不清楚或者無染色的細胞類型。通常，基於染色強度差別，根據它們的cd25表達水平區分細胞，這是本領域普通技術人員已知的。在一些實施方案中，基於觀察到的所有細胞的螢光強度分布設置將細胞歸為cd25表達類別hi、+、lo、或–細胞的截斷值。通常，染色強度前2％、3％、4％或5％的細胞被歸為「hi」，落入群體前50％的那些細胞歸類於「+」。螢光強度處於後50％的那些細胞被稱為cd25lo細胞並且螢光強度處於後5％的細胞被稱為cd25-細胞。

因此所述的tr1-樣細胞可以通過它們的細胞表面標誌物和它們產生il-13的能力有效表徵。因此所述tr1細胞亞群可以通過它們的細胞表面標誌物和它們產生il-13和il-10的能力有效表徵。這些細胞表面標誌物可以由特異性結合細胞表面標誌物的試劑識別。例如，tr1細胞表面上的蛋白質、糖或脂可以通過特定蛋白質或糖特異性的抗體進行免疫識別(對於抗體對標誌物的用途參見harlow，usingantibodies：alaboratorymanual(coldspringharborpress，coldspringharbor，n.y.，1999；還參見實施例)。tr1-樣細胞表面上存在的和這些細胞表面上缺乏的標誌物組是tr1-樣細胞特徵性的。因此，可以通過使用細胞表面標誌物的正選擇和負選擇來選擇tr1-樣細胞。結合由tr1-樣細胞所表達細胞表面標誌物，即「陽性標誌物」的試劑可以用於tr1-樣細胞的正選擇(即，保留表達細胞表面標誌物的細胞)。相反，負選擇依賴於這樣的事實，即tr1-樣細胞不表達某些細胞表面標誌物。因此，「陰性標誌物」(即，tr1-樣細胞表面上不存在的標誌物)可用於通過去除與陰性標誌物特異性試劑結合的細胞而將群體中非tr1-樣細胞的那些細胞去除。

在一個實施方案中，基於所檢測到的細胞表面標誌物表達辨別細胞，通過比較細胞表面標誌物的表達與對照細胞群體的平均表達進行。例如，tr1-樣細胞上標誌物的表達可以與來自與tr1-樣細胞相同的樣品的其他細胞上相同標誌物的平均表達相比較。通過標誌物表達鑑別細胞的其他方法包括通過流式細胞術使用試劑組合選通細胞(參見givana，flowcytometry：firstprinciples，(wiley-liss，newyork，1992)；owensma&lokenmr.，flowcytometry：principlesforclinicallaboratorypractice，(wiley-liss，newyork，1995))。

「試劑組合」意思是指至少兩種與tr1-樣細胞表面上存在(陽性標誌物)或不存在(陰性標誌物)的細胞表面標誌物結合的試劑，或者結合陽性標誌物與陰性標誌物組合的至少兩種試劑。例如，使用tr1-樣細胞表面標誌物特異性抗體組合可從許多種樣品/組織中分離和/或富集tr1-樣細胞。

根據本發明，「抗x抗體」或者「x抗體」是能特異性結合x的抗體。例如，抗cd127抗體或cd127抗體能夠結合cd127。根據本發明使用的抗體包括，但不限於，重組抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人單克隆抗體、人源化或靈長源化單克隆抗體和抗體片段。許多淋巴細胞生物標誌物特異性的抗體可以商業上獲得。這些抗體包括抗cd127抗體、抗cd4抗體、抗cd62l抗體、抗cd25抗體、抗il-4抗體、抗il-10抗體和抗il-13抗體(r&d、bdbiosciences等)。「抗體」指包含來自免疫球蛋白基因的框架區的多肽或其特異性結合併識別抗原的片段。公認的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε，和μ恆定區基因，以及眾多的免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分為κ或λ。重鏈分為γ，μ，α，δ，或ε，反過來這定義了免疫球蛋白類別分別為igg，igm，iga，igd和ige。有代表性地，抗體的抗原結合區對於結合特異性和親和性而言是最關鍵的。示例性的免疫球蛋白(抗體)結構單位包括四聚體。每一四聚體由兩個相同的多肽鏈對組成，每一多肽鏈對具有一個「輕鏈」(大約25kd)和一個「重鏈」(大約50-70kd)。每一鏈的n-末端定義了主要負責抗原識別的大約100至110或者更多個胺基酸的可變區。術語輕鏈可變區(vl)和重鏈可變區(vh)分別指這些輕鏈和重鏈。抗體作為例如完整的免疫球蛋白存在或者作為通過用不同肽酶消化產生的許多良好表徵的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化鉸鏈區內二硫鍵以下的抗體產生f(ab)'2，它是fab的二聚體，fab自身為通過二硫鍵與vh-ch1結合的輕鏈。f(ab)'2可以在溫和條件下被還原以破壞鉸鏈區內的二硫鍵，由此將f(ab)'2二聚體轉變成fab'單體。fab'單體基本上是具有部分鉸鏈區的fab(參見fundamentalimmunology(paul編，第3版，1993))。雖然以消化完整抗體的方式定義了不同抗體片段，但是技術人員會意識到，此類片段可以通過化學方法或者通過使用重組dna方法從頭合成。因此，術語抗體，如本文所使用，還包括通過修飾整個抗體產生的抗體片段，或者使用重組dna方法學從頭合成的那些(例如單鏈fv)或者使用噬菌體展示文庫鑑定的那些(參見例如mccafferty等，nature348：552-554(1990))。在一些實施方案中，可以使用靶標的高親和性配體代替抗體。短語「特異性(或者選擇性)結合」抗體或者與之「特異性(或者選擇性)免疫反應」當涉及到蛋白質或肽時是指常常在蛋白質和其它生物產品的異質群體中決定著蛋白質存在的結合反應。在此類條件下與抗體的特異性結合需要選擇其對特定蛋白質具有特異性的抗體。例如，可以對多克隆抗體進行選擇以得到僅與所選擇的抗原特異性免疫反應而不與其他蛋白質特異性免疫反應的那些多克隆抗體。這種選擇可以通過削減掉與其他分子交叉反應的抗體實現。

優選地，「標籤」或者「可檢測部分」與抗體共價或非共價連接。標籤可以通過分光鏡、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其他物理手段檢測到。特別有用的標籤是螢光染料。將標籤與抗體相連的方法是本領域普通技術人員眾所周知。特別優選的標籤是通過連接體連接至抗體的那些，所述的連接體可以容易地切割或分離或者在生理條件下與預定酶接觸而經受水解。抗體還可以與磁性微粒，例如順磁微珠綴合(miltenyibiotec，德國)。被磁性標記抗體結合的活化t細胞可以使用技術包括，但不限於，磁性細胞分選分離。適宜標記的cd127抗體、cd62l抗體、cd4抗體和cd25抗體，以及許多其它分化簇的適宜標記抗體可以商業性獲得並且是本領域普通技術人員已知的。抗體可以在與樣品接觸之前或之後或者在與cd接觸之前或之後被標記。cd抗體可以通過與結合cd抗體的標記抗體接觸而被標記。如本文所使用，術語「cd」或者「分化簇」或「共同決定簇」指被抗體識別的細胞表面分子。

在本發明的一個實施方案中，產生il-13的tr1-樣細胞群體是靜息的並且細胞表達低水平foxp3。在一個實施方案中，產生il-13和il-10的tr1細胞亞群是靜息的並且細胞表達低水平foxp3。

在本發明的另一個實施方案中，產生il-13的tr1-樣細胞群體是活化的並且細胞表達中等水平的foxp3。在一個實施方案中，產生il-13和il-10的tr1細胞亞群是活化的並且細胞表達中等水平的foxp3。

如本文所使用，術語「foxp3」指據認為擔任轉錄因子的核蛋白foxp3(hori等，2003；yasayko，j.e.等，nat.genet.27：68-73(2001)；fontenot，j.d.等，nat.immunol.4：330-336(2003)；khattri，r.等，nat.immunol.4：337-342(2003))。由於foxp3定位在細胞內，foxp3的表達可以通過使用標記抗foxp3抗體(ebioscienceinc或bdbiosciences)的細胞內流式細胞術評價。

本發明的另一個目標是組合物，所述組合物包含分離的產生il-13的tr1-樣細胞，基本上由分離的產生il-13的tr1-樣細胞組成，或者由分離的產生il-13的tr1-樣細胞組成。

本發明的另一個目標是組合物，所述組合物包含分離的產生il-13和il-10的tr1細胞亞群，基本上由分離的產生il-13和il-10的tr1細胞亞群組成，或者由分離的產生il-13和il-10的tr1細胞亞群組成。

在本發明的一個實施方案中，tr1細胞亞群或者tr1-樣細胞是抗原特異性的或者是多重抗原特異性的。

tr1細胞亞群或者tr1-樣細胞特異性抗原實例包括，但不限於，自身抗原；來自普通人飲食的食物抗原；炎症性抗原例如多發性硬化相關抗原或者關節相關抗原；和變應原。

術語「來自普通人飲食的食物抗原」指來自人普通糧食的免疫原性肽，例如下列非限制性列表中的食物抗原：牛抗原例如載脂蛋白、ca-結合s100、α-乳清蛋白、乳球蛋白例如β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白。食物抗原也可以是大西洋鮭魚抗原例如細小清蛋白、雞抗原例如類卵粘蛋白、卵清蛋白、ag22、伴清蛋白、溶菌酶或雞血清白蛋白、花生、蝦抗原例如原肌球蛋白、小麥抗原例如凝集素或麥醇溶蛋白、芹菜抗原例如芹菜肌動蛋白抑制蛋白、胡蘿蔔抗原例如胡蘿蔔肌動蛋白抑制蛋白、蘋果抗原例如索馬甜、蘋果脂轉移蛋白、蘋果肌動蛋白抑制蛋白、梨抗原例如梨肌動蛋白抑制蛋白、異黃酮還原酶、鱷梨抗原例如內切殼多糖酶、杏抗原例如杏脂轉移蛋白、桃抗原例如桃脂轉移蛋白或桃肌動蛋白抑制蛋白、大豆抗原例如hps、大豆肌動蛋白抑制蛋白或(sam22)pr-i0prot。

術語「自身抗原」指來源於所述個體蛋白質的免疫原性肽。它可以是例如下列非限制性列表中的自身抗原：乙醯膽鹼受體、肌動蛋白、腺嘌呤核苷酸易位蛋白、腎上腺素能受體、芳香族l-胺基酸脫羧酶、去唾液酸糖蛋白受體、殺菌/通透性增加蛋白(bpi)、鈣敏感受體、膽固醇側鏈剪切酶，膠原iv型-鏈、細胞色素p4502d6、結蛋白、橋粒芯糖蛋白-1、橋粒芯糖蛋白-3、f-肌動蛋白、gm-神經節苷脂、穀氨酸脫羧酶、穀氨酸受體、h/katp酶、17--羥化酶、21-羥化酶、ia-2(icas12)、胰島素、胰島素受體、內因子類型1、白細胞功能抗原1、髓鞘相關糖蛋白、髓磷脂鹼蛋白、髓磷脂少突膠質細胞蛋白、肌球蛋白、p80-環形體蛋白、丙酮酸脫氫酶複合體e2(pdc-e2)、鈉碘轉運體、sox-10、甲狀腺和眼肌肉共享蛋白質、甲狀腺球蛋白、甲狀腺過氧化物酶、促甲狀腺素受體、組織轉穀氨醯胺酶、轉錄輔激活因子p75、色氨酸羥化酶、酪氨酸酶、酪氨酸羥化酶、acth、氨醯基-trna-組氨醯合成酶、心磷脂、碳酸酐酶ii、著絲粒相關蛋白質、dna依賴的核小體刺激的atp酶、纖維蛋白、纖連蛋白、葡萄糖6磷酸異構酶、β2-糖蛋白i、高爾基體蛋白(95，97，160，180)、熱休克蛋白、半橋粒蛋白180、組蛋白h2a，h2b、角蛋白、ige受體、ku-dna蛋白激酶、ku-核蛋白、la磷蛋白、髓過氧化物酶、蛋白酶3、rna聚合酶i-iii、信號識別蛋白、拓撲異構酶i、微管蛋白、vimenscin、髓鞘相關少突膠質細胞鹼蛋白(mobp)、蛋白脂質蛋白質、少突膠質細胞特異性蛋白質(osp/claudinl1)、環核苷酸3'磷酸二酯酶(cnp酶)、bp抗原1(bpag1-e)、轉醛醇酶(tal)、人線粒體自身抗原pdc-e2(novo1和2)、ogdc-e2(novo3)和bcoadc-e2(novo4)、大皰性類天皰瘡(bp)180、層粘連蛋白5(ln5)、dead-盒蛋白質48(ddx48)或者胰島瘤相關抗原-2。

術語「多發性硬化相關抗原」指髓磷脂鹼蛋白(mbp)、髓鞘相關糖蛋白(mag)、髓磷脂少突膠質細胞蛋白(mog)、蛋白脂質蛋白質(plp)、少突膠質細胞髓磷脂寡聚蛋白(omgp)、髓鞘相關少突膠質細胞鹼性蛋白(mobp)、少突膠質細胞特異性蛋白(osp/claudinl1)、熱休克蛋白、少突膠質細胞特異性蛋白(osp)、nogoa、糖蛋白po、周圍髓磷脂蛋白22(pmp22)、2』3'-環核苷酸3"-磷酸二酯酶(cnp酶)、其片段、變異體和混合物。

術語「關節相關抗原」指瓜氨酸取代的環狀和線性聚絲蛋白肽、膠原ii型肽、人軟骨糖蛋白39(hcgp39)肽、hsp、異質性胞核核糖核蛋白(hnrnp)a2肽、hnrnpbl、hnrnpd、ro60/52、hsp60，65，70和90、bip、角蛋白、波形蛋白、血纖蛋白原、膠原類型i，ii，iii，iv和v肽、膜聯蛋白v、葡萄糖6磷酸異構酶(gpi)、乙醯基-鈣蛋白酶抑制蛋白、丙酮酸脫氫酶(pdh)、醛縮酶、拓撲異構酶i、snrnp、parp、scl-70、scl-100、磷脂抗原包括陰離子的心磷脂和磷脂醯絲氨酸、電中性的磷脂醯乙醇胺和磷脂醯膽鹼、基質金屬蛋白酶、肌原纖蛋白、聚集蛋白聚糖。

術語「變應原」指吸入變應原、攝入變應原或接觸變應原。變應原的實例包括，但不限於，來源於花粉(cup，jun)、房屋塵蟎(der，gly，tyr，lep)、狗、貓和齧齒動物(can，fel，mus，rat)的吸入變應原。接觸變應原的實例包括，但不限於，重金屬(例如鎳、鉻、金)、乳膠、半抗原例如氟烷、肼苯噠嗪。

在本發明的一個實施方案中，tr1細胞亞群或者tr1-樣細胞群體特異性的抗原是hsp，優選hsp60。

本發明的另一個目標是用於鑑定/分離/定量產生il-13的tr1-樣細胞群體的方法，包括：

‐檢測細胞群體上cd127和cd62l之一和cd4在細胞表面上的表達，

‐檢測il-13的產生，例如在測試a的條件下檢測il-13的產生，

其中表達cd4(即為cd4+)和低水平cd127和/或低水平cd62l(即為cd127lo/-和cd62llo/-)並且產生il-13的細胞是產生il-13的tr1-樣細胞，和

‐鑑定/分離/定量所述細胞。

本發明的另一個目標是用於鑑定/分離/定量產生il-13和il-10的tr1細胞亞群的方法，包括：

‐檢測細胞群體上cd127和cd62l之一和cd4在細胞表面上的表達，

‐檢測il-13和il-10的產生，例如在測試a的條件下檢測il-13和il-10的產生，

其中表達cd4(即為cd4+)和低水平cd127和/或低水平cd62l(即為cd127lo/-和cd62llo/-)並且產生il-13和il-10的細胞是所述tr1細胞亞群，和

‐鑑定/分離/定量所述細胞。

如上面所述，cd4、cd127和cd62l的細胞表面表達可以通過使用抗cd4、抗cd62l和抗cd127抗體檢測。

il-13和il-10產生的檢測可以通過本領域眾所周知的不同手段開展。

例如，用於檢測il-13或il-10產生的第一種方法依賴於使用標記的抗il-13或抗il-10抗體，用於對先前透化的t細胞進行細胞內染色，通過facs讀取染色。

用於檢測il-13或il-10產生的方法的另一個實例依賴於用標記的抗il13或抗il-10抗體開展的elisa測定。

最後，用於檢測il-13產生的方法的另一個實例依賴於使用miltenyibiotech商業化的il-13分泌測定試劑盒(130-093-480)或其等效物。該方法是特別受關注的，因為它允許檢測並富集產生il-13的細胞，而無需對它們進行透化。用於檢測il-10產生的方法的另一個實例依賴於使用miltenyibiotech商品化的il-10分泌測定試劑盒(130-090-434)或其等效物。該方法是特別受關注的，因為它允許檢測並富集產生il-10的細胞，而無需對它們進行透化。

包含t細胞的任何細胞來源可以用於分離產生il-13的tr1-樣細胞或者產生il-13和il-10的tr1細胞亞群。有用的來源包括，但不限於，外周血、滑液、脾臟、胸腺、淋巴結、骨髓、派爾斑和扁桃體。

用於分開、分離或者選擇細胞的方法包括，但不限於使用抗體包被的磁珠的磁選(schwartz，等，美國專利號5,759,793)和親和性層析或者使用連接至固體基質(例如板)的抗體的「淘選」。提供精確分離的更多的技術包括螢光激活細胞分選儀(facs)，它可以具有不同的複雜程度，例如具有多顏色通道，低角和圓頭光散射檢測通道，或者阻抗通道。死細胞可以通過用與死細胞有關的染料(碘化丙啶，lds)選擇而去除。紅細胞可以通過例如衝洗、溶血或者ficoll-paque梯度去除。可以採用對所選擇細胞的活性沒有過分有害的任何技術。

抗體可以方便地與用於許多不同目的的標籤綴合：例如與磁珠綴合以方便分離tr1細胞；與以高親和性結合抗生物素蛋白或鏈親和素的生物素綴合；與可以與螢光激活細胞分選儀一起使用的螢光染料綴合；與半抗原綴合；等等。可以使用facs或者免疫磁性分選與流式細胞術的組合進行多顏色分析。多顏色分析對於基於例如以下的多種表面抗原的細胞分離而言是感興趣的：例如非-cd4+免疫細胞標誌物(cd8、cd14、cd16、cd19、cd36、cd56、cd123、tcrγ/δ和血型糖蛋白a)、cd4、cd25、cd127和cd62l。發現可在多顏色分析中使用的螢光染料包括，但不限於，藻膽蛋白，例如藻紅蛋白和別藻藍蛋白；螢光素，和德克薩斯紅。

磁性分選是用於在磁場梯度中選擇性將磁性材料保留在容器例如離心管或柱內的過程。tr1細胞可以通過特異性相互作用，包括免疫親和性相互作用而將磁性顆粒結合至細胞表面而被磁性標記。然後將適宜容器內的包含tr1細胞的懸液暴露於足夠強的磁場梯度下以將tr1細胞與懸液中的其它細胞分離。然後用適宜的流體洗滌容器以去除未標記的細胞，產生純化的tr1細胞懸液。

大多數的磁標記系統使用超順磁顆粒和與其表面共價結合的單克隆抗體或鏈親和素。在細胞分離應用中，這些顆粒可以用於正選擇，其中目的細胞被磁性標記並保留，或者負選擇，其中大多數不希望的細胞被磁性標記和保留。所使用的顆粒的直徑廣泛變化，從macs顆粒(miltenyibiotec)和stemsep(tm)膠體(stemcelltechnologies)的大約50-100nm，至easysep(r)(stemcelltechnologies)和imag顆粒(bdbiosciences)的150-450nm，最高為dynabeads(dynalbiotech)的4.2μm。用來分離所標記細胞的磁體技術影響所使用的顆粒類型。

存在兩個重要種類的磁性分選技術，為了方便和實用的原因它們均使用永久磁體而不是電磁體。第一類是基於柱的高梯度磁場分離技術，它使用小的弱的磁性顆粒標記目的靶標，並且在填充有可磁化基質的柱內分離這些靶標。當向柱應用磁場時，在接近於基質元件的表面產生非常高的梯度。對於分離用這些相對弱的磁性顆粒標記的靶標而言使用高梯度是必需的。第二類是基於管的技術，它使用更強的磁性顆粒標記目的靶標。然後將這些目的靶標通過管外磁體產生的磁場梯度在離心類型的管內分離。該方法的優勢在於它不依賴於可磁化基質產生梯度；並且因此不需要昂貴的一次性柱或者以不便的清洗和淨化過程處理的可重複使用的柱。

一旦放置在磁體內，靶細胞向最高磁場強度的區域或多個區域遷移並且保留在磁場內，而未標記的細胞被排出掉。然後在從磁場中移出後收集靶細胞並使用。在需要負選擇的情況下，未標記的細胞被保留並且用於多種用途。

facs允許基於當它們經過雷射柱時的光散射特性分離細胞亞群。向前光散射(fals)與細胞大小有關，並且右角光散射，也稱作側散射特性(ssc)與細胞密度、細胞內容物和核質比，即細胞複雜性有關。由於細胞可以用螢光綴合的抗體標記，所以它們可以通過抗體(螢光)強度進一步表徵。

在特別的實施方案中，本發明的產生il-13的tr1-樣細胞使用免疫磁性層析分離。例如，抗cd4抗體連接至磁性珠。這些抗體標記的磁性珠用作親和純化的基礎。t細胞的抗體標記部分應用至磁性親和柱上。非粘附的細胞被排出並且通過除去磁場將粘附的細胞從磁性柱洗脫。在另一個實施方案中，首先將細胞用抗體(例如抗cd4)標記，然後用攜帶磁性珠或球的次級抗體標記。

在另一個實施方案中，與tr1細胞具有免疫反應性的次級抗體可以用於富集產生il-13的tr1-樣細胞的群體。次級抗體的使用是本領域普遍已知的。有代表性地，次級抗體是與第一個抗體的恆定區具有免疫反應的抗體。優選的次級抗體包括抗兔、抗小鼠、抗大鼠、抗山羊、抗馬免疫球蛋白並且可以商業性獲得。商業上可得到的試劑盒提供與標記試劑，例如但不限於磁性顆粒和螢光染料綴合的次級抗體。

本發明的另一個目標是用於使細胞群體富集產生il-13的tr1-樣細胞的方法，包括：

‐鑑定表達cd4和低水平cd127和/或cd62l並產生il-13的細胞，

‐選擇所述細胞，

由此得到富集產生il-13的tr1-樣細胞的細胞群體。

本發明的另一個目標是用於使細胞群體富集產生il-13和il-10的tr1細胞亞群的方法，包括：

‐鑑定表達cd4和低水平cd127和/或cd62l並產生il-13和il-10的細胞，

‐選擇所述細胞，

由此得到富集產生il-13和il-10的tr1細胞亞群的細胞群體。

在本發明的另一個實施方案中，使群體富集產生il-13的tr1-樣細胞的方法可以包括：

‐將細胞群體與結合非-cd4+細胞的標誌物的至少一種試劑接觸，由此去除非-cd4+細胞，

‐如上所述鑑定產生il-13的tr1-樣細胞並選擇它們。

在本發明的另一個實施方案中，用於使群體富集產生il-13和il-10的tr1細胞亞群的方法可以包括：

‐將細胞群體與結合非-cd4+細胞的標誌物的至少一種試劑接觸，由此去除非-cd4+細胞，

‐如上所述鑑定產生il-13和il-10的tr1細胞亞群並選擇它們。

結合非-cd4+細胞的標誌物的實例包括，但不限於，cd8、cd14、cd16、cd19、cd36、cd56、cd123和血型糖蛋白a。

結合所述標誌物的優選試劑是抗體。在再一實施方案中，抗體與螢光染料或磁性顆粒綴合。在另一實施方案中，通過流式細胞術、螢光激活細胞分選、磁性選擇、親和層析或者淘選或其組合開展細胞選擇。

本發明的另一個目標是根據所述方法得到的產生il-13的tr1-樣細胞的富集群體。本發明的另一個目標是根據所述方法得到的產生il-13和il-10的tr1細胞亞群的富集群體。

本發明的另一個目標是組合物，所述組合物包含富集的產生il-13的tr1-樣細胞群體，基本上由富集的產生il-13的tr1-樣細胞群體組成，或者由富集的產生il-13的tr1-樣細胞群體組成。

本發明的另一個目標是組合物，所述組合物包含富集的產生il-13和il-10的tr1細胞亞群，基本上由富集的產生il-13和il-10的tr1細胞亞群組成，或者由富集的產生il-13和il-10的tr1細胞亞群組成。

如本文所使用，產生il-13的tr1-樣細胞富集的組合物/群體是這樣的組合物/群體，即其中產生il-13的tr1-樣細胞的百分數高於在最初得到細胞的群體中產生il-13的tr1-樣細胞的百分數。儘管有可能，但是富集的產生il-13的tr1-樣細胞的群體不需要包含同質的產生il-13的tr1-樣細胞的群體。在特別的實施方案中，所述組合物細胞的至少大約50％，大約55％，大約60％，大約65％，大約70％，大約75％，大約80％，大約85％，大約90％，大約95％，大約98％，或大約99％是產生il-13的tr1-樣細胞。在另一個實施方案中，富集的組合物/群體中產生il-13的tr1-樣細胞的百分數是富集前產生il-13的tr1-樣細胞百分數的至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。

如本文所使用，產生il-13和il-10的tr1細胞富集的組合物/群體是這樣的組合物/群體，即其中產生il-13和il-10的tr1細胞的百分數高於在最初得到細胞的群體中產生il-13和il-10的tr1細胞的百分數。儘管有可能，但是富集的產生il-13和il-10的tr1細胞的群體不需要包含同質的產生il-13和il-10的tr1細胞的群體。在特別的實施方案中，所述組合物細胞的至少大約50％，大約55％，大約60％，大約65％，大約70％，大約75％，大約80％，大約85％，大約90％，大約95％，大約98％，或大約99％是產生il-13和il-10的tr1細胞。在另一個實施方案中，富集的組合物/群體中產生il-13和il-10的tr1細胞的百分數是富集前產生il-13和il-10的tr1細胞百分數的至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。

包含t細胞的任何細胞來源可以用於分離/富集產生il-13的tr1-樣細胞或者產生il-13和il-10的tr1細胞。有用的來源包括，但不限於，外周血、滑液、脾臟、胸腺、淋巴結、骨髓、派爾斑和扁桃體。

基於與富集過程每一步驟有關的富集水平，富集方法是不同的。產生il-13的tr1-樣細胞或產生il-13和il-10的tr1細胞的富集水平和純度百分數會依賴於許多因素，包括，但不限於，供體、細胞/組織來源和供體的疾病狀態。

本發明的另一個目標是產生il-13的tr1-樣克隆。

本發明的另一個目標是產生il-13和il-10的tr1克隆。

根據本發明，產生il-13的tr1-樣細胞根據上述方法分離，然後通過本領域眾所周知的方法將產生il-13的tr1-樣細胞進行克隆。

根據本發明，產生il-13和il-10的tr1細胞根據上述方法分離，然後通過本領域眾所周知的方法將產生il-13和il-10的tr1細胞進行克隆。

在另一個實施方案中，本領域的技術人員可以分離表達cd4和低水平cd127和/或cd62l的細胞，克隆所述細胞，然後當活化時分離產生il-13或者il-10和il-13的克隆。

本發明的另一個目標是組合物，所述組合物包含產生il-13的tr1-樣克隆或產生il-13和il-10的tr1克隆，基本上由產生il-13的tr1-樣克隆或產生il-13和il-10的tr1克隆組成，或者由產生il-13的tr1-樣克隆或產生il-13和il-10的tr1克隆組成。

在本發明的一個實施方案中，產生il-13的tr1-樣克隆或產生il-13和il-10的tr1克隆產生低水平的il-4。

在本發明的一個實施方案中，產生il-13的tr1-樣克隆或產生il-13和il-10的tr1克隆產生低水平的il-2。

在本發明的一個實施方案中，產生il-13的tr1-樣克隆或產生il-13和il-10的tr1克隆產生中等水平的ifnγ。

在本發明的一個實施方案中，產生il-13的tr1-樣克隆或產生il-13和il-10的tr1克隆產生中等水平的tgfβ。

通過本發明方法分離的產生il-13的tr1-樣細胞或者產生il-13和il-10的tr1細胞亞群可以通過wo2006/108882中所述的體外方法進一步擴增。所述方法包括：

a)在低於35℃的溫度t1下，在培養基mf中培養飼養細胞例如昆蟲飼養細胞，所述溫度t1允許飼養細胞增殖並且所述飼養細胞表達與下列細胞表面蛋白相互作用的因子：

-cd3/tcr複合體，

-cd28蛋白，

-il-2受體，

-cd2蛋白，

-il-4受體，

b)將在步驟a)中得到的清除或者未清除它們的培養基mf的飼養細胞與培養基mp中包含的產生il-13的tr1-樣細胞群體或產生il-13和il-10的tr1細胞亞群接觸，其中所述培養基mp最初不包含步驟a)中所述的因子，以得到包含tr1細胞群體，飼養細胞和培養基mp的混合物，

c)在溫度t2下培養在步驟b)中得到的混合物，溫度t2至少為35℃，選擇所述的溫度使得tr1細胞群體增殖而飼養細胞不增殖，

d)將如此擴增的tr1細胞群體回收。

與上面提到的細胞表面蛋白相互作用的因子實例包括：

-抗cd3抗體，優選修飾的抗cd3抗體，其中cd3重鏈的抗cd3胞質內結構域被替換成跨膜結構域，

-cd80或cd86蛋白，

-由飼養細胞分泌的il-2，

-cd58蛋白，

-選自il-4和il-13的白細胞介素。

mp培養基用來培養t細胞並且可以是無血清培養基。mp培養基的非限定性實例是商業上可以得到的無血清培養基例如來自biowhittaker的xvivo15、來自invitrogen的aimv培養基、dmem、rpmi等。

mf培養基用來培養飼養細胞並且可以是無血清培養基。mf培養基的非限定性實例是商業上可以得到的無血清培養基例如來自biowhittaker的schneider無血清培養基、來自invitrogen的作為sfm的mdgibco無血清昆蟲細胞培養基或者來自krackelerscientificinc的insectagro。

在本發明的實施方案中，如此得到的tr1細胞可以使用常規用於克隆t細胞的方法進行克隆。

在本發明的實施方案中，如此得到的tr1細胞或者tr1細胞克隆可以冷凍以儲存。

本發明的另一個目標是組合物，所述的組合物包含富集並擴增的產生il-13的tr1-樣細胞群體或者產生il-13和il-10的tr1細胞亞群，基本上由富集並擴增的產生il-13的tr1-樣細胞群體或者產生il-13和il-10的tr1細胞亞群組成，或者由富集並擴增的產生il-13的tr1-樣細胞群體或者產生il-13和il-10的tr1細胞亞群組成。

本發明的另一個目標是用於去除細胞群體中產生il-13的tr1-樣細胞或產生il-13和il-10的tr1細胞的方法，包括：

‐鑑定表達cd4和低水平cd127和/或cd62l並產生il-13或il-10和il-13的細胞，

‐去除所述細胞，

‐由此得到產生il-13的tr1-樣細胞或者產生il-13和il-10的tr1細胞被去除的細胞群體。

本發明的另一個目標是組合物，所述組合物包含產生il-13的tr1-樣細胞被去除的群體或者產生il-13和il-10的tr1細胞被去除的群體，基本上由產生il-13的tr1-樣細胞被去除的群體或者產生il-13和il-10的tr1細胞被去除的群體組成，或者由產生il-13的tr1-樣細胞被去除的群體或者產生il-13和il-10的tr1細胞被去除的群體組成。

產生il-13的tr1-樣細胞被去除的組合物/群體或者產生il-13和il-10的tr1細胞被去除的組合物/群體是這樣的組合物/群體，即其中產生il-13的tr1-樣細胞或者產生il-13和il-10的tr1細胞的百分數低於在最初得到細胞的群體中產生il-13的tr1-樣細胞或者產生il-13和il-10的tr1細胞的百分數。

本發明的另一個目標是根據上述方法得到的產生il-13的tr1-樣細胞被去除的細胞群體。本發明的另一個目標是根據上述方法得到的產生il-13和il-10的tr1細胞被去除的細胞群體。

如上面所解釋，用於分離細胞的方法包括，但不限於，使用抗體包被磁珠的磁性分選、親和層析或者使用與固體基質(例如板)相連的抗體的「淘選」和螢光激活細胞分選儀(facs)。tr1細胞被去除，而不是被選擇。

在一個實施方案中，產生il-13的tr1-樣細胞或者產生il-13和il-10的tr1細胞在經去除的組合物/群體中的百分數是去除前產生il-13的tr1-樣細胞或者產生il-13和il-10的tr1細胞百分數的至少0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.25倍、0.2倍、0.15倍、0.1倍。

本發明的另一個目標是用於鑑定或分離產生il-13的tr1-樣細胞群體，或者用於使細胞群體富集或去除產生il-13的tr1-樣細胞的試劑盒，所述試劑盒包含用於檢測cd4、cd25、cd127和cd62l細胞表面表達的試劑和用於檢測il-13產生的工具。

本發明的另一個目標是用於鑑定或分離產生il-13和il-10的tr1細胞群體，或者用於使細胞群體富集或者去除產生il-13和il-10的tr1細胞的試劑盒，所述試劑盒包含用於檢測cd4、cd25、cd127和cd62l細胞表面表達的試劑和用於檢測il-13和il-10產生的工具。

優選地，所述試劑是抗體。更優選地，這些抗體與螢光染料或者磁性顆粒綴合。

在另一個實施方案中，所述試劑盒還包含用於檢測foxp3表達的試劑。優選地，所述試劑是抗體。更優選地，所述抗體與螢光染料綴合。

本發明的另一目標是抑制需要其的受試者中免疫反應的方法，包括向受試者施用有效量的根據本發明分離的或者富集的產生il-13的tr1-樣細胞。

本發明的另一目標是抑制需要其的受試者中免疫反應的方法，包括向受試者施用有效量的根據本發明分離的或者富集的產生il-13和il-10的tr1細胞。

在一個實施方案中，受試者已經經歷或者正在經歷移植，例如骨髓移植或者器官移植。

在另一個實施方案中，受試者具有過敏症。

本發明的另一個目標是用於預防或者治療需要其的受試者中炎症性疾病的方法，包括向受試者施用有效量的根據本發明分離或者富集的產生il-13的tr1-樣細胞或者分離或富集的產生il-13和il-10的tr1細胞。

本發明的另一個目標是用於預防或者治療需要其的受試者中自身免疫病的方法，包括向受試者施用有效量的根據本發明分離或者富集的產生il-13的tr1-樣細胞或者分離或富集的產生il-13和il-10的tr1細胞。

在本發明的一個實施方案中，細胞群體可以從隨後向其引入產生il-13的tr1-樣細胞富集的組合物或者產生il-13和il-10的tr1細胞富集的組合物的受試者得到。

在本發明的一個實施方案中，受試者可以是希望抑制其免疫反應的受試者。

在一個實施方案中，受試者是患有炎症性病或疾病/病症的人，例如任何疾病/病症，包括但不限於，非自身免疫炎症性腸病、術後粘連、冠狀動脈疾病、肝臟纖維化、急性呼吸窘迫症候群、急性炎症性胰腺炎、內鏡逆行胰膽管造影術引起的胰腺炎、燒傷、冠狀動脈、腦動脈和外周動脈粥樣化形成、闌尾炎、膽囊炎、憩室炎、內臟纖維變性病症、創傷癒合、皮膚瘢痕病症(疤痕疙瘩、化膿性汗腺炎)、肉芽腫病症(結節病、原發性膽汁性肝硬變)、哮喘、壞疽性膿皮病、斯威特症候群、貝赫切特病、原發性硬化性膽管炎、和膿腫。

在另一個實施方案中，受試者是患有自身免疫病或者疾病/病症的人，包括但不限於，紅斑狼瘡、尋常天皰瘡、甲狀腺炎、血小板減少性紫癜、格雷夫斯病、糖尿病、青少年糖尿病、自發的自身免疫性糖尿病、重症肌無力、艾迪生病、關節炎病症例如風溼性關節炎、強直性脊柱炎、幼年特發性關節炎、銀屑病關節炎；多發性硬化、銀屑病、葡萄膜炎、自身免疫性溶血性貧血、硬皮病、腸炎症性病症例如自身免疫炎症性腸病、克隆病、大腸炎、食物過敏有關的腸炎症；斯耶格倫病、橋本病、重症肌無力、自身免疫性多內分泌腺病症候群、i型糖尿病(tidm)、自身免疫性胃炎、自身免疫性葡萄膜視網膜炎、多肌炎、和甲狀腺炎、以及以人狼瘡為代表的全身性自身免疫病。「自身抗原」如本文所使用指哺乳動物天然的並且在所述哺乳動物疾病中為免疫原性的抗原或表位。

本發明的細胞還可以用於預防或者治療移植反應，例如移植物抗宿主疾病(gvhd)和移植排斥。

使用本領域眾所周知的方法例如繼承性細胞轉移開展產生il-13的tr1-樣細胞或者產生il-13和il-10的tr1細胞向患者內的引入。簡言之，從靶供體提取混合的細胞群體。取決於應用，在疾病緩解階段或者在活動性疾病過程中提取細胞。有代表性地，這通過收集外周血和通過白細胞去除術收穫白血細胞實現。例如，已經顯示大體積白細胞去除術(lvl)使血液白細胞得率最大。收集的淋巴細胞可以使用基於tr1特異性細胞標誌物，例如本文所述的那些細胞標誌物的細胞分離技術分離，然後輸入到患者，有代表性地是細胞供體中(gvhd除外，在gvhd中供體和受體是不同的)，用於過繼性免疫抑制。大約103至1011，優選104至1010，優選105至109，優選106至109，更優選106至108個tr1細胞注射入到患者內。

如本文所使用，術語「有效量」意思是指治療物質或者組合物的量足以減輕(以任何程度)或者改善病症或者其一個或更多個症狀的嚴重性/持續時間，防止病症進展，引起病症退化，預防一個或多個病症相關症狀復發、發生、發作或進展，檢測病症，或者增強或改善另一治療(例如預防劑或治療劑)的一種或多種預防性或治療性效果。有效量將隨著受試者的年齡、性別、種族、種類、一般情況等、所治療病症嚴重性、所使用的特定試劑、治療持續時間、任何並行治療的性質、所使用的可藥用載體、和本領域技術人員知識和經驗範圍內的類似因素而變。根據情況，任何個體案例中的「有效量」可以由本領域普通技術人員參考有關教科書和文獻和/或通過使用常規實驗確定，(例如參見gennaro等，編者，remington'sthescienceandpracticeofpharmacy，第20版，(2000)，lippincottwilliamsandwilkins，baltimoremd；braunwald等，編者，harrison'sprinciplesofinternalmedicine，第15版，(2001)，mcgrawhill，ny；berkow等，編者，themerckmanualofdiagnosisandtherapy，(1992)，merckresearchlaboratories，rahwaynj)。

術語「預防」、「預防著」和「預防的」在本文中指抑制病症的發生或發作或者防止受試者中因施用治療(例如預防劑或治療劑)或者施用治療組合(例如預防劑或治療劑的組合)導致的病症的一個或更多個症狀復發、發作或進展。「治療」或「治療著」意思是指達到至少改善宿主病症的有關症狀，其中改善以廣義使用，是指至少減少參數例如與正在治療病症相關的症狀的強度。照此，治療還包括這樣的情況，即其中病理病症或者與其有關的至少一些症狀完全被抑制，例如被阻止發生，或者被停止，例如被終止，以致於受試者不再遭受病症，或者至少病症特徵性的症狀。

如本文所使用，術語「受試者」指動物，優選哺乳動物並且最優選人。

本發明的另一個目標是用於增加所移植細胞群體在需要其的受試者內的免疫反應的方法，包括向所述受試者施用有效量的如上所述產生il-13的tr1-樣細胞被去除的細胞群體。

本發明的另一個目標是用於增加所移植細胞群體在需要其的受試者內的免疫反應的方法，包括向所述受試者施用有效量的如上所述產生il-13和il-10的tr1細胞被去除的細胞群體。

在一個實施方案中，所述方法用於治療經歷癌症治療的受試者。

在一個實施方案中，所移植的細胞群體是抗原特異性效應t細胞群體。優選地，所述t細胞群體是腫瘤抗原特異性的，抗原為例如黑素瘤的mart-1(melana)或者黑素瘤的mage1，2，3、甲狀腺髓樣癌、小細胞肺癌、結腸和/或支氣管鱗狀細胞癌等等。

在另一個實施方案，所述方法是用於治療傳染性疾病例如ebv、hiv、hcv、cmv感染。

已經證明去除調節t細胞會增強癌症患者內的疫苗介導的免疫(dannull等，2005，115(12)：3623-3633)。因此，在本發明的另一個實施方案中，建議將產生il-13的tr1-樣細胞或者產生il-13和il-10的tr1細胞的去除用於治療癌症或者傳染性疾病的細胞治療中，其中所述的產生il-13的tr1-樣細胞或者所述的產生il-13和il-10的tr1細胞對於治療是有害的。例如，在癌症治療中，在疫苗接種/免疫療法方案之前，暫時去除產生il-13的tr1-樣細胞或者產生il-13和il-10的tr1細胞是感興趣的，通過根據本發明的去除方法的裝置而在活體外方式對患者血液進行去除處理，並且立即將其回注到患者內，獲得所述的短暫去除。

實施例

實驗過程

產生il-13的tr1樣細胞分離和上清液產生

對於產生il-13的tr1-樣細胞的分離，外周血細胞通過ficoll密度離心分離並在特異性抗原存在情況下以2×106個細胞每ml培養，以使得抗原特異性tr1-樣細胞增殖。在培養7天後，在3周內通過有限稀釋方法克隆細胞。然後使用cd3/cd28刺激劑和細胞因子(il-2和il-4)擴增生長的克隆。通過流式細胞術評價表型來評價克隆的tr1-樣細胞身份，顯示組成型地伴有cd62l和cd127缺乏，以及僅在活化狀態下表達cd25和foxp3。通過用抗cd3+抗cd28包被磁珠(dynal)在2天過程中在x-vivo培養基中於37℃+5％co2情況下刺激細胞得到tr1-樣細胞上清液的產生。

流式細胞術研究

對於對人細胞的流式細胞術研究，使用下列抗體：pe-綴合的抗cd127(來自beckmancoulter的克隆r34.34)，來自bectondickinson的fitc-標記的抗cd4ab(克隆號rp4-t4)，pecy5-標記的抗cd62l(來自bectondickinson的克隆dreg56)和別藻藍蛋白-綴合的抗cd25(來自bectondickinson的克隆m-a251)。使用pe-綴合的抗foxp3ab(來自bd的克隆259d/c7)和胞質內染色試劑盒(bd)，根據廠商的說明書開展人foxp3的胞質內染色。

細胞因子測定

為了測定細胞因子產生譜(測試a的實例)，tr1-樣細胞克隆用抗cd3+抗cd28包被珠以2珠/細胞的濃度刺激，並且48小時後收集上清液。使用來自diaclone(ifn-γ，il-10和il-4)和來自e-bioscience(il-13)的商業可得的試劑盒開展elisa。實驗按照廠商的說明書開展。

抑制研究

對於抑制研究，外周血單核細胞在2天過程中用可溶性的抗cd3單克隆抗體(1μg/ml)在產生il-13的tr1-樣細胞上清液存在或缺乏下，抗il13(克隆31606，r&dsystems)或者重組人il-13(6ng/ml，r&dsystems)活化。使用來自roche的可以評價每個培養孔內的活細胞數量的wst1試劑盒測量所培養細胞的增殖。

結果

t細胞增殖活性被il-13體外抑制

首先，我們想證明重組人il-13能夠體外下調t細胞增殖活性。為此目的，將il-13加入到用抗cd3和抗cd28單克隆抗體活化的pbmc培養物中，並在培養3天後測量細胞增殖(圖1)。結果證明，il-13能夠體外抑制t細胞增殖，顯示該細胞因子具有免疫抑制性潛能。

t細胞增殖活性被產生il-13的tr1-樣細胞體外抑制

因此，我們想知道在使用il-13作為抑制細胞因子的相同類型的實驗設置中產生il-13的tr1-樣細胞是否能夠抑制旁觀t淋巴細胞活性。圖2a顯示被抗cd3和抗cd28單克隆抗體活化的il-13調節細胞的細胞因子分泌模式，其中il-13分泌高但沒有il-4分泌。圖2b顯示活化的產生il-13的調節細胞的上清液能夠抑制培養的旁觀t細胞的活化。重要的是，使用il-13封閉抗體可以抑制這種上清液介導的t細胞增殖抑制(圖2c)，顯示這些細胞因子代表由這些細胞分泌的主要的可溶性抑制因子。

產生il-13的人調節細胞的表型

最後，我們測試了il-13調節細胞的數種調節細胞標誌物的表達，顯示所述細胞不表達cd127、cd62l和foxp3分子。此外，在3種標誌物當中，活化後foxp3和cd25上調(圖3)。

能夠產生il-13和il-10的tr1細胞亞群

圖4顯示tr1細胞在測試a的條件下能夠分離成兩個群體：一個tr1細胞亞群能夠產生il-10但不產生il-13，而另一個tr1細胞亞群能夠產生il-10和il-13。