一種製備腺嘌呤核苷二磷酸和胞嘧啶核苷二磷酸的方法
2023-12-06 08:17:26
專利名稱:一種製備腺嘌呤核苷二磷酸和胞嘧啶核苷二磷酸的方法
技術領域:
本發明為一種經兩步製備腺嘌呤核苷二磷酸和胞嘧啶核苷二磷酸的方法。
腺嘌呤核苷二磷酸(簡稱ADP)和胞嘧啶核苷二磷酸(簡稱CDP)是製備聚肌胞藥物的基本原料。臨床證明,聚肌胞複合物是一種治療免疫性疾病、皰疹病毒疾病的廣譜抗毒藥物,能誘導幹擾素、腫瘤壞死因子、細胞激動素等。因此,能夠大量製備腺嘌呤核苷二磷酸和胞嘧啶核苷二磷酸,對醫藥衛生行業具有非常重要的意義,目前的一步發酵法,產率低。化學合成,成本高,且有汙染。
本發明的目的是提供一種用啤酒酵母經發酵,轉化產生ADP和CDP的方法。
本發明的生產ADP的方法是將啤酒酵母預處理後製成含磷和不含磷兩種酶液,將腺嘌呤核苷一磷酸(簡稱AMP)在含磷酶液的作用下轉化為腺嘌呤核苷三磷酸(簡稱ATP)並將其純化、濃縮乾燥;將不含磷的酶液與ATP按如下重量濃度配成水溶液不含磷酶液 70-90%ATP 10-30%在水溶液中按濃度(重量)加入0.2-0.7%的鎂鹽和5-20%的葡萄糖,在28-39℃、PH為6-7.5的條件下反應1-3.5小時,所得溶液經純化、濃縮乾燥即為ADP。
本發明生產CDP的方法基本同上,只要將原料中腺嘌呤核苷-磷酸改為胞嘧啶核苷-磷酸(簡稱CMP)其它條件不變,最後產物即為CDP。
本發明生產ADP和CDP的方法中所述的啤酒酵母預處理可以是將啤酒廠生產的經過培養七、八代的菌株或陶汰酵母用蒸餾水或無離子水洗2-3次,自然沉澱或離心10分鐘,得到的酵母泥在0℃-10℃下保存備用。
本發明生產ADP和CDP的方法中所述的含磷酶液可以這樣製備按重量濃度分別加入葡萄糖10%,磷酸3%,鎂鹽0.5%,酵母30%配成水溶液,將PH調到7,在28℃下發酵6小時,用2000轉/分的速度離心10分鐘,得清液即為含磷酶液。
本發明生產ADP和CDP的方法中所述的不含磷酶液的製備基本同上,只要去掉磷酸即可。
本發明生產ADP和CDP的方法中所述的由AMP(或CMP)轉化為ATP(或CTP)可以這樣進行按10%AMP(或CMP)水溶液含磷酶液=1∶10的比例,在PH為7、28℃下反應3.5小時,得到ATP(或CTP)反應液。
本發明的生產ADP和CDP的方法中所述的純化過程可以是將上述反應液的PH調到中性,在100℃下加熱1分鐘後,冷卻,離心(3000-5000轉/分)15分鐘,或用一層濾紙鋪硅藻土過濾,得到的濾液用水稀釋3倍,用氫氧化銨調PH到8-8.5,上到聚苯乙烯-二乙烯苯季胺型陰柱上進行分離,用0.01N鹽酸洗脫後,再用0.01N鹽酸且含0.04N氯化鈉溶液洗下ADP(或CDP),用0.2-0.7M氯化鈉洗下ATP(或CTP)。
本發明的生產ADP或CDP的方法中所述的濃縮乾燥過程可以這樣進行將純化後得到的ATP(CTP)洗脫液用水稀釋3倍,用氫氧化銨將PH調到8-8.5,充分上滿柱後,用0.01N鹽酸以及0.01N鹽酸且含0.6-1M氯化鈉溶液洗下ATP(CTP),用6N氫氧化鈉將洗脫液PH調到3.8,加三倍體積的95%的乙醇,冷置過夜,傾去上部乙醇,沉澱分別用75%乙酵,用無水乙醇,無水乙醚脫去水份,並用五氧化二磷真空乾燥。
本發明的生產ADP或CDP的方法中所述的鎂鹽可以是氯化鎂或硫酸鎂。
本發明生產ADP或CDP的方法成本低,產率高,最高可達90%沒有環境汙染,能穩定產生ADP或CDP,適合大規模生產。
下面結合實施例對本發明進行更詳細的描實施例一種生產CDP的方法。
選用啤酒酵母用蒸餾水洗2-3次,得酵母泥在低溫下保存備用。
按重量濃度分別加入酵母36%,葡萄糖10%,磷酸3%,氯化鎂0.5%配成去離子水溶液,將PH調到7,在28℃下發酵6小時,在轉速為2000轉/分的離心機中離心10分鐘,上清液即為含磷酶液,在5℃左右保存備用。
按重量濃度分別加入酵母36%,葡萄糖10%,氯化鎂0.5%配成去離子水溶液,將PH調到7,在28℃下發酵6小時,在轉速為2000轉/分的離心機中離10分鐘,上清液即為不含磷酶液,在5℃左右保存備用。
用去離子水將CMP配成10%的水溶液,按10%CMP水溶液含磷酶液=1∶10的比例,在PH為7,28℃下反應3.5小時,得到胞嘧啶核苷三磷酸(簡稱CTP)反應液。
將CTP反應液調PH至中性,在100℃下加熱1分鐘後,冷卻、離心(3000-5000轉/分)10分鐘,將得到的清液用水稀釋3倍,用氫氧化銨將PH調到8-8.5上到聚苯乙烯二乙烯苯季胺型陰柱上進行分離,用0.01N鹽酸洗脫下CMP,用0.01N鹽酸含0.04N氯化鈉洗下CDP,用含0.5M氯化鈉洗下CTP(實際上CMP90%以上轉化成CTP)。
將前步的CTP洗脫液用去離子水稀釋3倍,用氫氧化銨將PH調到8-8.5,充分上滿濃縮陰柱,用0.01N鹽酸含0.5M氯化鈉溶液洗下CTP,用6N氫氧化鈉調PH到3.8,並加入三倍體積的95%的乙醇後置冷庫過夜,小心傾去上部酒精液,沉澱用75%乙醇,無水乙醇,無水乙醚脫去水份,再用五氧化二磷真空乾燥,得到乾燥的CTP。
按重量濃度加入不含磷酶液90%,CTP10%,氯化鎂0.5%,葡萄糖10%配成去離子水溶液,在37℃,PH為7條件下反應1-3.5小時,得到的CDP反應液經聚苯乙烯-二乙烯苯季胺型陰柱純化和濃縮,洗脫液用乙醇濃縮,洗滌及用乙醚乾燥得到CDP。
權利要求
1.一種製備腺嘌呤核苷二磷酸的方法,其特徵是將啤酒酵母預處理後製成含磷和不含磷兩種酶液,將腺嘌呤核苷一磷酸在含磷酶液的作用下轉化為腺嘌呤核苷三磷酸並將純化、濃縮、乾燥,用不含磷酶液和腺嘌呤核苷三磷酸按重量濃度為70-90%酶液、10-30%核苷三磷酸配成水溶液,在此水溶液中按重量濃度分別加入0.2-0.7%的鎂鹽和5-20%的葡萄糖,在28-39℃、PH6-7.5的條件下反應1-3.5小時,得到的反應液經純化、濃縮、乾燥即為腺嘌呤核苷二磷酸。
2.如權利要求1所述的方法,其特徵在於所述啤酒酵母預處理是將啤酒中生產中經過培養七、八代的菌株或陶汰酵母用蒸餾水或去離子水洗2-3次,自然沉澱或離心至少10分鐘,得到的酵母泥在0℃-10℃下保存。
3.如權利要求1所述的方法,其特徵在於所述含磷酶液是按重量嘗試分別加入葡萄糖10%,磷酸3%,鎂鹽0.5%,酵母36%配成水溶液後,將PH調到7,在28℃下發酵6小時,用2000轉/分的速度離心10分鐘,得到的清液為含磷酶液。
4.如權利要求1所述的方法,其特徵在於所述不含磷酶液是按重量濃度分別加入葡萄糖10%,鎂鹽0.5%,酵母36%配成水溶液後,將PH調到7,在28℃下發酵6小時,用2000轉/分的速度離心10分鐘,得到的清液為不含磷酶液。
5.如權利要求1所述的方法,其特徵在於所述的將腺嘌呤核苷-磷酸轉化為腺嘌呤核苷三磷酸是這樣進行的將腺嘌呤核苷-磷酸配成10%的水溶液,並按10%腺嘌呤核苷一磷酸水溶液含磷酶液=1∶10的比例,在PH為7、28℃下反應3.5小時。
6.如權利要求1所述的方法,其特徵在於所述的純化過程是將反應液的PH調至中性在100℃下加熱1分鐘後,冷卻,離心(3000-5000轉/分)15分鐘,或用一層濾紙鋪硅藻土過濾,濾液用水稀釋3倍,用氫氧化銨調PH到8-8.5,上到聚苯乙烯二乙烯苯季胺型陰柱上進行分離,用0.01N鹽酸洗脫後,再用0.01N鹽酸且含0.04N氯化鈉水溶液洗脫,再用0.2-0.7M氯化鈉洗脫,得到有用的洗脫液(ATP或ADP)。
7.如權利要求1所述的方法,其特徵在於所述濃縮乾燥過程是將有用的洗脫液用水稀釋3倍,用氫氧化銨將PH調到8-8.5,充分上滿聚苯乙烯二乙烯苯季胺型陰柱,用0.01N鹽酸以及0.01N鹽酸且含0.6-1M氯化鈉溶液洗脫,洗脫液用6N氫氧化鈉將其PH調到3.8,加三倍體積的95%的乙醇,冷置過夜,傾去上部乙醇,沉澱分別用75%乙醇,無水乙醇無水乙醚脫去水份,並用五氧化二磷真空乾燥。
8.如權利要求1所述的方法,其特徵在於所述的鎂鹽是氯化鎂或硫酸鎂。
9.一種製備胞嘧啶核苷二磷酸的方法,其特徵是將啤酒酵母預處理後製成含磷和不含磷兩種酶液,將胞嘧啶核苷一磷酸在含磷酶液的作用下轉化為胞嘧啶核苷三磷酸並將其純化、濃縮乾燥,用不含磷酶液和胞嘧啶核苷三磷酸按重量濃度為70-90%不含磷酶液、10-30%胞嘧啶核苷三磷酸配成水溶液,在此水溶液中按重量濃度分別加入0.2-0.7%的鎂鹽和5-20%的葡萄糖,在28-30℃、PH為6-7.5的條件下反應1-3.5小時,得到的反應液經純化、濃縮、乾燥即為胞嘧啶核苷二磷酸。
10.如權利要求9所述的方法,其特徵在於所述啤酒酵母預處理是將啤酒生產中經過培養七、八代的菌株或陶汰酵母用蒸餾水或去離子水洗2-3次,自然沉澱或離心至少10分鐘,得到的酵母泥在0℃-10℃下保存。
11.如權利要求9所述的方法,其特徵在於所述含磷酶液是按重量濃度分別加入葡萄糖10%,磷酸3%,鎂鹽0.5%,酵母36%配成水溶液後,將PH調到7,在28℃下發酵6小時,用2000轉、分的速度離心10分鐘,得到的清液為含磷酶液。
12.如權利要求9所述的方法,其特徵在於所述不含磷酶液是按重量濃度分別加入葡萄糖10%,鎂鹽0.5%,酵母36%配成水溶液後,將PH調到7,在28℃下發酵6小時,用2000轉/分的速度離心10分鐘,得到的清液為不含磷酶液。
13.如權利要求9所述的方法,其特徵在於所述的將胞嘧啶核苷-磷酸轉化為胞嘧啶核苷三磷酸是這樣進行的將胞嘧啶核苷-磷酸配成10%的水溶液,並按10%胞嘧啶核苷-磷酸水溶液含磷酶液=1∶10的比例,在PH為7,28℃下反應3.5小時。
14.如權利要求9所述的方法,其特徵在於所述的純化過程是將反應液的PH調至中性在100℃下加熱1分鐘後,冷卻,離心(3000-5000轉/分)15分鐘,或用一層濾紙鋪硅藻土過濾,濾液用水稀釋3倍,用氫氧化銨調PH到8-8.5,上到聚苯乙烯-二乙烯苯季胺型陰柱上進行分離,用0.01N鹽酸洗脫後,再用0.01N鹽酸且含0.04N氯化鈉水溶液洗脫,再用0.2-0.7M氯化鈉洗脫,得到有用的洗脫液(CTP或CDP)。
15.如權利要求9所述的方法,其特徵在於所述濃縮乾燥過程是將有用的洗脫液用水稀釋3倍,用氫氧化銨將PH調到8-8.5,充分上滿聚苯乙烯二乙烯苯季胺型陰柱,用0.01N鹽酸以及0.01N鹽酸且含0.6-1M氯化鈉溶液洗脫,洗脫液用6N氫氧化鈉將其PH調到3.8,加三倍體積的95%的乙醇,冷置過夜,傾去上部乙醇,沉澱分別用75%乙醇,無水乙醇,無水乙醚脫去水份,並用五氧化二磷真空乾燥。
16.如權利要求9所述的方法,其特徵在於所述的鎂鹽是氯化鎂或硫酸鎂。
全文摘要
本發明為一種生產腺嘌呤核苷二磷酸和胞嘧啶核苷二磷酸的方法。本方法主要包括啤酒酵母的預處理、酶液的製備、將核苷一磷酸轉化為核苷三磷酸、將核苷三磷酸在不含磷酶液的作用下生成核苷二磷酸。本發明的合成方法成本低、產率高,最高可達90%,沒有環境汙染,能穩定產生目的產物,適合大規模生產。
文檔編號C12P19/32GK1106460SQ94101000
公開日1995年8月9日 申請日期1994年2月7日 優先權日1994年2月7日
發明者陸傳宗 申請人:中國科學院生物物理研究所