用於測定應用的聚合物支架的製作方法

2023-10-10 10:22:34 2

用於測定應用的聚合物支架的製作方法
【專利摘要】提供了與固體支持物結合的反應性聚合物，修飾的固體支持物和反應性聚合物。還提供了包含上述的固體支持物，其用作用於檢測和/或表徵諸如生物分子的分析物的分析裝置。
【專利說明】用於測定應用的聚合物支架
[0001] 政府利益聲明
[0002] 本文所述工作的部分資金基於第HSHQDC-10-C-00053和HSHQDC-11-C-00089號合 同由美國國土安全部提供。美國政府具有本發明的某些權利。
[0003] 相關申請的引用
[0004] 本發明基於35U.S.C. § 119(e)要求於2012年2月17日提交的第61/600, 569號 美國臨時專利申請的權益；其申請的全部公開內容通過引入整體併入本文。
[0005] 背景 發明領域
[0006] 本發明一般涉及聚合物、包含該聚合物的固體支持物及其使用方法。
[0007] 相關摶術描沭
[0008] 生物測定用於探測分析物在生物樣品中的存在和/或數量。在基於表面的測 定中，在固體支持物或基底上捕獲和檢測分析物質。基於表面的測定的實例是D NA微 陣列。DNA微陣列的應用已廣泛用於基因表達和基因分型的研究中，這歸因於同時監測 大量基因的能力（Schena 等人，Science 270:467-470(1995) ;Pollack et al. ,Nat. Genet.23:41-46(1999))。為了促進陣列形式（array format)的多種多樣的生物測定，也 可以使用其他結合部分如碳水化合物、抗體、蛋白、半抗原或適體來製造陣列。
[0009] 用於生物測定應用的有效官能化材料必須具有充足的容量來固定足量的來自相 關樣品的分析物，從而在進行檢測（例如聚合酶鏈反應）時提供適當的信號。合適的官能 化材料還必須提供高度可再現表面，從而有利地用於剖析（profiling)實驗，特別是在以下 測定形式中，即，其中樣品和對照必須在與其連接的不同支持表面（例如不同的支持物或 在相同支持物上的不同位置）上進行分析。例如，未基於高度可再現表面化學的支持物當 進行測定（例如剖析比較）時可產生顯著的誤差，這歸因於支持物之間或相同支持物上不 同位置的差異。
[0010] 參考包含有機聚合物（例如水凝膠）組分的裝置來說明本領域對新官能化材料， 包含該材料的裝置以及形成此類材料的方法的需求。通常，包含聚合物的裝置通過在諸如 微珠、顆粒、片等的基底上原位聚合前體單體或預聚物而形成。包含有機聚合物的裝置的選 擇性和再現性經常高度取決於諸多實驗變量，包括單體濃度、單體比例、引發劑濃度、溶劑 蒸發率、環境溼度（在溶劑為水的情況下）、交聯劑濃度、單體/交聯劑/溶劑的純度、實驗 室溫度、移液時間、噴霧條件、反應溫度（在熱聚合的情況下）、反應溼度、紫外輻射均勻性 (在UV光聚合的情況下）以及環境氧條件。儘管可以在製造設置中控制這些參數中的許多 參數，但難以控制影響再生性的所有這些參數（如果有可能的話）。因此，原位聚合導致所 有參數在場地間、晶片間和批次間的相對不良的再現性。
[0011] 此外，儘管對使用基於二氧化矽的基底如玻璃、石英、熔融二氧化矽和 娃來開發生物測定表面開展了大量的工作（參見例如，D. Cuschin等人，Anal. Biochem. 1997, 250, 203-211 ;G. M. Harbers 等人，Chem. Mater. 2007, 19, 4405-4414 ;以及 Shi等人的第6, 790, 613號美國專利、Boles等人的第5, 932, 711號美國專利、Bardhan等 人的第6, 994, 972號美國專利、Frutos等人的第7, 781，203號美國專利及Lewis等人的 第7, 217, 512和7, 541，146號美國專利），但使用較廉價、更易於製造的基底如聚合物基底 產生了額外的優勢。然而，在選擇和製備用於生物測定目的的此類基底方面，已遇到其它 挑戰。例如，聚合物基底由於額外的表面官能化而常常遭受更嚴重的問題，例如，增加的自 體螢光性（參見例如Ofstead等人的第7, 309, 593號美國專利，描述了在聚合物中的含二 苯甲酮或疊氮化物的三聚物、離去二苯甲酮殘基、硝基或亞硝基副產物導致過量的螢光背 景）、導致不期望的非特異性吸附的增加的疏水性、以及在使塗層與下面的聚合物基底附著 或連接方面的挑戰。
[0012] 因此，需要官能化材料及包含這些材料的裝置，所述材料提供測定之間的可再現 結果，易於使用，且提供了多分析物系統的定量數據。此外，為了變得廣為接受，所述材料應 是廉價且易於製備的，呈現低非特異性結合，並且能夠形成多種功能裝置形式。包含具有上 述特性的材料的裝置的可用性會顯著影響研究、臨床實驗室、醫療診所、醫院診所、養老院、 門診、急診、個體床邊診斷情形（醫生辦公室、急診、非現場（out in the field)等）以及高 通量測試應用。本發明提供了具有這些及其他期望特性官能化材料。
[0013] 簡述
[0014] 簡言之，本發明一般涉及包含固定於基底的聚合物的固體支持物及其使用方法。 例如，聚合物可以通過一個或多個共價鍵而固定於基底。固體支持物在諸多應用中發現實 用性，包括在固體基底上固定捕獲探針（例如生物分子）以用於分析測定。還提供了包含適 於與聚合物反應或相互作用的表面活性基團的固體基底，以及包含聚合物和任選的捕獲探 針的固體支持物。本文公開的聚合物、固體基底和固體支持物可用於多種分析應用，例如用 於臨床實驗室、醫療診所、醫院診所、養老院、門診、急診、個體床邊診斷情形（醫生辦公室、 急診、現場（in the field)等）、高通量測試及其他應用的DNA和蛋白微陣列。
[0015] 本文描述的固體支持物及相關方法在多個實施方案中提供了諸多優勢。例如，在 某些實施方案中，聚合物通過在聚合物中存在的熱化學反應性單體單元而共價結合於基底 (例如塑料聚合物基底）。因此，聚合物可以共價結合於基底而不使用光化學連接物（即，在 光反應性基團與基底之間的UV誘導的鍵形成）。因此，結合的聚合物通常基本不包含分子 間和/或分子內交聯，這是與將光化學活性基團用於與基底共價連接相關的常見副反應。 不受任何理論限制，本發明人確信上述情形在具有更大流體動力學柔性的基底上形成聚合 物塗層，所述基底對於捕獲探針是更可滲透的並由此是更可進入的，因此促進聚合物與捕 獲探針之間的結合反應。缺少光化學反應性連接物基團還被認為促成本文固體支持物的更 低的螢光背景信號。
[0016] 此外，本發明的實施方案使聚合物固定於（共價或另外方式）除常用的載玻片之 外的基底。例如，在某些實施方案中，本公開提供了與聚合物基底共價結合的聚合物。在某 些實施方案中，這樣的基底有利地具有400nm與SOOnm之間（常用於檢測的波長）的高透 明度（例如>91% )。此外，基底可以在PCR測定的典型測定溫度（例如高達IKTC )下使 用，並通常具有低的水吸收（例如小於約〇. 05% )。
[0017] 因此，在一個實施方案中，本公開提供了固體支持物，其包含：
[0018] 具有外部表面的非磁性基底；以及
[0019] 與所述基底的外部表面共價結合的多個聚合物，所述聚合物各自包含多個稀釋單 體和多個反應性單體，每一稀釋單體包含親水性側基，並且每一反應性單體包含熱化學反 應性側基，其中所述聚合物通過所述基底的外表面與反應性單體或其經反應的片段中的至 少一個之間的共價鍵、或通過所述基底的外表面與至少一個所述聚合物之間的離子相互作 用而固定於所述基底的外表面，並且其中至少一個所述熱化學反應性側基可用於與捕獲探 針上的官能團共價連接。這樣的固體支持物在諸多應用中發現實用性，例如多個分析物的 多重檢測。
[0020] 在另一實施方案中，本發明涉及包括第一和第二表面的基底，其中所述第一表面 是同質基底（native substrate)的外表面，並且所述第二表面具有以下結構之一，或其鹽、 立體異構體或互變異構體：
[0021]
【權利要求】
1. 固體支持物，其包含： 具有外部表面的非磁性基底；以及 與所述基底的外部表面共價結合的多個聚合物，所述聚合物各自包含多個稀釋單體和 多個反應性單體，每一稀釋單體包含親水性側基，並且每一反應性單體包含熱化學反應性 側基，其中所述聚合物通過所述基底的外表面與所述反應性單體或其經反應的片段中的至 少一個之間的共價鍵、或通過所述基底的外表面與至少一個所述聚合物之間的離子相互作 用而固定於所述基底的外表面，並且其中至少一個所述熱化學反應性側基可用於與捕獲探 針上的官能團共價連接。
2. 如權利要求1所述的固體支持物，其中所述聚合物通過所述基底的外表面與至少一 個所述熱化學反應性基團的經反應的片段之間的共價鍵而固定於所述基底的外表面。
3. 如權利要求1或2中任一項所述的固體支持物，其中每一聚合物獨立地具有以下結 構（I)或其鹽、立體異構體或互變異構體：
其中： A每次出現時獨立地為熱化學反應性側基； B每次出現時獨立地為親水性側基； R1、R2和R3每次出現時獨立地為H或C1-C6烴基； L1每次出現時獨立地為連接物； T1和T2各自獨立地為不存在或為選自H、烴基和引發劑殘基的聚合物端基； Q表不基底的外表面；以及 X、y和z獨立地為所述聚合物中各個單體的摩爾百分比，其中X、y和z各自大於O摩 爾％並且X、y和z的總和為100摩爾％。
4. 如權利要求1至3中任一項所述的固體支持物，其中所述熱化學反應性基團是活化 酯或吖內酯。
5. 如權利要求4所述的固體支持物，其中所述活化酯是芳基酯。
6. 如權利要求1至4中任一項所述的固體支持物，其中所述熱化學反應性基團具有以 下結構之一：
其中R4a、R4b、R'R4d和儼各自獨立地為Η、滷素、腈或硝基。
7. 如權利要求6所述的固體支持物，其中所述熱化學反應性基團具有以下結構：
8. 如權利要求7所述的固體支持物，其中R4a、R4b、R'R4d和儼各自為氟。
9. 如權利要求1至8中任一項所述的固體支持物，其中所述親水性側基具有以下結構 之一： 其中：
R5、R6、R7、R8和R9各自獨立地為H、C1-C6烴基或C1-C6雜烴基，或者R6和R7,或R8和R9 連同它們所結合的氮原子一起形成雜環；以及 η為1至2,OOO的整數。
10. 如權利要求9所述的支持物，其中R6和R7各自獨立地為H或甲基。
11. 如權利要求1至10中任一項所述的固體支持物，其中所述親水性側基具有以下結 構之一：
12. 如權利要求1至10中任一項所述的固體支持物，其中所述親水性側基具有以下結 構之一：
13. 如權利要求3至12中任一項所述的固體支持物，其中L1包括矽-氧鍵、胺鍵、醯胺 鍵、磺醯胺鍵、亞烴基鍵、聚合物或其組合。
14. 如權利要求13所述的固體支持物，其中所述聚合物是聚乙二醇、聚烯丙胺或聚亞 乙基亞胺。
15. 如權利要求14所述的固體支持物，其中所述聚乙二醇包括10至50, 000個單體亞 單元。
16. 如權利要求15所述的固體支持物,其中所述聚乙二醇包括55至90個單體亞單元。
17. 如權利要求3至16中任一項所述的固體支持物，其中L1具有以下結構：
其中： L2和L3各自獨立地為任選的包含亞烴基部分、氧化亞烴基部分、醯亞胺部分、醚部分、 酯部分、胺部分或醯胺部分或其組合的連接物； Rltl和R11各自獨立地為H、羥基、烴基、烴氧基或-OQ; R12、R13、R14和R15各自獨立地為H、烴基、滷素、滷代烴基、腈、硝基、烷基銨或滷代烷基 銨； P在每次出現時獨立地表示單體亞單元； A為直接鍵或-S(O)2-; Q為所述基底的外表面；以及Y為1至2000的整數。
18. 如權利要求17所述的固體支持物，其中每一P獨立地為-CH2-、-CH2CH(CH2NH2)-或-OCH2CH2-。
19. 如權利要求3至18中任一項所述的固體支持物，其中L1具有以下結構之一：
其中： Q表示所述基底的外表面；以及 Y為1至2000的整數；以及 a和b各自獨立地為1至1999的整數。
20. 如權利要求19所述的固體支持物，其中γ為55至90。
21. 如權利要求1至20中任一項所述的固體支持物，其中通過所述基底的外表面上反 應性基團與至少一個所述熱化學反應性側基之間的反應形成所述共價鍵。
22. 如權利要求1至21中任一項所述的固體支持物，其中所述聚合物還包含與捕獲探 針的至少一個共價鍵。
23. 如權利要求22所述的固體支持物，其中通過在所述捕獲探針上的反應性基團與至 少一個所述熱化學反應性側基之間的反應形成與所述捕獲探針的至少一個共價鍵。
24. 如前述權利要求中任一項所述的固體支持物，其中所述聚合物包含小於約 40mol%的所述稀釋單體。
25. 如前述權利要求中任一項所述的固體支持物，其中所述聚合物包含約35mol%或 更少的所述稀釋單體。
26. 如權利要求1至23中任一項所述的固體支持物，其中所述聚合物包含至少約 30mol%的所述稀釋單體。
27. 如權利要求1至23中任一項所述的固體支持物，其中所述聚合物包含至少約 75mol%的所述反應性單體。
28. 如權利要求1至23中任一項所述的固體支持物，其中所述聚合物包含至少約 90mol%的所述反應性單體。
29. 如權利要求1至23中任一項所述的固體支持物，其中所述聚合物包含至少約 95mol%的所述反應性單體。
30. 如權利要求1至29中任一項所述的固體支持物，其中所述聚合物是無規共聚物。
31. 如權利要求1至29中任一項所述的固體支持物，其中所述聚合物是無規三聚物。
32. 如權利要求31所述的固體支持物，其中所述聚合物包含多於一種類型的結構上不 同的親水性側基。
33. 如權利要求31所述的固體支持物，其中所述結構親水性側基具有以下結構：
34. 如權利要求1至33中任一項所述的固體支持物，其中所述捕獲探針是生物分子。
35. 如權利要求1至34中任一項所述的固體支持物，其中所述捕獲探針是多核苷酸、寡 核苷酸、肽、多肽、蛋白、糖基化蛋白、適體、糖結合物、碳水化合物或抗體。
36. 如權利要求1至35中任一項所述的固體支持物，其中所述捕獲探針是選自RNA、 DNA和寡核苷酸的多核苷酸。
37. 如權利要求1至36中任一項所述的固體支持物，其中所述捕獲探針是抗體。
38. 如權利要求1至37中任一項所述的固體支持物，其中所述固體支持物的水接觸角 為 40° 至 90°。
39. 如權利要求1至38中任一項所述的固體支持物，其中所述固體支持物的水接觸角 為 50° 至 80°。
40. 如權利要求1至39中任一項所述的固體支持物，其中所述固體支持物的水接觸角 為 60° 至 75°。
41. 如權利要求1至40中任一項所述的固體支持物，其中所述基底包含有機聚合物。
42. 如權利要求41所述的固體支持物，其中所述基底包含：聚（苯乙烯）、聚（碳酸 酯）、聚（醚碸）、聚（酮）、聚（脂肪醚）、聚（芳基醚）、聚（醯胺）、聚（醯亞胺）、聚（酯）、 聚（丙烯酸酯）、聚（甲基丙烯酸酯）、聚（烯烴）、聚（環烯烴）、聚（乙烯醇）或其聚合物、 滷化衍生物或交聯衍生物。
43. 如權利要求42所述的固體支持物，其中所述滷化衍生物是滷化聚（芳基醚）、滷化 聚（烯烴）或滷化聚（環烯烴）。
44. 如權利要求43所述的固體支持物，其中所述基底包含環聚（烯烴）。
45. 如權利要求1至40中任一項所述的固體支持物，其中所述基底包含氧化物。
46. 如權利要求45所述的固體支持物，其中所述基底包含矽、熔融二氧化矽、玻璃、石 英、氧化銦錫、二氧化鈦、氧化鋯、氧化鋁或其組合。
47. 如權利要求1至46中任一項所述的固體支持物，其中所述基底包含有機聚合物和 氧化物的複合物。
48. 如權利要求47所述的固體支持物，其中所述氧化物是二氧化矽。
49. 如權利要求1至48中任一項所述的固體支持物，其中所述基底是基本光學透明的。
50. 如權利要求1至49中任一項所述的固體支持物，其中所述基底在約400nm與約 800nm之間是基本光學透明的。
51. 如權利要求1至50中任一項所述的固體支持物，其中所述基底是至少約90%光學 透明的。
52. 如權利要求1至51中任一項所述的固體支持物，其中所述固體支持物包含不同位 置的系統陣列，每一不同位置獨立地包括至少一個與所述基底的外表面共價結合的所述聚 合物。
53. 如權利要求52所述的固體支持物，其中每一不同位置獨立地包括多個與其共價結 合的所述聚合物。
54. 如權利要求52或53中任一項所述的固體支持物，其中在每一不同位置處的至少一 個聚合物獨立地包含與其共價結合的捕獲探針。
55. 如權利要求54所述的固體支持物，其中每一不同位置包括多個結構上不同的與其 結合的捕獲探針。
56. 如權利要求1至55中任一項所述的固體支持物，其中所述多個聚合物在其之間基 本未交聯。
57. 具有第一和第二表面的基底，其中所述第一表面是同質基底的外表面，並且所述第 二表面具有以下結構之一，或其鹽、立體異構體或互變異構體：
其中： L2和L3各自獨立地為任選的包含亞烴基部分、氧化亞烴基部分、醯亞胺部分、醚部分、 酯部分、胺部分或醯胺部分或其組合的連接物； Rltl和R11各自獨立地為H、羥基、烴基、烴氧基或-OQ; R12、R13、R14和R15各自獨立地為H、烴基、滷素、滷代烴基、腈、硝基、烴基銨或滷代烴基 銨； P在每次出現時獨立地表示單體亞單元； A為直接鍵或-S(O)2-; Q表示所述基底的外表面；以及Y為1至2000的整數。
58. 如權利要求57所述的基底，其中每一P獨立地為-CH2-、-CH2CH(CH2NH2)-或-OCH2CH 2_〇
59. 如權利要求57或58中任一項所述的基底，其中所述第二表面具有以下結構之一：
其中： Q表示所述基底的外表面；以及Y為1至2000的整數；以及 a和b各自獨立地為1至1999的整數。
60. 如權利要求59所述的基底，其中γ為55至90。
61. 用於製備權利要求1至60中任一項所述的固體支持物的方法，所述方法包括： A) 提供基底，其包含在其外表面上的多個反應性基團；以及 B) 使所述基底與多個聚合物接觸，所述聚合物各自包含多個稀釋單體和多個反應性單 體，每一稀釋單體包含親水性側基，並且每一反應性單體包含熱化學反應性側基；以及 C) 在所述基底與所述多個聚合物中至少一個聚合物之間形成共價鍵， 其中在足以在不用UV輻射外部源進行輻射的情況下在所述基底上至少一個所述反應 性基團與至少一個所述熱化學反應性側基之間形成共價鍵的條件下，使所述基底與所述多 個聚合物接觸。
62. 如權利要求61所述的方法，其還包括在足以在至少一個所述熱化學反應性側基與 所述捕獲探針上的反應性基團之間形成共價鍵的條件下，使所述固體支持物與捕獲探針接 觸。
63. 如權利要求61或62中任一項所述的方法，其中所述基底是權利要求41至51或 57至60中任一項所述的基底。
64. 用於測定靶標分析物分子的存在或不存在的方法，所述方法包括： a) 提供權利要求1至56中任一項所述的固體支持物，其中所述聚合物包含至少一個與 其共價結合的捕獲探針； b) 使分析物探針與所述固體支持物接觸；以及 c) 檢測由所述捕獲探針與所述分析物探針之間的相互作用產生的信號的存在或不存 在。
65. 如權利要求64所述的方法，其中所述捕獲探針是多核苷酸。
66. 如權利要求64或65中任一項所述的方法，其中所述分析物探針是多核苷酸。
67. 如權利要求64所述的方法，其中所述捕獲探針是抗體。
68. 如權利要求64或67中任一項所述的方法，其中所述分析物探針是蛋白。
69. 如權利要求64至68中任一項所述的方法，其中所述信號是突光信號。
70. 如權利要求69所述的方法，其中所述螢光信號由所述分析物探針與所述捕獲探針 的特異性雜交而產生。
71. 如權利要求64至70中任一項所述的方法，其中所述分析物探針包含螢光團或螢光 團淬滅劑。
【文檔編號】G01N33/543GK104321355SQ201380020388
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年2月15日 優先權日:2012年2月17日
【發明者】奧爾德裡奇·N·K·勞, 羅伯特·G·伊森, 克裡斯蒂安·斯卡布, 布萊德·塔夫特 申請人:Nvs技術股份有限公司