重組水蛭素的新用途的製作方法

2023-10-17 21:22:44 1

專利名稱：重組水蛭素的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及重組水蛭素的新用途，尤其涉及在製藥領域中的用途。
背景技術：
水蛭素是從醫用水蛭唾液腺提取的含65-66個胺基酸的蛋白，為單鏈多肽，分子質量為7000u，分子中含3對二硫鍵，在1-49位形成了高度摺疊、緻密的三級結構，使此結構域穩固，而線形的C端序列用以結合凝血酶。作為凝血酶的特異性抑制劑，它有很強的抗凝活性，能有效預防和治療彌散性血管內凝結，在心血栓及腦血栓等疾病方面均有顯著作用。由於天然水蛭素來源有限，目前廣泛利用生物工程技術製備重組水蛭素，最廣泛的兩類細胞表達體系分別為大腸桿菌(E.coli)和釀酒酵母(S.cerevisiae)。CN1319671A中公開了重組水蛭素的製備方法。臨床上，重組水蛭素多用於治療不穩定性心絞痛(USA)、急性心肌梗死(AMI)、血管成形術、術後血栓形成、血液透析、體外循環、彌散性血管內凝血(DIC)等(MarkwardtF.Hirudin as an inhibitor of thrombin[J].Methods in Enzymelogy，1970，19924)。臨床實驗表明重組水蛭素不引起過敏、免疫反應，並且不會造成循環功能障礙。但未見有預防和治療白內障疾病的藥理報導及臨床應用。

發明內容
本發明公開了重組水蛭素的一種新用途，特別是重組水蛭素在製備預防和治療白內障疾病的藥物中的應用。
在白內障的發生過程中，均伴有晶體內的種種生化代謝改變如脂質過氧化加速，醛糖還原酶活性增高、超氧化物歧化酶及穀胱甘肽還原酶等活性降低，ATP濃度下降，一些胺基酸、維生素及還原性物質減少，電解質平衡失調以及晶體蛋白聚合和結構性質改變等。因此，防治白內障的途徑也是多方面的如利用抗氧化劑或抗氧化激活劑以清除或中和紫外線、電離輻射、化學物質以及代謝產物等對晶體的有害損傷，通過補充維生素、輔酶(NADP)、穀胱甘肽以及ATP等，以減少晶體內的生化代謝改變，通過封閉蛋白質的一些活潑基團，以保護蛋白質免受有鹽害化學物質形成加合物而造成損傷。在藥理學試驗中，檢測一個藥物是否對改善白內障有益，通常看待測藥物是否能使晶體內SOD活力升高、MDA含量下降。
我們的試驗發現重組水蛭素對眼無刺激，可顯著推遲白內障發生時間，減輕晶狀體渾濁程度，降低MDA含量，增大SOD活力。對白內障有顯著的防治作用。
為了更好地發揮療效，將重組水蛭素製備成藥學上常用製劑，優選的製劑為滴眼液、眼膏劑、注射劑。滴眼液的製備中，除加入緩衝溶液，還可加入對眼無刺激的促吸收劑、增稠劑、等滲劑、抑菌劑等。局部用眼藥的劑量一般為0.001～0.01g/日，也可根據不同情況超出該劑量範圍。
以下是本發明的部分藥理學試驗及數據，所用重組水蛭素依據CN1319671A方法製備得到一、多次眼刺激試驗試驗動物家兔1.8-2.3Kg，4隻。南京安立默科技有限公司，許可證號SCXK(蘇)20020-0002試驗方法按《臨床前研究指導原則彙編》中華人民共和國衛生部藥政局標準進行，將重組水蛭素滴眼液(0.5g/100ml)滴入眼結膜囊內。然後輕合眼瞼約10秒，以確保受試物與局部的接觸充分。另外一隻眼將溶劑滴入眼結膜囊內，作為對照。
觀察期與觀察指標在1、24、48、72hr進行眼部檢查，連續觀察7天。除了應觀察結膜、角膜、虹膜外，其他所觀察到的損傷也應記錄和報告。每次檢查，都應記錄眼部的反應的分值。試驗結果將每一動物的眼角膜、虹膜和結膜的刺激性反應分值相加得總積分，將一組的總積分除以動物數，即得最後分值，見下表.
各個觀察時間各組眼睛最後得分試驗動物組 1h 24h 48h 72h 4d 5d 6d 7d給藥一側眼睛00000 0 0 0對照一側眼睛00000 0 0 0試驗結論重組水蛭素滴眼劑對給藥一側眼睛眼角膜、虹膜和結膜未出現刺激性，與對照一側眼睛一樣；重組水蛭素滴眼劑無眼刺激性。
二、防治大鼠白內障試驗試驗動物28日齡SD大鼠60隻，體重53.5-68g，雌雄各半。由中國藥科大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK(蘇)2001-001。試驗方法28日齡SD大鼠60隻，雌雄各半，隨機分為6組，每組10隻正常對照組(生理鹽水)，模型對照組(只造模不給藥)，陽性對照組(白內停Pir0.4mg/kg)，結膜囊內點滴高、中、低劑量組(重組水蛭素1.68mg/kg，0.84mg/kg，0.42mg/kg)。各組給藥容積均為0.25ml/50g。除正常對照組，其他組腹腔注射0.08％的D-半乳糖溶液，相當於20mg/kg，1次/日，連續腹腔注射14天，給藥容積為25ml/kg，並飲用10％D-半乳糖溶液。在誘發半乳糖性白內障的第4天，分別點雙眼高劑量(1.68mg/kg)，中劑量(0.84mg/kg)及低劑量(0.42mg/kg)重組水蛭素(5次/日)。第3天開始用檢眼儀觀察大鼠晶狀體的渾濁度，並記錄第8，14天晶狀體的變化，於實驗結束後取大鼠晶狀體，測定晶狀體中MDA含量和SOD活力。
晶狀體觀察結果以Ridit法進行統計分析；MDA及SOD測定結果中各組均與白內障模型組進行組間t檢驗。
試驗結果1、重組水蛭素對D-半乳糖所致的大鼠晶狀體變化的影響。結果見表1、表2。
表1、 重組水蛭素對白內障大鼠晶狀體渾濁度的影響(第8日)(n＝10)組別劑量(mg/kg) / + ++ +++ 合計陰性組 ----10 0 00**10模型組 ----00 2810Pir 0.4 82 00**10高劑量r-H 1.6873 00**10中劑量r-H 0.8482 00**10低劑量r-H 0.4281 10**10合計41 8 3860/無渾濁 +輕微渾濁 ++中等渾濁 +++嚴重渾濁**表示u＞2.58，與模型組比較表2、重組水蛭素對白內障大鼠晶狀體渾濁度的影響(第14日)(n＝10)組別劑量(mg/kg) / +++ +++ 合計陰性組 ---- 10 00 0**10模型組 ---- 0 01 9 10Pir 0.49 10 0**10高劑量r-H 1.68 8 20 0**10中劑量r-H 0.84 7 30 0**10低劑量r-H 0.42 8 11 0**10合計 42 72 9 60/無渾濁 +輕微渾濁 ++中等渾濁 +++嚴重渾濁**表示u＞2.58，與模型組比較結果表明各給藥組晶狀體渾濁度較模型組而言均有非常顯著差異。2、各組大鼠晶狀體中SOD活力比較結果見表3表3重組水蛭素對白內障大鼠晶狀體中SOD活力的影響(x±S)(n＝10)組別 劑量(mg/kg) SOD(NU/mgprot)陰性組 ---- 137.2±13.7**模型組 ---- 37.5±19.0pir 0.4 133.5±31.3**高劑量r-H 1.68 130.4±24.9**
中劑量r-H 0.84123.6±18.8**低劑量r-H 0.42122.2±19.2****P＜0.01，與模型組比較結果表明重組水蛭素高劑量組及陽性藥白內停均能明顯升高SOD活力，與模型對照組比較有極顯著差異(p＜0.01)，且與劑量呈正相關性。
3、各組大鼠晶狀體中MDA含量比較見表4表4重組水蛭素對白內障大鼠晶狀體中MDA含量的影響(x±S)(n＝10)組別劑量(mg/kg) MDA(nmol/mgprot)陰性組 ---- 6.34±1.19**模型組 ---- 24.29±4.72pir0.4 14.81±2.91**高劑量r-H 1.68 15.14±3.32**中劑量r-H 0.84 16.19±3.27**低劑量r-H 0.42 16.87±4.24****P＜0.01，與模型組比較結果表明重組水蛭素高、中、低劑量組及陽性藥白內停均能明顯降低MDA含量，與模型對照組比較有極顯著差異(p＜0.01)，且與劑量呈正相關性。試驗結論重組水蛭素可顯著推遲白內障發生時間，減輕晶狀體渾濁程度，降低MDA含量，增大SOD活力。重組水蛭素對半乳糖誘導的大鼠白內障有顯著的防治作用。
具體實施例方式
重組水蛭素滴眼液配方及其製備方法重組水蛭素 0.25g硼酸 1.116g硼砂 0.191g氯化鈉 0.22gEDTA 0.5g殼聚糖 0.5g對羥基苯甲酸乙酯 0.03g蒸餾水 加至100ml硼酸、硼砂加水製備成pH7.4的緩衝溶液，用緩衝溶液溶解重組水蛭素、EDTA、殼聚糖、氯化鈉、對羥基苯甲酸己酯，混勻、過濾、除菌分裝，即得本發明的重組水蛭素滴眼液。
權利要求
重組水蛭素在製備預防和治療白內障疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了重組水蛭素的一種新用途，具體說是在製備預防和治療白內障疾病的藥物中的應用。
文檔編號A61P27/00GK1483473SQ0313222
公開日2004年3月24日 申請日期2003年8月4日 優先權日2003年8月4日
發明者吳梧桐, 譚樹華, 崔莉, 李運曼 申請人:中國藥科大學