一種新的快速定性和定量檢測蓖麻毒素的膠體金免疫層析方法

2023-08-10 19:11:46

專利名稱：一種新的快速定性和定量檢測蓖麻毒素的膠體金免疫層析方法
技術領域：
本發明屬於生物檢測領域，具體涉及蓖麻毒素的檢測快速定性和定 量檢測方法以及膠體金免疫檢測試紙條。
背景技術：
蓖麻毒素(ricin toxin, RT)是一種從蓖麻種子的胚乳中提取的植 物蛋白毒素。由於RT來源廣泛，毒性較強，已被外軍作為武器化的一種 毒素加以研究。禁止化學和生物武器公約把RT列為最嚴格的控制對象之 一。自美國"9. 11"恐怖襲擊之後，隨著多個恐怖組織和極端分子研製、 擁有並攜帶RT驚現英國首都倫敦，使這種致命的毒素成為最有可能被用 作恐怖襲擊的生物毒素，而引起國際上的廣泛關注。為應對生物恐怖， 開展對RT的檢測研究具有十分重要的意義。
蓖麻毒素自發現之日起，其毒性就被人們所知，到目前位置文獻報 道蓖麻毒素中毒病例已超過750例，人們對它的研究就一直沒有停止過。 其中最著名的"馬克夫毒傘案，，中，叛逃到英國的保加利亞作家馬克夫， 就是被保加利亞特工用前蘇聯裝有RT的特製雨傘毒殺的近代，歐美國家 開始將RT用作常規武器進行研製。同時，作為生物恐怖戰劑，RT的獲得 又極其容易、廉價。根據檢出結果分析，研製的蓖麻膠體金試紙條檢測 系統最低可檢到lug/ml，而人致死量約為7mg。試紙條的靈敏度完全能 檢測到可疑物中是否含有蓖麻毒素的存在，檢驗的可行性。可以先從蓖 麻種子中獲得粗毒，然後利用其對半乳糖的特殊親和力，採用瓊脂糖4B柱 吸附，用半乳糖洗脫，再用纖維素離子交換柱層析或葡聚糖凝膠過濾進一 步純化;或是根據常規基因工程技術，利用基因克隆的方法來製備RT。由 於氣溶膠化的RT微粒無色無味，不易被發現，因此偵檢非常困難。
最初是用動物實驗測定RT的毒性和定量檢測。現階段根據RT所具 有的理化特性、生化特性和免疫原性發展出多種檢測方法，其中以免疫檢測法為主。免疫^r測法多是依賴於抗原抗體反應的免疫學方法，包括 多克隆和(或)單克隆抗體為基礎的放射免疫法或酶聯免疫吸附法 (ELISA)，免疫層析試驗和電化學發光生物傳感器，其中ELISA法是國 際規定的檢測RT的金標準[14]。此類方法具有高效、靈敏、樣品用量少 (pmo1- ji pmol)、自動化等特點，但缺陷是需要昂貴的儀器設備，且周期 長、操作繁瑣等缺點，並不適合廣泛應用，只適合在實驗室應用。
本發明提供一種快速定性和定量檢測蓖麻毒素的膠體金免疫層析方 法，該方法操作簡單，檢測時間短，無需專業人員，適合快速現場檢測。

發明內容
本發明提供一種快速定性和定量檢測蓖麻毒素的膠體金免疫層析方 法。本發明採用膠體金標記，實質是抗體蛋白等生物大分子被吸附到膠 體金顆粒表面的包被過程。
膠體金對蛋白質的吸附主要取決於pH值和蛋白質的最小穩定濃度， 離子濃度和蛋白質分子量等也影響二者之間的吸附。本發明發現在膠體 金檢測試紙條的製備過程中pH值條件是關鍵，因為膠體金是一種很不穩 定的膠體，而pH值條件對膠體金探針的影響最大。通常認為，在pH值 等於蛋白質等電點或較高於等電點時吸附效果最好，易形成牢固的複合 物而穩定膠體金。我們將膠體金標記技術應用於免疫層析法時要根據實 驗需要，選擇不同直徑大小的膠體金顆粒，來保證較高的靈敏度和穩定 性。 一般做膠體金檢測試紙條用的膠體金顆粒在20nm到50nm之間。過 大可見度高，但穩定性不是很好；過小又影響敏感性。在本發明中嘗試 過使用25nm和40nm的膠體金，在對不同的檢測對象中使用。例如參見 王俊紅，康林."蓖麻毒素及其檢測"，中國檢驗衛生雜誌，2007年2月 第17巻第2期。膠體金顆粒大小對檢測試紙條的影響很大，而它的顆粒 大小要靠還原劑來調節。具體是氯金酸在還原劑如檸檬酸三鈉、枸櫞 酸鈉等作用下，聚合成特定大小的金顆粒。利用它在鹼性環境中帶負電 荷的性質，與蛋白質的正電荷基團借靜電吸引而形成牢固結合。用於標 記的蛋白質多為抗體，我們選用純化的抗體作為金標的標記蛋白。另夕卜， 在噴膜時，抗體需要加入封閉劑，如果不加在檢測陰性時會出現非特異 性，噴膜完畢應立即將NC膜^t^烘箱以免T、 C線發生擴散。本發明的目的是提供一種方便、快捷地檢測蓖麻毒素的試紙，同時 可利用金標免疫分析儀進行的半定量檢測方法。該試紙的工作原理是利 用特異性抗原-抗體的結合，用膠體金標記抗體，與待檢抗原結合後， 使與試紙上結合的捕獲抗體顯色。本發明還涉及製備上述檢測試紙的制 備方法。
本發明能夠基於一份標本和一個試紙，快速方便地檢測出標本中的 蓖麻毒素，節省了大量人力物力，方便、快速、簡捷。
一種方便、快捷地檢測蓖麻毒素的方法，其中包括將待測標本與樣品稀 釋液混勻，再將樣品混合液加入試紙樣品孔處，樣品中的液體依靠虹吸
作用上行，10-15分鐘判讀結果；所述檢測試紙包括 (1)反應支持物； (2 )吸水墊；
(3 )硝酸纖維膜，該膜包被有重組蓖麻毒素A鏈抗體和質控抗體的 檢測條帶和質控條帶；
(4 )金標抗體保護膜，其中含有膠體金標記的重組蓖麻毒素A鏈抗
體；
(5 )樣品墊；
其中反應支持物為PCV板，吸水墊為濾油紙，硝酸纖維膜依次包被 羊抗鼠IgG、兔抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體lmg/ml，金標抗體保護 膜為含有膠體金標記的鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體玻璃纖維膜或 聚脂膜或濾紙纖維，樣品墊選用玻璃纖維膜或聚脂膜或濾紙纖維。
本發明方法中涉及的蓖麻毒素的檢測試紙，其中吸水墊、硝酸纖維 膜、金標抗體保護膜、樣品墊和反應支持物按照附圖1所示方式構成； 反應支持物5位於底層，硝酸纖維膜2位於反應支持物5上的中部，該 膜的T處是蓖麻毒素RCA SigmA檢測條帶，並且C處是羊抗鼠IgG包被 的質控條帶；玻璃纖維膜3位於硝酸纖維膜上部的一側並與之部分重疊， 該膜含有膠體金標記的蓖麻毒素兔抗ricin A多克隆抗體；吸水墊1位 於硝酸纖維膜2上部的相對於玻璃纖維膜3而言的另一側並與2部分重 疊。樣品墊4位於2上與1相反的一側並與3部分重疊。
本發明方法中涉及的蓖麻毒素的檢測試紙，以吸水墊一側為起始端， 樣品墊一側為末端，蓖麻毒素RCA SigmA的檢測條帶位於接近末端，羊抗鼠IgG包被的質控條帶接近於起始端。
本發明再一個目的是提供製備所述檢測蓖麻毒素的試紙的方法，該 方法包括以下步驟膠體金探針的製備，金標墊的製備，硝酸纖維膜的 噴塗包被。
1、 膠體金探針的製備
(1)將HAuC14先配製為0. 01%水溶液。磁力攪拌下準確加入l ml 1% 的HAuC14,同時加入l. 5-3ml 1%的檸檬酸三鈉水溶液。顏色穩定後繼續 加熱，冷卻至室溫後加純水補足至IOO ml, 4 。C避光保存。
(2 )用K2C03調PH值為約7-9，優選為約7. 8 - 8. 9，更優選約8. 2-8. 5。
(3) 將膠體金調至pH 8.2-8.5，，用5 mM PB (pH 7.2)稀釋抗體 至O. 2 mg/ml。
(4) 保持膠體金穩定。
本發明還在於提供一種獲得維持膠體金穩定的抗體最佳標記劑量的 方法，該方法包4舌
a. 取10支潔淨的1.5 ml離心管，分別加入膠體金溶液lml。
b. 在I-IO號管內分別加入IO ml、 20 ml、 30 ml、 40 ml、 50ml、 60 ml、 70 ml、 80 ml、 90 ml、 100ml的PBS，再依次加入稀斧仔的O. 2 mg/ml 的待標記抗體90 ml、 80 ml、 70 ml、 60 ml、 50 ml、 40 ml、 30 ml、 20 ml、 10 ml、 0 ml,混勻，靜置2分鐘。
c. 在10個管內分別加入10。/。 NaCl溶液IOO ml，混勻後室溫靜置2小 時，^L察顏色變化。
未加抗體及加入量不足以穩定膠體金的試管中的液體顏色呈現由紅 變藍的變化，而加入抗體量達到或超過最低穩定劑量的試管則保持紅色 不變。與對照管(1號管)相比，顏色最接近、含抗體劑量最低的試管 所含的抗體劑量，即為l ml膠體金所必須的抗體穩定劑量，在此基礎上 再加20。/。抗體，即為抗體最佳標記劑量。本發明經過反覆試驗和分析，得 出的結果表明維持膠體金溶液適宜抗體量為2-10ug,優選抗體量5-9ug,更優選6. 2-8. 2ug，最優選為7. 2ug。
2、 金標墊的製備
取上述pH的膠體金以lml/管分裝於1. 5 ml的離心管中。每支管中 加入3 - 8 ug標記劑量，優選抗體量4-6 ug，更優選4. 5-5. 5 ug,最優
7選為5ug的抗體，輕搖混勻後放置。每管中加入10°/。的BSA100 ul，混 勻放置。將上面初步製得的膠體金4採針在12000 rpm、 4"C下離心30分鐘， 棄上清液。每支離心管中加入l ml重懸液懸浮沉澱後同上離心。棄上清 液，管底得到暗紅色的疏+>狀沉澱，加入500 ul重懸液重懸後於4 °C, 1000 rpm，離心10分鐘；取上清液，均勻滴加在lcm寬的玻璃纖維上， 37'C乾燥。
3、硝酸纖維膜的噴塗包被
(1) 利用隔流噴金劃線機以50mm/s的噴膜速度包被檢測蓖麻毒素RCA SigmA和質控羊抗兔IgG兩個條帶的硝酸纖維膜；
在該噴塗包^皮膜的步驟中，噴膜速度優選是10-100mm/s，更優選是 45 - 55mm/s，最優選是50mm/s;所述蓖麻毒素RCA SigmA，其加入量為 l-5mg/ml，該多克隆抗體的稀釋液可以為PB;質控羊抗鼠IgG可以購自鼎 國生物技術公司，其濃度為O. 1-5 mg/ml更優選是0. 5-2. 5 mg/ml，最優 選為lmg/ml;
(2) 製備一種含有膠體金標記的蓖麻毒素兔抗ricin A多克隆抗體 的玻璃纖維膜，將膠體金標記的蓖麻毒素兔抗ricin A多克隆抗體均勻 塗布在玻璃纖維膜上。抗體用PB稀釋，pH為7-9,優選7. 5-9，最適 PH值為8. 5。
本發明還公開了所述試紙在檢測蓖麻毒素型中的應用，參見附圖2。
在本發明檢測蓖麻毒素的方法中，先將待測標本放入裝有稀釋液的 小瓶內，再用移液器將樣品混合液加入試紙"4"處(即末端)，樣品中 的液體依靠虹吸作用上行， 一般需10-15分鐘判讀結果
如標本中含有蓖麻毒素，則它將與試紙上膠體金標記的蓖麻毒素RCA SigmA形成相應的複合物，液體展開上行並與硝酸纖維膜上的蓖麻毒素 RCA SigmA結合，形成紅色線條，即在"T，，處形成紅色條帶。
無論是否含有相對應的抗原，膠體金標記多克隆抗體繼續隨液體繼 續上行並與該膜上的羊抗鼠IgG形成紅色沉澱線，即在"C"處形成紅色 條帶。此線是質控線，如膠體金失效，此線就不會出現，說明試紙失效。 如圖5所示。
陽性結果會出現2條紅色沉澱線，陰性結果出現l條紅色沉澱線，如 不出現線條沈明試紙失效。如若肉眼無法辨別T處紅色條帶，可利用金標免疫分析儀進行半定量檢測。
本發明的技術方案是採用蓖麻毒素RCA SigmA多克隆抗體、和羊抗 鼠IgG分別固相於硝酸纖維膜上，結合膠體金標記的蓖麻毒素兔抗ricin A 多克隆抗體，應用膜層析雙抗體夾心法的原理檢測標本中的蓖麻毒素。
本發明還提供一種將膠體金測試條與膠體金生物傳感器有機整合的 膠體金定量檢測系統。運用膠體金測試條判讀儀的優勢在於，判讀儀能 夠在人眼無法正確識別可疑物檢測是否存在陽性的情況下，正確判讀該 試紙條檢測結果。減少了因人為主觀判讀帶來的錯誤率，增加了客觀性、 準確性；並且可實現定量檢測。此外，膠體金判讀儀攜帶方便、使用簡 單、判定準確、結果客觀、易保留，為檢驗檢驗工作帶來了方便。
本發明採用兔抗蓖麻毒素A抗體(RTA2-G)、兔抗SEB抗體，其可以 由軍事醫科院微生物流行病研究所提供，所用的蓖麻毒素抗體(RCA)可購 自美國Sigma公司，所用的羊抗兔IgG可購自鼎國生物技術公司。
本發明所述的方法和產品中使用層析測試條耗材，耗材例如是玻璃 纖維的結合墊，》肖酸纖維素膜(例如NC膜，SHF 1350225)，樣品墊及吸 水墊、濾紙，可購自Minipore7^司。
本發明涉及的上述蓖麻毒素的檢測試紙，它還包含金標抗體保護膜。
本發明涉及的上述蓖麻毒素的檢測試紙，其中反應支持物選用PVC板。
本發明涉及的上述蓖麻毒素的檢測試紙，其中吸水墊選用濾紙。 本發明涉及的上述蓖麻毒素的檢測試紙，其中金標抗體保護膜選用 聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。


圖1是蓖麻毒素膠體金免疫層析試紙條的目測敏感性。1-7分別表示 檢測的樣品濃度依次為空白對照、0. 4625^g/ml、 0. 925ng/ml、 1. 85ng/ml、 3. 7ng/ml、 7. 4ng/ml和14. 8ng/ml。
圖2為特異性檢測試驗。1表示蓖麻毒素，2表示BSA， 3表示胰蛋 白腖，4表示牛奶，5表示相思子，6表示相思子毒素，7表示空白對照。
圖3為蓖麻毒素膠體金免疫層析試紙條穩定性檢測；其中l表示蓖 麻毒素1. 85ng/ml， 2表示BSA， 3表示胰蛋白腖，4表示空白對照。圖4A是本發明試紙的正面示意圖；圖4B本發明試紙的側面示意圖。 其中，圖4A和圖4B: 1:吸水墊；2:硝酸纖維膜，T:包被兔抗蓖麻毒 素A多克隆抗體檢測條帶；C:包被羊抗鼠IgG的質控條帶；3:含有膠 體金標記鼠抗重組相思子毒素A鏈多克隆抗體多克隆抗體的玻璃纖維膜； 4:樣品墊；5:反應支持物。
圖5是本發明的檢測結果示意圖；T、 C兩條線陽性；C 一條線陰性； 無效。
具體實施例方式
實施例l:膠體金免疫層析試紙條的製備
材料和方法
1、 抗原及抗體
兔抗ricin A抗體(RTA2-G )、兔抗SEB抗體由軍事醫科院^:生物 流行病研究所提供。蓖麻毒素抗體(RCA)購自美國Sigma公司。羊抗兔IgG (購自鼎國生物技術公司)
2、 層析測試條耗材
結合墊(玻璃纖維)、硝酸纖維素膜(NC膜，SHF 1350225)、樣品墊及 吸水墊、濾紙購自Minipore7厶司。
3、 實驗儀器
金標免疫分析儀可購自中國科學院上海光學精密機械研究所、中國 檢驗檢疫科學研究院聯合研製的分析儀。
4、 膠體金免疫層析試紙條的製備 4. 1膠體金結合墊
將pH值8. 0-8. 5、濃度0. 2mg/ml的蓖麻毒素兔抗ricin A多克隆 抗體標記於檸檬酸鈉法製備25nm的膠體金顆粒的膠體金顆粒，37'C乾燥 [7]。
4. 2 ^:肖酸纖維素膜
檢測帶RCA SigmA 2mg/ml +1. 5°/。BS4質控帶羊抗鼠IgG: lmg/ml， 37。C乾燥(參見文獻OlsensS. "he history of ricin， abrinand related toxins" Toxicon， 2004， 44 (4): 361-370;王景林."麻毒素生物恐怖及 其醫學防護，，科技導報，2003,7: 35-37; Patocka J. Abr in and icin: twodangerouspoisonousproteins. available at
http: //www. asabktr. cin/newsletter/01~4/article
m/Abrin&RicinRev. pd. f; Grabar KC， Freeman RG， Hommer MB, etal.
Preparation and characterization of Au colloid mon&layers [J].
Anal Chem, 1995， 67: 735~743 )。
4. 3組裝
將樣品墊、結合墊、吸水墊依次貼在帶有豁合劑的底襯卡，切成0. 4cm 的條，乾燥，裝殼，室溫貯存備用(參見上述文獻)。
實施例2:樣品的定性和定量檢測的判定
1、樣品的處理
用樣品處理液(5mM PB pH7. 4)將火腿腸、奶粉、牛奶等粘稠液體 樣品進行梯度稀釋，火腿腸等固體食品按1/100 (W/V)加入樣品處理液 溶解，靜止取上清，靜止取上清。分別添加不同劑量的蓖麻毒素作為模 擬檢測樣品。 2定性檢測
將處理後的樣品和樣品處理液(作為陰性樣品)lOOul加到製備好的 層析條樣品墊端，靜置15min，觀察結果。檢測帶和質控帶均出現紅色判 為陽性，僅質控帶出現紅色為陰性，檢測帶和質控帶均不顯色，則為試 紙條失效。 3、定量檢測
3. 1判定值(CUT-OFF)的確定
按1. 6. 1將陰性樣品檢測20次，用金標免疫分析儀掃描讀取信號T/C 比值。20個樣品T/C比值的平均值(AVERAGE)與3倍標準差(STDEVA)之和 為CUT-OFF值。 3. 2定量檢測判定
將顯色後的金標條放入金標免疫分析儀掃描，讀取信號T/C比值， 大於判定值為陽性。
實施例3:靈敏度試驗
1、定量檢測的靈敏度檢測不同濃度蓖麻毒素，經過計算判定值(CUT-OFF)為0.037,濃 度為0. 925pg/ml的蓖麻毒素的平均T/C比值分別為的值均高於0.037 結果為陽性；當蓖麻毒素濃度大於103cfu/ml時，T/C比值平均值大於 0. 037，故定量檢測靈敏度為0. 925pg/ml。
表1蓖麻毒素膠體金免疫層析試紙條各濃度檢測結果
檢測值T ( V )質控值C ( V ) T/C 結
樣品濃度TlT2CIC2T/ClT/C2T/C 平果 判 讀
00. Oil0. 0071. 11. 1010. 0100—
0. 925pg/ml0. 1280. 0130.5500. 7230. 230. 010. 012+
1.85ng/ml0. 0260. 0220.670.4160. 030. 040. 035+
3. 7|ig/ml0. 0250. 0260. 5230. 5220. 040. 050. 05+
7. 4pg/ml0. 0320. 0330.6170. 5540. 050. 060. 055+
14. 8ng/ml0. 0540. 0560. 7290. 6800. 070. 080. 075+
2、 直觀檢測靈敏度評價
按確定的最佳反應條件製備膠體金免疫層析試紙條，檢測不同濃度 的蓖麻毒素。將蓖麻毒素用樣品處理液稀釋成濃度依次為濃度依次為 14. 8ng/ml、 7. 4|ig/ml、 3. 7ng/ml、 1. 85ng/ml、 0. 925pg/ml、 0. 4625ng/ml 同時進行檢測。
結果如圖1所示，直接目測的靈敏度l^g/ml顯色更加清晰。
3、 樣品實用性檢測
火腿腸50 mg、奶粉50 mg、牛奶250 ju 1，分別加入到1 ml蓖麻毒素 的樣品稀釋液中，混勻，靜置10 min ，再取1份天然毒素，用PB2倍系列 稀釋進行檢測。試紙條檢測模擬汙染樣品試驗的結果表明，該試紙條檢測 食品中模擬汙染的蓖麻毒素仍然能檢測到1. 85pg/ml。
實施例4:特異性試驗
按確定的最佳反應條件製備膠體金免疫層析試紙條，以樣品稀釋液 同樣分別處理金BSA、胰蛋白腖、奶粉、相思子、相思子毒素、蓖麻天然毒素，以製備好的膠體金免疫層析試紙條檢測，並與同樣菌數的蓖麻毒
素樣品對照，同時檢測空白對照。結果如圖2所示，該檢測試紙條對於 這些蛋白及毒素均無非特異現象出現，對蓖麻毒素特異性檢測效果良好。
實施例5:標準曲線擬合
以濃度為橫坐標，以T/C比值為縱坐標擬合曲線為，擬合標準曲線 (參見圖2)。
檢測蓖麻毒素各個濃度下，經計算判定值(CUTOFF)為0. 037的T/C 讀值。可見小於0. 925ng/ml為陰性，l^ig/ml —14. 8ng/ml線性關係良好， 擬合曲線見圖2。線性方程為y = 0. 003x + 0. 037 ; R2 = 0. 9861。
實施例6:回收率試驗
在線性檢測範圍內，檢測已知濃度的蓖麻毒素，根據金標分析儀讀 值T/C比值和標準曲線計算出檢測濃度，檢測濃度與理論濃度的比值百 分率為回收率。由表2可見，以蓖麻濃度濃度14. 8ng/ml、 7. 4pg/ml、 3. 7ng/ml、 1. 85ng/ml和T/C值根據擬合曲線方程來計算回收率，可見 3. 7一14. 8之間回收率在96°/ 一117%之間，理論濃度1. 85ng/ml時回收率專交 低。
表2蓖麻毒素膠體金免疫層析試紙條檢測系統回收率_
伊號值
。， 理論濃度值 檢測值 回收率 T/C_
0.08 14.8pg/ml 14. 33pg/ml 96.8%
0.06 7.4ng/ml 7.67pg/ml 103.6%
0.05 3. 7ng/ml 4.33ng/ml 117.1%
0. 04 1. 85pg/ml lpg/ml_54. 1%_
實施例7:穩定性試驗
參見圖3,取在37 x:放置的蓖麻毒素膠體金檢測試紙條進行檢測，
第7 d的檢測結果可見蓖麻毒素測試條的穩定性良好，在37 。C放置7 d後仍能特異性的檢出蓖麻毒素，而且敏感性也未下降。和新製備的檢測 試紙條相比，靈敏度沒有明顯下降，且特異性良好。
權利要求
1、一種方便、快捷地檢測蓖麻毒素的方法，其中包括將待測標本與樣品稀釋液混勻，再將樣品混合液加入試紙樣品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用上行，10-15分鐘判讀結果；所述檢測試紙包括(1)反應支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有重組蓖麻毒素A鏈抗體和質控抗體的檢測條帶和質控條帶；(4)金標抗體保護膜，其中含有膠體金標記的重組蓖麻毒素A鏈抗體；(5)樣品墊；其中反應支持物為PCV板，吸水墊為濾油紙，硝酸纖維膜依次包被羊抗鼠IgG、兔抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體1mg/ml，金標抗體保護膜為含有膠體金標記的鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體玻璃纖維膜或聚脂膜或濾紙纖維，樣品墊選用玻璃纖維膜或聚脂膜或濾紙纖維。
2、 根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測試紙的構成為反應支持 物(5 )位於底層，硝酸纖維膜(2 )位於反應支持物(5 )上的中部，該 膜的T處是蓖麻毒素RCA SigmA檢測條帶，並且C處是羊抗鼠IgG包被 的質控條帶；金標抗體保護膜(3)位於硝酸纖維膜上部的一側並與之部 分重疊，該膜含有膠體金標記的蓖麻毒素兔抗ricin A多克隆抗體；吸 水墊(1)位於硝酸纖維膜(2 )上部的相對於金標抗體保護膜(3 )而言 的另一側並與硝酸纖維膜(2)部分重疊，樣品墊(4)位於硝酸纖維膜(2 )上與吸水墊(1)相反的一側並與金標抗體保護膜(3 )部分重疊。
3、 根據權利要求2所述的方法，吸水墊一側為起始端，樣品墊一側為末 端，蓖麻毒素RCA SigmA的檢測條帶位於接近末端，羊抗鼠IgG包被的 質控條帶接近於起始端。
4、 根據權利要求l所述的方法，其中，所述質控抗體根據金標抗體的免疫源可選羊抗鼠IgG。
5、 根據權利要求1所述的方法，其中，所述兔抗重組蓖麻毒素A鏈多克 隆抗體標記lml膠體金的量為8 - 15 ug。
6、 根據權利要求1所述的方法，其中，所述鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多克 隆抗體的標金濃度為12ug /ml,用5mM PB稀釋，PH值為8.2。
7、 一種權利要求1-6任一項所述方法中的炭疽芽孢桿菌的檢測試紙的 製備方法，該方法包括(1)用隔流噴金劃線機以一定噴膜速度噴塗抗蓖麻毒素抗體和質控 抗體兩個條帶的硝酸纖維膜；(2 )製備一種含有膠體金標記的抗重組蓖麻毒素抗體的金標抗體保 護膜，將膠體金標記的抗重組蓖麻抗體均勻塗布在玻璃纖維膜上，並烘 幹或冷凍乾燥，製成金標抗體保護膜。
8、 根據權利要求7所述的製備方法，其中，在噴塗包被膜的步驟中，噴 膜速度優選是10 - 100mm/s;所述兔抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體，其 加入量為l-5mg/ml，該多克隆抗體的稀釋液可以為5mM PBS;根據權利 要求8所述的製備方法，其中，質控羊抗鼠IgG的濃度為0. 1-5 mg/ml。
9、 根據權利要求8所述的製備方法，其中，將膠體金標記的兔抗重組蓖 麻毒素A鏈多克隆抗體均勻塗布在玻璃纖維膜上，其中pH為7-9。
10、 由權利要求7 - 9任一項所述的方法製備的檢測蓖麻毒素的試紙。
全文摘要
本發明利用膠體金標記和雙抗體夾心免疫層析技術，建立蓖麻毒素的快速檢測方法，建立的檢測蓖麻毒素的膠體金免疫層析方法，能快速、靈敏、特異、準確地檢測樣品中的蓖麻毒素，並可實現定量，適用於現場快速檢測。
文檔編號G01N33/558GK101609091SQ200910090038
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月29日 優先權日2009年7月29日
發明者孫肖紅, 張曉龍, 宇 楊, 靜 王, 王景林, 聰 聶, 胡孔新, 姍 高 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院