一種HBV病毒rtN236T突變的螢光擴增檢測試劑盒的製作方法

2023-10-05 16:55:54 1

專利名稱：：一種HBV病毒rtN236T突變的螢光擴增檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種快速而且方便的HBV病毒rtN236T突變的雙色螢光PCR擴增檢測試劑盒。
背景技術：
：B型肝炎病毒(HBV)流行世界各地，估計全球有20億人感染，其中慢性感染者3.5億，我國約佔半數，全球每年約有120萬人死於HBV感染。此種感染最終可發展為肝硬化、肝癌，是當前WH0公布的人類疾病死亡原因中居第9位的疾病。因此針對HBV的抗病毒治療受到廣泛重視。隨著對HBV聚合酶的結構和功能的深入認識，一些有效抑制HBVDNA複製的核苷類藥物(如拉米夫定LAM、阿德福韋ADV)逐步成為抗HBV治療的新選擇。由於HBV聚合酶如同其他逆轉錄病毒的逆轉錄酶一樣具有較高的錯配傾向且缺乏校對能力，因此隨著感染的持續病毒準種逐年增多，在核苷類藥物的選擇壓力下，耐藥變異株將逐漸增多，最終替代野生株成為優勢株，從而導致臨床耐藥現象的出現。拉米夫定是L-核苷類似物，曾經是治療B型肝炎的最有效的藥物，已在全球廣泛使用，在中國已成為銷量最大的處方藥。但拉米夫定的藥發生率非常高，在治療l年時，耐藥發生率約為14%32%，治療時間延長耐藥發生率升高，治療5年時耐藥發生率達到60%70%。而阿德福韋耐藥變異位點集中於P基因D區rtN236T和(或)B區rtN236T，與拉米夫定無交叉耐藥現象。阿德福韋耐藥發生率相對拉米夫定耐藥要低得多，阿德福韋治療HBeAg陰性慢性B肝的III期臨床試驗結果顯示，治療1、2、3、4、5年時累積的基因型耐藥發生率約為0、3%、11%、18%和29%。因此，阿德福韋已越來越多的被應用於HBV的抗病毒治療中，通常與其他藥物進行聯合用藥。目前，國內外尚無快速、靈敏的檢測阿德福韋耐藥突變的技術和產品，通常使用基因測序的方法進行突變檢測，但一方面，測序反應靈敏度低導致假陰性率較高。另一方面，由於HBV耐藥株與敏感株常共存於患者血清中，對於HBV耐藥突變基因的檢測，該方法有致命的缺陷。椐了解，當耐藥株低於50%時，隨耐藥毒株比例的下降，基因測序的假陰性率迅猛增高，通常不能對低於20%的突變基因進行檢測。國內外，均有人使用ntPCR-RFLP的技術對rtN236T位點突變進行檢測，但該技術操作複雜、耗時長且價格昂貴又容易造成PCR產物汙染，無法進行推廣和臨床應用。T叫ManPCR技術作為一種快速診斷技術，具有特異性高、靈敏度高、操作簡便且價格較便宜等優點，已在科研和臨床上得到廣泛的應用。使用特異性探針雜交的方法結合常規T叫Man技術進行rt236基因突變檢測設計，由於rt236位點附近為非保守區，多個位點存在非耐藥性變異，因此，TaqManPCR技術容易導致假陽性率或假陰性率的發生，同時也不利於設計引物或探針，並且與測序技術一樣無法對病毒的共生關係進行準確判斷。本發明對傳統TaqManPCR技術進行了巧妙改進，不僅可對rt236T變異的病毒DNA進行定性分析，同時，在同一個PCR管內完成了rt236N野生株的定性檢測。
發明內容本發明的目的是提供一種快速、簡便的HBV病毒rtN236T突變的螢光PCR擴增檢測試劑盒。1、為達到上述目的，本發明採用的技術方案是使用一對特異性引物和一對特異性探針，擴增目標片段長度為132bp，引物序列為引物1:5—-GTACAACATCTTGAGTCCCTTTT-3—(SeqNo.1)引物2:5—-CCAACTTCCAATTACATATCCC-3—(SeqNo.2)或者上述弓I物序列的互補序列，或者上述序列同源性大於75%的序列。設計的兩條探針方向相反，除突變檢測位點和3'端外(突變檢測位點序列可互補，也可不互補，根據檢測要求決定)其餘區域互補；探針1和探針2的Tm值相近，同時也與兩條引物的Tm值相近(相互間的差異均小於3tO，兩條探針的3'端除互補序列外均延伸2-4個鹼基；根據T與G可形成2價離子鍵而配對的原理，在用於突變型基因檢測的正向探針(探針1)此處設計成"ACT"，而用於突變病毒檢測的反向探針(探針2)設計成"GTT"。探針1與rt236T基因序列互補，探針2與rt236N基因序列互補，分別用於檢測變異株(rt236T)和野生株(rt236N)，探針序列為探針1:5—-CATACATTTGACTCCTAACAAAACC-3—(SeqNo.3)探針2:5—-TTGTTAGGGTTTAAATGTATGCC-3—(SeqNo.4)或者上述弓I物序列的互補序列，或者上述序列同源性大於75%的序列。上述的HBV病毒rtN236T突變的螢光定量PCR擴增檢測試劑盒，探針的螢光發光基團為可標記為麗、TET、J0E、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、RhodamineGreen、Rhodamine6G、OregonGreen488、OregonGreen500、OregonGreen514、TexasRed、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridineorange、或R0X中的任意兩禾中組合；螢光淬滅基團為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一種或一種以上的組合。上述的HBV病毒rtN236T突變的螢光定量PCR擴增檢測試劑盒，採用多色螢光PCR檢測技術，在一個反應管內同時對rt236N和rt236T突變的HBVDNA進行定性檢測。2、上述的HBV病毒rtN236T突變的螢光定量PCR擴增檢測試劑盒，PCR反應組成成份包括10mMTris-HCl(PH8.3)、50mMKCl、300iiMd(AGC)TP、300iiMdUTP、5mMMgCl2、200nM引物1、200nM引物2、200nM探針1和200nM探針2、1UTaq酶、0.05UUNG酶。按如下程序進行實時螢光PCR檢測；反應管先在5(TC反應2分鐘，然後95t:保溫5分鐘，再按94°C20秒一60°C35秒循環40次(6(TC退火條件下同時採集相應探針標記通道的螢光)。本發明與現有HBV病毒DNArtN236T突變檢測方法及傳統的T叫Man技術相比，具有以下有益的技術效果(1)與傳統的T叫Man技術相比縮短探針的長度，使Tm值下降至與引物相近，以增強探針對突變位點的特異性，同時保證了靈敏性。傳統的T叫Man技術要求探針的Tm值相對引物高6-l(TC，是為了保證探針比引物優先與模板退火雜交，以防止引物快速延伸至探針結合部位而阻止探針的結合，從而降低靈敏度，但這種設計使得探針對模板的選擇特異性較低，根本不能鑑別單個鹼基的突變。本發明通過探針濃度的調節保證了較高的靈敏度，可實現對1000copies/ml的突變DNA進行檢測，另外，本發明設計的兩條探針為反向序4列，分別與模板的正反鏈結合，不存在競爭關係，不會降低靈敏度。由於探針的Tm值與引物相近，通過優化退火溫度和提高反應條件的特異性，探針能與完全配對的模板進行雜交，通過引物的延伸的酶切產生螢光擴增信號，而不能與發生變異的模板雜交，從而不產生螢光擴增信號。(2)與其他技術相比本發明在一個反應管內實行了全部的檢測，從HBV病毒核酸提取到檢測完畢，僅需要2個小時，操作非常簡單，且產物不開蓋，不會發生PCR產物的汙染。並且本發明通過設計人工模板製作標準曲線，可以對突變病毒的核酸進行定量分析，ntPCR-RFLP和測序技術均不能得到定量的結果。另外，本發明同時完成rt236位點兩種基因類型的檢測。本發明提供一種準確快速對HBV病毒rtN236T突變進行螢光定量檢測的技術。同時本發明還可用於其他基因突變的檢測。具體實施例方式設計和製備引物、探針序列(針對HBVDNAP基因相關序列設計，GeneBank序列號為AF182802，下同)引物1:5—-GTACAACATCTTGAGTCCCTTTT-3—(SeqNo.1)引物2:5—-CCAACTTCCAATTACATATCCC-3—(SeqNo.2)探針1:5—FAM-CATACATTTGACTCCTAACAAAACC-BHQ1-3—(SeqNo.3)探針2:5—TET-TTGTTAGGGTTTAAATGTATGCC-BHQ1-3—(SeqNo.4)上述引物和探針均在寶生物工程(大連)有限公司合成。HBV病毒rtN236T突變的螢光擴增檢測試劑盒的組成為(20人份)組成成份名稱體積提取液A1ml提取液B1mlPCR反應緩衝液460ii1PCR反應酶40ii1陽性對照品150ill陽性對照品250ill陰性對照品50ill其中，PCR反應緩衝液(使用終濃度)包括10mMTris-HCl(PH8.3)、50mMKCl、300iiMd(AGC)TP、300iiMdUTP、5mMMgCl2、200nM引物1、200nM引物2、200nM探針1和200nM探針2;PCR反應酶(終濃度)包括:1UTaq酶、0.05UUNG酶；陽性對照品1為rt236T突變型HBVDNA臨床血清，陽性對照品2為rt236N野生型HBVDNA臨床血清，陰性對照品為HBVDNA陰性的血清。試劑盒的操作步驟如下(1)病毒核酸提取取待測血清樣本及陽性和陰性對照品各50iU，加入50ill核酸提取液A。振蕩混勻15s。13，000rpm離心10min，棄上清。加入充分混勻的核酸提取液B50iU，振蕩混勻，IO(TC水浴lOmin，13，OOOrpm離心3min。取上清供PCR擴增用。(2)螢光PCR反應液的配製5按每人份PCR反應緩衝液23ul、PCR反應酶2ul的配方配製PCR反應液，並按25ul/管分裝到0.2mlPCR管中，然後加入5ul待檢的核酸提取產物，按如下程序進行實時螢光PCR檢測反應管先在5(TC反應2分鐘，然後95t:保溫5分鐘，再按94°C20秒一60°C35秒循環40次(6(TC退火條件下同時採集FAM和TET通道螢光)。(3)質量監控與結果分析tableseeoriginaldocumentpage6根據儀器分析的結果，在如下情況視實驗有效FAM通道，陽性對照品1的Ct值<35，TET通道，陽性對照品2的Ct值<35。陰性對照品Ct值均4〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1gtacaacatcttgagtccctttt〈210>2〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2ccaacttccaattecatetccc〈210>3〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3catecatttgactccteacaaaacc6〈210>4〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4ttgttegggttteaatgtatgcc2權利要求一種HBV病毒rtN236T突變的螢光擴增檢測試劑盒，其特徵在於包含一對特異性引物和一對特異性探針，擴增目標片段長度為132bp，引物序列為引物15`-GTACAACATCTTGAGTCCCTTTT-3`(SeqNo.1)引物25`-CCAACTTCCAATTACATATCCC-3`(SeqNo.2)或者上述引物序列的互補序列，或者上述序列同源性大於75％的序列。設計的兩條探針方向相反，除突變檢測位點和3』端外(突變檢測位點序列可互補，也可不互補，根據檢測要求決定)其餘區域基本互補；探針1和探針2的Tm值相近，同時也與兩條引物的Tm值相近(相互間的差異均小於3℃)，兩條探針的3』端除互補序列外均延伸2-4個鹼基；探針1與rt236T基因序列互補，探針2與rt236N基因序列互補，分別用於檢測變異株(rt236T)和野生株(rt236N)，探針序列為探針15`-CATACATTTGACTCCTAACAAAACC-3`(SeqNo.3)探針25`-TTGTTAGGGTTTAAATGTATGCC-3`(SeqNo.4)或者上述引物序列的互補序列，或者上述序列同源性大於75％的序列。2.根據權利要求1所述的HBV病毒rtN236T突變的螢光擴增檢測試劑盒，其特徵在於標記探針的螢光發光基團可為FAM、TET、J0E、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、RhodamineGreen、Rhodamine6G、OregonGreen488、OregonGreen500、OregonGreen514、TexasRed、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridineorange、或腿中的任意兩種組合；螢光淬滅基團為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-l、BHQ-2或BHQ-3中的任意一種或一種以上的組合。3.根據權利要求1所述的HBV病毒rtN236T突變的螢光擴增檢測試劑盒，其特徵在於採用多色螢光PCR檢測技術，在一個反應管內同時對rt236N和rt236T突變的HBVDNA進行定性檢測。4.根據權利要求1所述的HBV病毒rtN236T突變的螢光擴增檢測試劑盒，其特徵在於，PCR反應體系包括10mMTris-HCl(PH8.3)、50mMKCl、300iiMd(AGC)TP、300iiMdUTP、5mMMgCl2、200nM引物1、200nM引物2、200nM探針1、1UTaq酶、0.05UUNG酶。根據權利要求1所述的HBV病毒rtN236T突變的螢光擴增檢測試劑盒，其特徵在於，可以按如下程序進行實時螢光PCR檢測反應管先在5(TC反應2分鐘，然後95t:保溫5分鐘，再按94°C20秒一60°C35秒循環40次(6(TC退火條件下同時採集相應探針標記通道的螢光)。全文摘要本發明涉及一種HBV病毒rtN236T突變的螢光擴增檢測試劑盒。本發明針對rtN236T變異(即236AAC/T→ACC/T突變)設計了一對引物和分別用兩種螢光染料標記的一對特異性探針，在單管內使用雙色螢光定量PCR技術實現了分別對野生株(rt236N)和突變株(rt236T)HBVDNA進行螢光擴增檢測。本發明技術能快速的對HBVDNArt236N和rt236T同時進行定性檢測。文檔編號C12Q1/70GK101760558SQ20081020164公開日2010年6月30日申請日期2008年10月23日優先權日2008年10月23日發明者何劍軍,吳大治,夏懿申請人:上海復星醫藥(集團)股份有限公司;上海復星醫學科技發展有限公司