胸腺素α的製作方法

2023-10-07 23:25:59

專利名稱：胸腺素α的製作方法
技術領域：
本發明涉及胸腺素α1聚乙二醇化衍生物，其製備方法，含它們的藥物組合物，及其在治療或預防與免疫缺陷、免疫功能低下相關疾病的藥物中的用途，包括包括在B型肝炎，C型肝炎，惡性黑色素瘤，非小細胞性肺癌，冠狀病毒引起的SARS(嚴重的急性呼吸綜合症)等相關疾病的治療或預防中的應用。
背景技術：
胸腺素α1(Tα1)是胸腺分泌的是一種重要的多肽，是一種針對T淋巴細胞的免疫增強劑，能促進T細胞的成熟和分化，並促使成熟的T細胞分泌多種淋巴因子(如白介素-2和γ-幹擾素等)，還能促進白介素-2受體的生成。Tα1由28個胺基酸殘基組成，分子量為3108，等電點為4.2，N-端含有乙醯化結構。Tα1的一級結構如下110Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-20 28Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OHTα1用於免疫缺陷或免疫受抑制的疾病的臨床治療研究始於20世紀80年代，目前已經取得了較好的效果。當單獨使用或與幹擾素配合使用治療慢性B型肝炎時，Tα1是一種安全有效的藥物。對於許多其它疾病，包括C型肝炎、非小細胞肺癌、黑色素瘤和愛滋病，Tα1都有一定的療效。另外，Tα1也可作為疫苗輔助藥，來加強流感疫苗和B型肝炎疫苗的效果。
目前臨床使用的Tα1為化學合成品，價格昂貴、用藥劑量大、周期長。因此，對Tα1進行結構修飾，增加其對酶或非酶環境的穩定性，延長作用時間及增加生物活性是十分必要的。

發明內容
本發明人經研究現已發現Tα1或其片段經聚乙二醇(PEG)共價修飾後可延長Tα1或其片段在體內的半衰期，從而在保持Tα1或其片段生物活性的同時，降低Tα1或其片段的用量並延長了Tα1或其片段的體內作用時間。
本發明涉及式(I)所示的Tα1或其片段的PEG化衍生物PEG-M-Cys-T (I) 或 或 其中PEG為RO(CH2CH2O)n-CH2CH2，R＝H或CH3，n＝5-1000。
Cys為半胱氨酸，其通過它側鏈硫醚原子與M基團共價相連；Cys還以其羧基與T的N-端氨基形成醯胺鍵相連或以其氨基與T的C-端羧基形成醯胺鍵相連，Cys位置包括位於T序列的兩端、任意兩相鄰胺基酸之間以及替代任意位置的胺基酸。
T表示天然Tα1全序列或含Tα1(17-24)序列的任意片段。
本發明再一方面涉及含至少一種式(I)化合物及藥用載體或賦形劑的藥物組合物。
本發明還涉及至少一種式(I)化合物在製備用於預防或治療與免疫缺陷或免疫功能低下相關疾病的藥物中用途，包括在B肝，C肝，惡性黑色素瘤，非小細胞性肺癌，冠狀病毒引起的SARS等相關疾病的治療或預防中的應用。
本發明還涉及製備式(I)化合物的方法，其包括將PEG-MAL，PEG-VS或PEG-IODO與HS-Cys-T反應。
根據本發明，在本發明中使用的縮寫詞具有下面的含義Tα1-胸腺素α1，PEG-聚乙二醇，PEG-MAL-馬來醯亞胺基聚乙二醇，PEG-VS-乙烯碸基聚乙二醇，PEG-IODO-碘代乙醯胺基聚乙二醇，
Ala-丙氨酸，Asn-天冬醯胺，Asp-天冬氨酸，Cys-半胱氨酸，Glu-穀氨酸，Ile-異亮氨酸，Lys-賴氨酸，Leu-亮氨酸，Ser-絲氨酸，Thr-蘇氨酸，Val-纈氨酸，Ac-乙醯基，Boc-叔丁氧羰基，Fmoc-芴甲氧羰基，DMF-二甲基甲醯胺，DCC-二環己基碳二亞胺，HBTU-2-(1H-1-羥基苯並三唑)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸，HOBT-1-羥基苯並三唑，HOSu-N-羥基琥珀醯亞胺，NMM-N-甲基嗎啡啉，TFA-三氟乙酸，Ts-Cl-對甲苯磺醯氯EDT-巰基乙醇，RP-HPLC-反相高效液相色譜，IFN-幹擾素。
本發明中所有胺基酸構型除註明為D-型外，均為L-型。
根據本發明，本發明所涉及的平均分子量由幾百到幾萬的PEG-OH可作為商品化試劑購買到，PEG-NH2可以購買或通過以下反應得到
將PEG-NH2分別與馬來酸酐、乙烯基氯化亞碸、碘代乙酸酐反應得PEG-MAL、PEG-VS和PEG-IODO。例如PEG-MAL通過以下反應得到 Tα1全序列或含Tα1(17-24)序列的任意片段可用常規的固相或液相多肽合成法合成，在合成過程中很容易在N-端或C-端引入一個Cys，將含Cys的肽鏈溶於水中，用碳酸氫鈉調pH7-8，加入3倍當量的PEG-MAL或PEG-MAL或PEG-VS和PEG-IODO室溫攪拌反應，用反相高效液相色譜純化得PEG修飾的Tα1或含Tα1(17-24)序列的片段。PEG-MAL修飾Cys-T的反應如下 本發明以平均分子量為750、2000和5000的CH3O-PEG-OH(mPEG-OH)為原料，合成了系列PEG的馬來醯亞胺衍生物(mPEG-MAL)。應用固相多肽合成法，分別在T的N-端和C-端引入一個半胱氨酸分子，將多肽從樹脂上裂解下來並經反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化得Cys-T和T-Cys-NH2。將Cys-T或T-Cys-NH2溶於水中，用碳酸氫鈉調pH7-8，加入3倍當量的mPEG-MAL，室溫攪拌反應，RP-HPLC監測反應進程。反應完成後，用RP-HPLC純化產物得到了平均分子量為750、2000和5000的mPEG-MAL修飾T的N-端和C-端的產物。各化合物經RP-HPLC分析為單一峰，經質譜和胺基酸組成分析表明結構正確。
本發明進一步涉及式(II)化合物[PEG-X-(CH2)mCO-Y]z-T (II)其中T表示天然Tα1全序列或含Tα1(17-24)序列的任意片段，X＝O、NH或NHCO，Y＝O或NH，m＝0-6，z＝1-11，並且T序列中任意位點的氨基或羥基可經一個或多個PEG分子共價修飾，如天然Tα1全序列中N-端去乙醯化後的氨基和14、17、19、20位賴氨酸側鏈氨基，1、8、9、位絲氨酸的側鏈羥基和7、12、13位蘇氨酸的側鏈羥基。
本發明進一步涉及式(III)化合物，T-[CO-Y-PEG]z (III)其中，T表示天然Tα1全序列或含Tα1(17-24)序列的任意片段，Y＝O或NH，z＝1-10，並且T序列中任意位點的羧基可經一個或多個PEG分子共價修飾，如天然Tα1全序列中C-端羧基，2、6、15位天冬氨酸的側鏈羧基和10、18、21、24、25、27位穀氨酸的側鏈羧基。
根據本發明，將PEG-OH或PEG-NH2先分別與光氣、草醯氯、C2-C8滷代酸、C3-C8二酸酐反應，再與HOSu反應得PEG-X-(CH2)mCOOSu(m＝0-6)。用固相或液相多肽合成法合成T。將T溶於水中，用碳酸氫鈉調pH7-8，加入適量的PEG-X-(CH2)mCO-OSu，室溫攪拌反應，可實現PEG對多肽的N-端氨基、Lys側鏈氨基、Ser或Thr側鏈基的羥基修飾。
根據本發明，在PEG的一端先引入氨基、羧基或製備PEG化修飾的胺基酸(如Fmoc-Lys(NH-COCH2-PEG)-OH、Fmoc-Glu(CO-NH-PEG)-OHFmoc-Asp(CO-NH-PEG)-OH)，再用液相或固相法偶聯到肽序列中去，可實現對多肽的N-端氨基、C-端羧基、Lys側鏈氨基、Asp或Glu側鏈羧基的修飾。
根據本發明，本發明的藥物組合物製成適用於哺乳動物用的各種劑型，例如用甘露醇作賦形劑製成注射劑。
根據本發明，本發明中所用術語「含Tα1(17-24)序列的任意片段」是指Tα1的17位-24位的胺基酸序列及17位-24位胺基酸序列兩端的增減，並優選下面序列R1-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-R2R1＝H、Leu、Asp-Leu、Lys-Asp-Leu、Thr-Lys-Asp-Leu、Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu。
R2＝H、Glu、Glu-Ala、Glu-Ala-Glu、Glu-Ala-Glu-Asn。
根據本發明，與免疫缺陷或免疫功能低下有關的疾病舉例有B型肝炎，C型肝炎，非小細胞肺癌，黑色素瘤或愛滋病，冠狀病毒引起的SARS。
具體實施例方式
實施例下述實施例代表本發明的說明性實施方案，但本發明不受這些實施例的限制。實施例所用平均分子量為5000的mPEG-OH為Sigma產品，固相合成載體Wang樹脂為ACT產品，TFA為ACROS產品，Rink醯胺樹脂、DCC、HOBT、HBTU、Fmoc-保護胺基酸為上海吉爾生化產品。
實施例1 Cys(mPEG5000-MAL)-Tα1的製備1.1 mPEG5000-MAL的合成稱取mPEG5000-OH 20g(4mmol)置於250ml反應瓶中，加入100mlCH2Cl2，固體溶解後再加入3.0ml Et3N(20mmmol)和3.8g Ts-Cl(20mmol)，室溫攪拌反應。TLC監測反應完全後，旋轉蒸發除去溶劑，加100ml無水乙醚沉澱出固體，得15.2g mPEG5000-OTs，收率70％。
將15g mPEG5000-OTs(3mmol)溶於30ml DMF，加入1.68g(18mmol)鄰苯二甲醯亞胺鉀鹽，120℃反應4小時。減壓蒸去溶劑，將殘餘物溶於50ml無水乙醇，加入2.0ml水合肼，回流反應4小時。旋轉蒸發除去溶劑，將殘餘物溶於30ml CH2Cl2，濾去不溶物，再將濾液旋轉蒸發除去溶劑，用無水乙醚沉澱出固體，得12.5g mPEG5000-NH2，收率83％。
將1.25g mPEG5000-NH2溶於20ml二氧六環中，加入馬來酸酐0.1g，80℃攪拌反應30min。減壓蒸去溶劑，加入50ml無水乙醚，冷卻沉澱出固體，濾集固體，乾燥後得1.10g。將所得固體溶於15ml乙酸酐，加入0.5g乙酸鈉，100℃攪拌反應45min。減壓蒸去溶劑，將殘餘物用二氯甲烷溶解，將濾液濃縮至幹，加入無水乙醚，沉澱出固體，濾集、乾燥後得淺黃色固體0.61g mPEG5000-MAL，收率48％。
1.2 Cys-Tα1的合成用固相法合成Cys-Tα1以0.5mmol Wang樹脂為固相載體，Fmoc-AA-OH(2.0mmol)作為原料，DCC(2.0mmol)-HOBT(2.0mmol)作縮合劑按Tα1的胺基酸序列合成全保護肽鏈，得2.9g Fmoc-Tα1-樹脂。稱取290mgFmoc-Tα1-樹脂(0.1mmol)，以20％哌啶/DMF脫除Fmoc後，用DCC(2.0mmol)-HOBT(2.0mmol)將Fmoc-Cys(Trt)-OH(2.0mmol)偶聯到樹脂上，再以20％哌啶/DMF脫除Fmoc後得Cys-Tα1-樹脂。將樹脂乾燥後，以EDT-間甲酚-TFA作裂解液，0℃反應90分鐘，濾除樹脂，將濾液旋轉蒸發除去TFA，加無水乙醚沉澱出白色固體，濾集固體，溶於水中，冰凍乾燥得白色乾粉120mg。RP-HPLC純化，FAB-MS分析，M+1峰3170(理論值3169)。
1.3 Cys(mPEG5000-MAL)-Tα1的合成將經RP-HPLC純化後的Cys-Tα1溶於水中，以碳酸氫鈉調pH至7-8，加入3倍當量的mPEG5000-MAL，室溫反應，用RP-HPLC監測反應進程和分離產物。
Cys(mPEG5000-MAL)-Tα1經MALDI-TOF-MS分析，在8350附近有一系列峰，相鄰兩峰分子量相差約44，具有聚乙二醇的典型結構特徵。酸水解(6N鹽酸水溶液，110℃，22小時)的胺基酸組成比例分析與理論值相符Asp，4.00(4)；Thr，2.81(3)；Ser，2.75(3)；Glu，6.57(6)；Ala，3.00(3)；Val，2.58(3)；Ile，1.00(1)；Leu，1.08(1)；Lys，4.31(4)。
實施例2 Tα1(17-24)-Cys(mPEG5000-MAL)-NH2的製備2.1 Tα1(17-24)-Cys-NH2的合成以0.1mmol Rink醯胺樹脂作載體，Fmoc-AA-OH(0.2mmol)作為原料，HBTU(0.2mmol)-NMM(0.3mmol)作縮合劑，按Tα1(17-24)的胺基酸序列合成全保護肽樹脂。以EDT-間甲酚-TFA作裂解液，0℃反應90分鐘，濾除樹脂，將濾液旋轉蒸發除去TFA，加無水乙醚沉澱出白色固體，濾集固體，溶於水中，冰凍乾燥得白色乾粉20mg。RP-HPLC純化，FAB-MS分析，M+1峰1091(理論值1090)。
2.2 Tα1(17-24)-Cys(mPEG5000-MAL)-NH2的合成將經RP-HPLC純化的Tα1(17-24)-Cys-NH2溶於水中，以碳酸氫鈉調pH至7-8，加入3倍當量的mPEG5000-MAL，室溫反應2小時，用RP-HPLC分離產物。
Tα1(17-24)-Cys(mPEG5000-MAL)-NH2-Tα1經MALDI-TOF-MS分析，在6182附近有一系列峰，相鄰兩峰分子量相差約44，具有聚乙二醇的典型結構特徵。酸水解(6N鹽酸水溶液，110℃，22小時)的胺基酸組成比例分析與理論值相符Glu，3.41(3)；Val，1.52(2)；Lys，3.07(3)。
實施例3 Tα1及其類似物對小鼠脾細胞產生IFN-γ的誘生作用斷頭放血處死小鼠，無菌條件下迅速取出脾臟，放入RPMI1640液中。將脾臟放在100目不鏽鋼網上或尼龍網中用針芯或三角玻棒研磨，製成脾細胞懸液。用培養液離心洗滌脾細胞一次後，加入Tris-NH4Cl緩衝液(0.16M NH4Cl和0.17M Tris按9∶1混合，pH7.2)作用3-5分鐘，溶解RBC，再用培養液離心洗滌兩次。用苔盼藍染色，活細胞數需在95％以上。用10％小牛血清1640液將細胞濃度調整到1.25×107個/mL備用。將脾細胞加入到培養無菌48孔培養板中，每孔800μL；再加入表1所示的不同濃度待測樣品和ConA 100μL(終濃度0.5μg/mL和1.0μg/mL)，置5％CO2培養箱中，37℃培養24小時，離心取上清，用小鼠IFN-γ檢測試劑盒測定IFN-γ的含量。
表1

注Zadaxin為賽生公司的商品化Tα1，空白對照細胞培養液上清的IFN-γ濃度為13.8ng/mL。
實施例4 Tα1衍生物的體外抗SARS病毒實驗生長成片的96孔塑膠板培養的Vero E6細胞，傾出培養液後，加入100TCID50的SARS病毒，吸附2小時，傾出病毒，加入待測樣品，終濃度為100μg/ml，繼續培養7天，每天在顯微鏡下觀察Vero E6細胞病變程度，結果如表2所示表2

注4-/4表示4個孔都無病毒繁殖，即陰性；4+/4表示4個孔均為陽性。
結論Cys(mPEG5000-MAL)-Tα1和Cys(mPEG5000-MAL)-Tα1(17-24)在100μg/ml時有體外抗SARS病毒活性，Tα1-Cys(mPEG5000-MAL)-NH2在100μg/ml時無體外抗SARS病毒活性。
權利要求
1.式(I)化合物或其衍生物PEG-M-Cys-T (I) 或 或 其中PEG為RO(CH2CH2O)n-CH2CH2，R＝H或CH3，n＝5-1000，Cys為半胱氨酸，它通過其側鏈硫醚原子與M基團共價相連；Cys還以其羧基與T的N-端氨基形成醯胺鍵相連或以其氨基與T的C-端羧基形成醯胺鍵相連，Cys位置包括位於T序列的兩端、任意兩相鄰胺基酸之間以及替代任意位置的胺基酸，T表示天然Tα1全序列或含Tα1(17-24)序列的任意片段。
2.根據權利要求1的化合物或其衍生物，其中含Tα1(17-24)序列的任意片段由下式代表R1-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-R2R1＝H、Leu、Asp-Leu、Lys-Asp-Leu、Thr-Lys-Asp-Leu、Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu。R2＝H、Glu、Glu-Ala、Glu-Ala-Glu、Glu-Ala-Glu-Asn。
3.式(II)化合物[PEG-X-(CH2)mCO-Y]z-T (II)其中T表示天然Tα1全序列或含Tα1(17-24)序列的任意片段，X＝O、NH或NHCO，Y＝O或NH，m＝0-6，z＝1-11，並且T序列中任意位點的氨基或羥基可經一個或多個PEG分子共價修飾，如天然Tα1全序列中N-端去乙醯化後的氨基和14、17、19、20位賴氨酸側鏈氨基，1、8、9、位絲氨酸的側鏈羥基和7、12、13位蘇氨酸的側鏈羥基。
4.式(III)化合物，T-[CO-Y-PEG]z (III)其中，T表示天然Tα1全序列或含Tα1(17-24)序列的任意片段，Y＝O或NH，z-1-10，並且T序列中任意位點的羧基可經一個或多個PEG分子共價修飾，如天然Tα1全序列中C-端羧基，2、6、15位天冬氨酸的側鏈羧基和10、18、21、24、25、27位穀氨酸的側鏈羧基。
5.藥物組合物，其含有至少一種式(I)或式(II)或式(III)的化合物及藥物載體或賦形劑。
6.權利要求1-4中任一化合物或衍生物在製備用於預防或治療與免疫缺陷或免疫功能低下相關疾病的藥物中用途包括在B型肝炎，C型肝炎，惡性黑色素瘤，非小細胞性肺癌，冠狀病毒引起的SARS等相關疾病的治療或預防中的應用。
7.製備式(I)化合物或衍生物的方法，其包括將PEG-MAL或PEG-VS或PEG-IODO與HS-Cys-T反應。
全文摘要
本發明涉及胸腺素α
文檔編號C07K7/06GK1532207SQ03131498
公開日2004年9月29日 申請日期2003年5月16日 優先權日2003年3月21日
發明者劉克良, 王良友, 劉尚義, 吳萍, 趙修南, 董洩建 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所, 中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥