一種肌苷的生產方法

2023-10-09 19:02:04

專利名稱：：一種肌苷的生產方法
技術領域：
：本發明涉及一種肌苷的發酵生產方法，尤其是應用於生產各種藥物及其前體物、功能性食品等肌苷的發酵生產方法。
背景技術：
：在食品工業中，肌苷主要用於二步法生產5'-肌苷酸，由於食品增味劑需求的增加和對環境保護意識的增強，發酵法生產肌苷己成為生產第二代和第三代增鮮劑的主要途徑，取代了化學合成法和水解法。存在已知的利用枯草芽孢桿菌屬微生物發酵生產肌苷的方法，所述的微生物時候腺嘌呤缺陷型菌株，或者賦予了對各種物質，包括嘌呤類似物抗性的腺嘌呤營養缺陷型菌株(日本專利公開(K0K0KU)號38-23099，5417033，55-2956，57-14160，短桿菌屬微生物(日本專利公開(K0K0KU)號51-5075，58-17592，Agric.Biol.Chem，42，399(1978)，對8—氮雜鳥嘌呤、磺胺胍、鏈黴素有三重抗性等等。微生物經誘變育種後能夠產生核酸類物質。肌苷產生菌應該具有以下特徵(l)缺少sAMP合成酶(2)解除在5'-頂P生物合成處的調節(3)缺乏肌苷降解的酶系，如核苷磷酸化酶和核苷水解酶。肌苷發酵的生產菌種主要有枯草桿菌、短小芽孢桿菌和產氨短桿菌，其中枯草桿菌的磷酸酯酶活性較強，有利於將IMP脫磷酸化形成肌苷，分泌至胞外，因而肌苷的發酵多採用枯草桿菌的腺嘌呤缺陷型。目前主要用枯草桿菌，產氨短桿菌及短小芽孢桿菌為出發菌種。生產菌種首先要腺嘌呤與鳥嘌呤缺陷型。為了有效地積累肌苷，還應該選擇核苷酸酶活性強而核苷酸磷酸化酶活性弱的菌株，以促進肌苷的生成和生成的肌苷不再分解，提高肌苷產量。柏建新等經誘變處理，獲得一株缺失核苷水解酶活性的突變株JSIM-B-198。發酵50h-60h後，平均產肌苷18.38g/L。王敖全等M用枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)腺嘌呤缺陷形(ade-)Na18經一次亞硝基肌(MNNG)誘變處理及兩次單菌落分離，獲得能利用酶法製造葡萄糖三次結晶母液，發酵生產肌苷的變異菌株B:a，搖瓶肌苷產量在7.0克/升以上。楊志榮等分離鑑定出6株產氨短桿菌(Brevibacteriumammoniagenes)，篩選出腺嘌呤缺陷型和鳥嘌呤缺陷型菌株，搖瓶發酵最高產量達12.lg/L中國專利CN101104865屬於芽孢桿菌屬的肌苷生產細菌和生產肌苷的方法。具體地，本發明涉及從芽孢桿菌群中篩選出在含有6-乙氧基嘌呤的培養基中表現為有利生長的菌株，並從獲得的菌株中篩選出表現為肌苷生產能力高的一種菌株，以獲得肌苷生產能力改善的芽孢桿菌。中國專利CN1410527—種新型肌苷產生菌及其生產肌苷的方法，該新型肌苷產生菌為經選育的肌苷高產突變株產氨短桿菌(Brevibacteriuma腿oniagenes)GMA-1198CCTCCM201025。本發明所提供的生產肌苷的方法，其特點是用GMA-1198CCTCCM201025做發酵菌株，利用糖質原料和生長素進行搖瓶發酵。產肌苷最高可達28g/l。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種工藝穩定、產率高、生產成本低的肌苷生產方法。本發明所採用的技術方案是一種肌苷的生產方法，步驟為A、一級種培養將菌株放在一級培養基中培養，培養溫度為3032。C、旋轉式搖床220士20rpm、培養時間10-15小時，得增值菌株；B、二級種培養將步驟A所得的增值菌株再放到二級培養基中，培養溫度為35士0.5"C、培養時間8-12小時，得放大菌株；C、菌株發酵將步驟B所得的放大菌株放到發酵培養基中，進行發酵。菌株先後通過二級培養基後，繁殖很多活性相同，生物特性相同的菌株。進一步在上述的肌苷的生產方法中，所述的菌株是誘導突變的枯草芽孢桿菌JSIM-1019-193的突變體。為獲得這樣的突變菌株，常規使用的一種方法是進行誘變處理如紫外線照射或者亞硝基胍(N-甲基一N'—硝基一N—亞硝基胍)處理，用合適的選擇培養基篩選目標突變菌株。所述的一級種培養基是以下各濃度組份的混合物，濃度單位是g/L，澱粉雙酶糖30士5，酵母粉26±6，KH2P044±2、硫酸銨10±2、硫酸鎂l士O.5、CaC(U0土2、尿素5士1、玉米漿60士10、酵母膏14土3、蛋白腖10土2、NaCLl士0.4、腺嘌呤1.2±0.1、鳥嘌呤1.2±0.1，用去離子水配製後滅菌，例如調節pH值為7.0±0.5，壓力0.IMpa121°C滅菌25min。所述的二級種培養基是以下各濃度組份的混合物，濃度單位是g/L，澱粉雙酶糖50士5、酵母粉26士6、KH2P044±2、硫酸銨10±2、硫酸鎂1±0.5、CaC0J0土2、尿素5±1、玉米漿60士10、酵母膏14±3、NaCL1±0.4、腺嘌呤1.2±0.1、鳥嘌呤1.2士0.1、鏈黴素1.8土0.1，用去離子水配製後滅菌，例如調節pH值為7.0士0.5，壓力O.IMpa121°C滅菌25min，所述的尿素需在118士l(TC的溫度下單獨消毒20min士5分鐘。所述的一級種培養時，光密度的26倍00*26淨值》0.04、無雜菌或噬菌體汙染；所述的二級種培養時，通過鹼性溶液控制二級培養基的PH值為6.7±0.2，光密度的26倍00*26淨值>0.05，無雜菌或噬菌體汙染。所述的發酵培養基是以下各濃度組份的混合物，濃度單位是g/L，澱粉雙酶糖100士30、酵母粉14士5、KH2P0^±1、硫酸鎂2士1、脯氨酸2土1，味精0.5士0.1、玉米漿80士5、鏈黴素1.8土0.1、消泡劑，用去離子水配製後滅菌，例如調節pH值為7.0±0.5，壓力0.1±0.IMpa121±5°C滅菌25士5min。在發酵培養基中添加CaCL215g/L±3、脂肪酸1±0.lg/L以及乙醯輔酶A0.04±0.02g/L。所述的酵母粉先水解36士5小時；在發酵過程中通過添加蒸餾水，維持糖濃度在2.22.5%。所述菌株發酵40士3小時後，加入5ug/ml溶菌酶，發酵55±5小時後，停止加入溶菌酶。所述的發酵初溫37±0.5°C，發酵開始時的PH值是7.0，在發酵過程中通過鹼性溶液調節PH值維持在6.07.0，優選的是通氨氣控制PH值為6.7、通風比1:1，4.0%《C02《6.0。％，溶氧度DC01(m;發酵20小時開始流加稀釋培養基和糖份。培養8-12小時、0D*26淨值>0.05，無雜菌或噬菌體汙染。Ca2+抑制丙酮酸激酶活性，脂肪酸和乙醯輔酶A也可抑制丙酮酸激酶的活力、減少丙酮酸的積累，造成磷酸烯醇式丙酮酸的積累，磷酸烯醇式丙酮酸是EMP途徑限速酶磷酸果糖激酶的抑制劑，所以磷酸烯醇式丙酮酸的積累降低了磷酸果糖激酶的活性，從而降低了EMP途徑的通量，緩解了EMP和TCA之間的代謝溢流，同時葡萄糖總通量沒有變化，所以更多的葡萄糖進入HMP途徑合成肌苷，相應地提高了肌苷的產率和糖苷轉化率。對溶菌酶(細胞壁降解酶)有高敏性，該酶被認為能夠使細胞壁合成能力部分喪失，從而使大量胞內產生的肌苷易於分泌出細胞，而且對鏈黴素有抗性，從而有效應對發酵時發生的汙染。在細胞外存在積累的大量溶質時，細胞內腩氨酸對滲透壓調節起重要作用。因此增加細胞內脯氨酸濃度，能夠更有效地排出滲透壓的作用。上述各種培養基以及溶菌酶都是分批量加入到相應的器皿中，最後在發酵培養基中收集提取肌苷。在整個發酵過程的不同時期，糖苷轉化率較對照提高10-30%，肌苷產率達到54g±5/L。具體實施例方式本發明的主旨是通過採用二級種發酵工藝，提高糖苷轉化率，最終使肌苷產率達到54±5g/L。以下的實施例是以舉例來進一步說明本發明，因此，不應該構成對本發明範圍的限制。特別是實施條件的選擇並不導致肌苷產率的實質性差異，僅屬因地因事而異的區別，故下述實施例並非對本
發明內容的窮舉和限定首先，一種肌苷的生產方法，步驟為A、一級種培養將菌株放在一級培養基中培養，培養溫度為3032°C、旋轉式搖床220士20rpm、培養時間10-15小時，得增值菌株；B、二級種培養將步驟A所得的增值菌株再放到二級培養基中，培養溫度為35±0.5°C、培養時間8-12小時，得放大菌株；C、菌株發酵將步驟B所得的放大菌株放到發酵培養基中，進行發酵。實施例採用的菌株為枯草芽孢桿菌，將50ml菌液接種至搖瓶中的一級種培養基，搖瓶在220轉/分，溫度32。C、PH7.2、培養10-15小時，得增值菌株；光密度的26倍00*26淨值>0.04，菌體分裂良好，無雜菌或噬菌體汙染。再將所得的增值菌株再放到二級培養基中，培養溫度為35±0.5°C、培養時間8-12小時，得放大菌株，且通氨氣控制PH值是6.7，通風比l:1，培養8-12小時;0D沐26淨值》0.05，無雜菌或噬菌體汙染。所述的一級種培養基是以下各濃度組份的混合物，各組分的濃度單位是g/L，澱粉雙酶糖30，酵母粉26，KH2P044，硫酸銨IO，硫酸鎂l，CaCQ:,lO，尿素5，玉米漿60，酵母膏14，蛋白腖IO，NaCL1，腺嘌呤1.2，鳥嘌吟1.2，去離子水配製，NaOH調pH7.0，12rC25min(尿素，分消118。C20min)所述的二級種培養基是以下各濃度組份的混合物，各組分的濃度單位是g/L，澱粉雙酶糖50，酵母粉26,KH2P044，硫酸銨IO，硫酸鎂l，CaCO:AO，尿素5，玉米漿60，酵母膏14，NaCL1，腺嘌呤1.2,鳥嘌呤1.2，鏈黴素1.8，去離子水配製，NaOH調pH7.0，12rC25min(尿素，分消118"20min)在調配相應的培養基之前，先將酵母粉水解30h，使其能儘快被菌體吸收利用，採用低糖培養，在整個發酵過程中一直維持低糖濃度，約2.22.5%。發酵20h後開始流加糖份，以保持整個發酵液的糖濃度。溶菌酶5ug/ml於發酵40h後隨培養基流加。50L罐發酵控制容接種量10%，即放大菌株佔發酵發酵培養基基的體積是10%。移種後定容35L，即放大菌株與發酵培養基的總體積是35L。溫度控制37士0.5'C，開始時，控制PH值7.0。發酵過程中，通氨氣控制PH值是6.0-7.0，最大通風比l:1，4.0%《C02《6.0%，氧溶量D0^10。/。；發酵20小時開始流加稀釋培養基和糖份，溶菌酶5ug/ml於發酵40h後隨培養基流加，發酵55h後停止流加，60h時放罐，這時的發酵液澄清，鏡檢菌體完整，發酵液經離心後取上清。檢測肌苷含量為48g/L。所述的發酵培養基是以下各濃度組份的混合物，各組分的濃度單位是g/L，澱粉雙酶糖100，酵母粉14，KH2P045，硫酸鎂2，脯氨酸2，味精O.5，玉米漿80,脂肪酸l、CaCL15和乙醯輔酶AO.04，鏈黴素l.8，消泡劑，等。自來水配製，NaOH調pH7.0，121。C滅菌30min通過在發酵培養基中添加脂肪酸、CaCL2和乙醯輔酶A，使其在培養基中的濃度分別為lg/U15g/L和0.04g/L，搖瓶培養方法，37°C。使糖苷轉化率和肌苷轉化率大大提高。以下列表數據是發酵培養基中添加上述濃度脂肪酸、CaCL2和乙醯輔酶A與不添加這幾種組份時，糖苷轉化率與肌苷產率g/L實驗結果，如表l。添加上述濃度脂肪酸、CaCU和乙醯輔酶A對發酵過程糖代謝關鍵酶比活(U/mg蛋白)測定，測定結果如表2表ltableseeoriginaldocumentpage9表2tableseeoriginaldocumentpage9權利要求1、一種肌苷的生產方法，步驟為A、一級種培養將菌株放在一級培養基中培養，培養溫度為30～32℃、旋轉式搖床220±20rpm、培養時間10-15小時，得增值菌株；B、二級種培養將步驟A所得的增值菌株再放到二級培養基中，培養溫度為35±0.5℃、培養時間8-12小時，得放大菌株；C、菌株發酵將步驟B所得的放大菌株放到發酵培養基中，進行發酵。2、根據權利要求1所述的生產方法，其特徵在於所述的一級種培養基是以下各濃度組份的混合物，各組分的濃度單位是g/L，澱粉雙酶糖30士5、酵母粉26士6、KH2P044±2、硫酸銨10士2、硫酸鎂l士O.5、CaC0310±2、尿素5士1、玉米漿60土10、酵母膏14士3、蛋白腖10士2、NaCLl士0.4、腺嘌呤1.2±0.1、鳥嘌呤1.2±0.1，用去離子水配製後滅菌。3、根據權利要求2所述的生產方法，其特徵在於所述的二級種培養基是以下各濃度組份的混合物，各組分的濃度單位是g/L，澱粉雙酶糖50士5、酵母粉26土6、KH2P(V1土2、硫酸銨10±2、硫酸鎂l士O.5、CaC0310±2、尿素5士1、玉米漿60士10、酵母膏14土3、NaCLl土0.4、腺嘌呤1.2士0.1、鳥嘌呤1.2土0.1、鏈黴素1.8±0.1，用去離子水配製後滅菌。4、根據權利要求2或3所述的生產方法，其特徵在於所述的尿素需在l18±5°C的溫度下單獨消毒20min士5分鐘。5、根據權利要求4所述的生產方法，其特徵在於所述的一級種培養時，光密度的26倍00*26淨值>0.04、無雜菌或噬菌體汙染；所述的二級種培養時，通過鹼性溶液控制二級培養基的PH值為6.7±0.2，光密度的26倍00*26淨值》0.05，無雜菌或噬菌體汙染。6、根據權利要求5所述的生產方法，其特徵在於所述的發酵培養基是以下各濃度組份的混合物，濃度單位是g/L，澱粉雙酶糖IOO±30、酵母粉14士5、KH2P045±1、硫酸鎂2士1、脯氨酸2士1，味精O.5±0.1、玉米漿80士5、鏈黴素1.8士0.1、消泡劑，用去離子水配製後滅菌。7、根據權利要求6所述的生產方法，其特徵在於在發酵培養基中添加CaCL2l5g/L士3、脂肪酸l±0.lg/L以及乙醯輔酶A0.04±0.02g/L。8、根據權利要求7述的生產方法，其特徵在於所述的酵母粉先水解36士5小時，在發酵過程中通過流加糖份，維持糖濃度在2.22.5%。9、根據權利要求8所述的生產方法，其特徵在於所述菌株發酵40士3小時後，加入5ug/ml溶菌酶，發酵55士5小時後，停止加入溶菌酶。10、根據權利要求9所述的生產方法，其特徵在於所述的發酵初溫37士0.5。C，發酵開始時的PH值是7.0，在發酵過程中通過鹼性溶液調節PH值維持在6.07.0。全文摘要本發明公開了一種肌苷的生產方法，一種肌苷的生產方法，步驟為A.一級種培養將菌株放在一級培養中培養，培養溫度為30～32℃、旋轉式搖床220±20rpm、培養時間10-15小時，得增值菌株；B.二級種培養將步驟A所得的增值菌株再放到二級培養基中，培養溫度為35±0.5℃、培養時間8-12小時，得放大菌株；C.菌株發酵將步驟B所得的放大菌株放到發酵培養基中，進行發酵。在整個發酵過程的不同時期，糖苷轉化率較對照提高10-30％，肌苷產率達到54±5g/L。文檔編號C12P19/40GK101348818SQ20081019824公開日2009年1月21日申請日期2008年8月29日優先權日2008年8月29日發明者劉詠梅,瓊楊,陳華強申請人:廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司