包含絲氨酸蛋白酶變體的組合物和方法

2023-06-24 20:04:26 1

包含絲氨酸蛋白酶變體的組合物和方法
【專利摘要】本發明提供了用於蛋白改造的方法，以及從其產生的絲氨酸蛋白酶變體。具體而言，本發明提供了相比參照的絲氨酸蛋白酶，具有一個或多個取代的絲氨酸蛋白酶變體。此外，本發明提供了包含這些絲氨酸蛋白酶變體的組合物。在一些實施方案中，本發明提供了包含至少一種這些絲氨酸蛋白酶變體的清潔組合物。
【專利說明】包含絲氨酸蛋白酶變體的組合物和方法
[0001] 本申請為2009年11月10日提交的、發明名稱為"包含絲氨酸蛋白酶變體的組合 物和方法"的PCT申請PCT/US2009/063808的分案申請，所述PCT申請進入中國國家階段的 日期為2011年5月11日，申請號為200980144959. X。
[0002] 本申請要求美國臨時專利申請系列號61/113, 545、61/113, 552、61/113, 548的優 先權，上述申請均於2008年11月11日提交，以及61/218, 802的優先權，它是2009年6月 19日提交的，所有上述優先權申請均通過引用併入本文中。

【技術領域】
[0003] 本發明提供了蛋白質改造的方法，以及從所述方法產生的絲氨酸蛋白酶。具體而 言，本發明提供相比參照絲氨酸蛋白酶具有一個或多個取代的絲氨酸蛋白酶。此外，本發明 提供包含這類絲氨酸蛋白酶變體的組合物。在一些實施方案中，本發明提供了包含至少一 種的這類絲氨酸蛋白酶變體的清潔組合物。

【背景技術】
[0004] 各種蛋白質改造方法是本領域技術人員已知的。一般而言，為了獲得理想的蛋白 質性質而修飾蛋白質。在大部分方法中，突變編碼蛋白質的克隆基因的核苷酸序列，並表達 修飾的基因來產生變體，篩選所述變體的目標活性。通常，比較變體的性質與野生型蛋白質 的性質。
[0005] 從歷史的觀點而言，所探討的蛋白質設計方法等價於這樣的問題，即在所有的蛋 白質空間（space)中發現一條適合理想應用的最佳序列。這一問題非常棘手，是"NP困難 (NP-hard)的"。在複雜性理論中，定義為P類的問題被認為是簡單有效的，其解法存在多 項式時間算法。NP困難問題是有效的多項式時間算法目前尚未知的問題，而如果可以解決 任何NP困難問題,則可以解決所有的NP困難問題（見,例如，Pierce和Winfree，Protein Engineer.，15 :779-782,2002)。目前用於建立和篩選文庫的策略一般涉及在整個序列中 隨機產生蛋白質序列多樣性，或者在蛋白質的定義位置上以受控的隨機方式產生所述多樣 性。這類文庫一般具有對主要的目的性質是"陰性"的大量成員，為了發現相對少量的陽性 突變，需要篩選很大數量。一般而言，忽視陰性突變，僅獲得陽性成員的序列信息。
[0006] 飽和誘變（Estell 等，在 World Biotech Report 1984，第 2 卷，USA，Online Publications，London，第 181-187 頁，1984 ;和 Wells 等，Gene，34 :315-323,1985 中）是一 種技術，可用於搜索蛋白空間中優化蛋白質的若干性質的突變。一些小組已經開發了鑑別 通過飽和誘變所改變的位點的策略（Reetz等，Angew. Chem. Int Edn, 44 :4192-4196,2005 ; Kato 等，J Mol Biol，351 :683-692, 2005 ;和 Sandberg 等，Proc Natl Acad Sci USA，90 : 8367-8371，1993)，但尚未提出用於位點鑑別的一般系統。
[0007] 此外，由於大部分蛋白質改造方法產生大量的胺基酸突變選型，故產生理想的蛋 白質性質一般需要篩選大量的變體。一般而言，重複多次篩選來產生有益的變體。因而，大 部分方法是耗費勞動力和時間的。本領域對於有效的且產生理想結果的蛋白質改造方法存 在持續的需求。
[0008] 發明概述
[0009] 本發明提供了用於蛋白質改造的方法，具體而言，本發明提供了利用位點評估文 庫（site evaluation library)的方法。特別是，本發明提供了使用所獲得的關於多種理 想性質的信息的手段，為了理性而有效的設計將優化所述性質的文庫。在一些實施方案中， 本發明提供了設計文庫的手段，所述文庫針對至少兩種理想性質進行了改良。本發明還提 供了相比參照的絲氨酸蛋白質，具有一個或多個取代的絲氨酸蛋白酶變體，所述變體是使 用本文所述的蛋白質改造方法產生的。
[0010] 本發明提供了鑑別蛋白質的胺基酸序列內的位置的手段，所述位置涉及改善蛋白 質的理想性質。在一些特別優選的實施方案中，本發明提供了為了產生具有這類理想性質 以及改良性質的蛋白質，確定何種突變是期望的之手段。在其他一些特別優選的實施方案 中，本發明提供了鑑別胺基酸位置和突變的手段，所述位置和突變比野生型蛋白質改善了 特定的百分比（例如，一種性質比野生型的110%好）。在其他的優選實施方案中，本發明 提供了鑑別突變的手段，所述突變提供了至少一種極大改良的性質和至少一種不顯著差於 野生型蛋白質的其他性質（例如，一種性質比野生型的110%好，另一種性質不比野生型的 90%差）。在其他的優選實施方案中，基於該信息構建文庫。在一些實施方案中，使用所有 已鑑別的突變構建文庫，而在一些其他的實施方案中，使用所鑑別突變的子集來構建文庫。 實際上，文庫並非意在限於任何特定的突變數量和/或類型。
[0011] 本發明提供了用於蛋白質過程的方法，其包括步驟：提供蛋白質變體的文庫；在 目標測試中，測試蛋白質變體文庫的至少一種目標性質；針對至少一種目標性質鑑別值域； 鑑別值域內與目標測試的有利結果相關的最小值；以及，提供複數的具有至少一種突變的 蛋白質變體，所述突變在至少一種目標性質的域中高於最小值，從而提供包含至少一種突 變的蛋白質變體文庫，其中所述文庫富含在目標測試中具有有利結果的成員。在一些實施 方案中，與上文第一步中所述測試中觀察到的最大值相比，有利的結果對應的值大於大約 50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約95%。在一些可選的實施方案中，在本發明的 方法中使用一種以上的目標測試。在一些優選的實施方案中，所述蛋白質是酶。在一些特 別優選的實施方案中，所述酶選自蛋白酶、轉移酶、金屬蛋白酶、酯酶、澱粉酶、纖維素酶、氧 化酶、角質酶（cutinase)和脂肪酶。
[0012] 本發明還提供了蛋白質改造的方法，其包括步驟：提高野生型蛋白質，和野生型蛋 白質的蛋白質變體文庫；在目標測試中，針對至少一種目標性質，測試蛋白質變體和野生型 蛋白質的文庫；鑑別至少一種目標性質的值域；鑑別與目標測試的有利結果相關的值域中 的最小值；鑑別相比從野生型獲得的結果，具有有利結果的蛋白質變體，其中有利的結果是 改良的目標性質；和提供複數的蛋白質變體，所述變體高於至少一種目標性質的域中的最 小值，從而提供改良的蛋白質變體的文庫，所述文庫富含在目標測試中具有有利結果的成 員。在一些優選的實施方案中，該方法進一步包括確定性能指數的步驟，其中所述性能指數 是通過每種改良的蛋白質變體所獲得的值除以野生型蛋白質所獲得的值來確定的。在一些 特別優選的實施方案中，該方法進一步包括鑑別改良的蛋白質變體的步驟，其中改良的蛋 白質變體在目標測試中達到大於約1. 1的性能指數值。在一些其他的實施方案中，所述蛋 白質是酶。在一些特別優選的實施方案中，所述酶選自蛋白酶、轉移酶、金屬蛋白酶、酯酶、 澱粉酶、纖維素酶、氧化酶、角質酶和脂肪酶。在一些可選的實施方案中，所述蛋白質選自抗 體和生長因子。在其他的優選的實施方案中，野生型蛋白質是酶的成熟形式，所述酶選自蛋 白酶、轉移酶、金屬蛋白酶、酯酶、澱粉酶、纖維素酶、氧化酶、角質酶和脂肪酶。在一些優選 的實施方案中，目標性質選自電荷、洗滌性能、硬表面清潔性能、熱穩定性、儲藏穩定性、去 垢劑穩定性、底物結合、酶抑制、表達水平、反應速率，和底物降解。在一些實施方案中，野生 型蛋白質和蛋白質變體是至少一種去垢劑組合物的組分。在一些優選的實施方案中，在配 製成粉末狀或液體去垢劑的去垢劑組合物中測試洗滌性能，所述粉末狀或液體去垢劑具有 在約5和約12. O之間的pH。
[0013] 本發明還提供了產生參照蛋白質在蛋白質摺疊（protein fold)中的改良變體的 方法，其包括：在目標測定中，測定測試蛋白質在蛋白質摺疊中的多個變體，所述蛋白質折 疊覆蓋一系列的目標性質；鑑別與目標測定的有利結果相關的一系列的目標性質中的最小 值；測定目標測定中蛋白質摺疊的參照蛋白質；通過將胺基酸取代導入參照蛋白質中，產 生參照蛋白質的改良變體，使得改良變體高於目標性質域的最小值。在一些優選的實施方 案中，參照蛋白質和測試蛋白質是不同的。在一些實施方案中，該方法進一步包括確定性 能指數的步驟，其中所述性能指數是通過改良的蛋白質變體所獲得的值除以參照蛋白質所 獲得的值來確定的。在一些實施方案中，所述測試蛋白質和參照蛋白質是酶。在一些特別 優選的實施方案中，所述酶選自蛋白酶、轉移酶、金屬蛋白酶、酯酶、澱粉酶、纖維素酶、氧化 酶、角質酶和脂肪酶。在一些可選的實施方案中，所述測試和參照蛋白質選自抗體和生長因 子。在其他的優選的實施方案中，參照蛋白質是酶的成熟形式，所述酶選自蛋白酶、轉移酶、 金屬蛋白酶、酯酶、澱粉酶、纖維素酶、氧化酶、角質酶和脂肪酶。在一些優選的實施方案中， 目標性質選自電荷、洗滌性能、硬表面清潔性能、熱穩定性、儲藏穩定性、去垢劑穩定性、底 物結合、酶抑制、表達水平、反應速率，和底物降解。在一些實施方案中，測試和參照蛋白質 是至少一種去垢劑組合物的組分。在一些可選的實施方案中，改良的蛋白質變體是去垢劑 組合物的組分。在一些優選的實施方案中，在配製成粉末狀或液體去垢劑的去垢劑組合物 中測試洗滌性能，所述粉末狀或液體去垢劑具有在約5和約12. 0之間的pH。
[0014] 在一些實施方案中，本發明提供了包含至少一種本文所述絲氨酸蛋白酶變體的清 潔組合物。在一些優選的實施方案中，清潔組合物是衣物洗滌去垢劑。在這類實施方案的 子集中，衣物洗滌去垢劑是冷水型去垢劑、低PH型去垢劑，或壓縮型去垢劑。在其他實施方 案中，清潔組合物是餐具洗滌去垢劑。在一些實施方案中，餐具洗滌去垢劑是無磷去垢劑， 而在其他實施方案中，餐具洗滌去垢劑是含磷去垢劑。在一些優選的實施方案中，清潔組 合物進一步包含至少一種其他的酶，在特別優選的實施方案中，所述酶選自中性金屬蛋白 酶、脂肪酶、角質酶、澱粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶（mannanase)、阿拉伯糖酶 (arabinase)、半乳聚糖酶（galactanase)、木聚糖酶、氧化酶和過氧化物酶。本發明還提供 了編碼絲氨酸蛋白酶變體的分離的核酸，包含所述核酸的表達載體，和包含所述表達載體 的宿主細胞。
[0015] 此外，本發明提供了產生芽孢桿菌屬（Bacillus)絲氨酸蛋白酶的絲氨酸蛋白酶 變體的方法，其包括：用包含編碼絲氨酸蛋白酶變體的核酸的表達載體轉化宿主細胞；和 在適合絲氨酸蛋白酶變體產生的條件下培養轉化的宿主細胞。在一些實施方案中，該方法 進一步包括收穫所產生的絲氨酸蛋白酶變體的步驟。在一些實施方案中，宿主細胞是芽孢 桿菌屬物種，而在這類實施方案的子集中，芽孢桿菌屬物種是枯草芽孢桿菌（B. subtilis)。 進一步的，本發明提供了清潔的方法，其包括將包含織物的表面和/或物品與清潔組合物 接觸的步驟，所述清潔組合物包含分離的絲氨酸蛋白酶變體。在一些可選的方法中，本發明 提供了清潔的方法，其包括將包含餐具的表面和/或物品與清潔組合物接觸的步驟，所述 清潔組合物包含分離的絲氨酸蛋白酶變體。
[0016] 此外，本發明提供了用於蛋白質改造的方法，其包括步驟：a)提供複數的位點評 估文庫（SEL)，每個文庫包含複數的蛋白酶變體，所述蛋白酶變體在與蛋白酶相同的胺基酸 位置上具有不同的取代；b)在目標性質的測試中，測試SEL的蛋白酶變體和標準蛋白酶；c) 確定所測試的每種蛋白酶變體的性能指數（PI) ;d)鑑別兩個或多個胺基酸位置作為非限 制性位置，其中複數的蛋白酶變體中的至少一個在2個SEL中的每一個都具有大於約0. 5 的PI ;和f)提供多個突變文庫，所述文庫包含複數的多取代蛋白酶變體，每個所述變體在 兩個或多個非限制性位置上包含取代。在一些實施方案中，該測試包括兩個或多個選自菌 株去除測定（微樣品）、LAS穩定性測定、去垢劑穩定性測定和比活測定的不同測定。在一 些其他實施方案中，可使用其他的和/或可選的測定方法。
[0017] 在一些其他實施方案中，本發明提供了這樣的方法，所述方法用於產生芽孢桿菌 屬絲氨酸蛋白酶的多取代絲氨酸蛋白酶變體，其包括：在第一種性質的第一測試和第二種 性質的第二測試中，測試複數的單取代絲氨酸蛋白酶變體，其中，參照絲氨酸蛋白酶的性質 在每種測試中給定為值1. 0,有利的第一或第二性質具有大於1. 0的值，而非常不利的第一 或第二性質具有小於0. 80的值，或者在一些優選的實施方案中，小於約0. 60 ;鑑別至少一 個在單取代的絲氨酸蛋白酶變體中的取代，所述變體是與有利的第一性質相關的，並且不 與非常不利的第二性質相關；鑑別至少一個單取代絲氨酸蛋白酶變體中的取代，所述變體 是與有利的第二性質相關的，並且不與非常不利的第一性質相關；將來自在先步驟中的取 代導入絲氨酸蛋白酶中，產生多取代的絲氨酸蛋白酶變體。在一些實施方案中，該方法進一 步包括在第一測試和第二測試中測試多取代的絲氨酸蛋白酶變體，其中，改良的絲氨酸蛋 白酶變體在第一和第二測試中都獲得大於約1. 〇的值，或者在第一測試中獲得大於約1. 〇 的值，而在第二測試中獲得在約〇. 80至約I. 0的值。在一些實施方案中，該方法進一步包 括產生改良的絲氨酸蛋白酶變體在一些實施方案中，第一和第二性質是陰性相關的。在一 些實施方案中，有利的第一或第二性質具有大於約1. 2的值。在一些實施方案中，非常不利 的第一或第二性質具有小於約〇. 40的值。在一些實施方案中，第一性質是穩定性，而第二 性質是洗滌性能。在這類的子集中，穩定性包括在去垢劑中的穩定性，而洗滌性能包括在去 垢劑中的血液、奶漬、墨水（BMI)洗滌性能。在一些實施方案中，參照細菌絲氨酸蛋白酶是 解澱粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens)絲氨酸蛋白酶BPN'的野生型的成熟形式，具有 SEQ ID NO :1所示的胺基酸序列。在其他實施方案中，參照細菌絲氨酸蛋白酶是GG36絲氨 酸蛋白酶的野生型，具有SEQ ID NO :2提出的胺基酸序列（S卩，用於產生"GG36變體"的參 照細菌絲氨酸蛋白酶）。在本發明的一些實施方案中，在具有在約5和約12. 0之間的pH 的粉末狀或液體去垢劑組合物中測試洗滌性能。不旨在將這些步驟限定到上面列出的精確 的順序，因為發現在本發明中使用任何合適的順序。但是，在一些優選的實施方案中，取代 位於這樣的參照絲氨酸蛋白酶的位置上，所述參照絲氨酸蛋白酶具有大於約50%或大於約 65 %的溶劑可及表面（SAS)。
[0018] 此外，本發明提供了枯草桿菌蛋白酶變體，其中變體是具有蛋白水解活性的成熟 形式，並且在一個或多個（優選，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個）位置上包含取 代，所述位置選自：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，19,20,21，22,24， 25,26, 27,28,29,30,31，33,34, 35,36,37,38,39,40,41，42,43,44, 45,46,47,48, 49,50， 51，52, 53,54, 55,56,57,58,59, 60,61，62,63,66,67,68, 69,71，72,73,74, 75,76, 77,78， 79,80,81，82,84, 85,86, 87,88, 89,90, 91，92, 93,94, 95,96, 97,98, 99,100,101，102,103， 104,105,106,107,108,109,110,111，112,113,114,115,116,117,118,119,120,121，122， 123,124,126,127,128,129,130,131，132,133,134,135,136,137,138,139,140,141，142， 143,144,145,146,147,148,149,150,151，152,153,154,155,156,157,158,159,160,161， 162,163,164,165,166,167,169,170,171，172,173,174,175,176,177,178,179,180,181， 182,183,184,185,186,187,188,189,190,191，192,193,194,195,196,197,198,199,200， 201，203,204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211，212, 213, 214, 215,216,217,218,219,220， 222,223,224,225,226,227,228,229,230,231，232,233,234,235,236,237,238,239,240， 241，242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251，252, 253, 254, 255,256,257、258、259、 260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274 和 275,其中所述位 置對照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。
[0019] 在一些優選的實施方案中，取代包括一個或多個的：X001A、X001C、X001E，X001F， X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001P, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004G, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005I, X005M, X005P, X005Q, X005S, X005T, X005W, X005Y, X006A, X006D, X006E, X006M, X006W, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007P, X007Q, X007S, X007T, X008A, X008F, X008G, X008I, X008L, X008M, X008Q, X008T, X008V, X008W, X008Y, X009A, X009C, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010F, X010G, X010H, X010I, X010K, X010L, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010V, X010W, X010Y, X011A, X011C, X011D, X011G, X011I, X011M, X011R, X011S, X011T, X011V, X011Y, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012P, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X012Y, X013A, X013G, X013I, X013M, X013Q, X013T, X013V, X014A, X014C, X014D, X014E, X014F, X014G, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016D, X016E, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016R, X016S, X016T, X016V, X017A, X017D, X017E, X017F, X017G, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017T, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018I, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019P, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, 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X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249R, X249S, X249T, X249V, X249W, X249Y, X250A, X250C, X250E, X250F, X250G, X250H, X250I, X250L, X250M, X250N, X250Q, X250S, X250V, X250Y, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251P, X251Q, X251R, X251S, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252P, X252R, X252S, X252V, X252W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X253F, X253G, X253H, X253I, X253K, X253M, X253R, X253S, X253T, X253V, X253W, X254A, X254C, X254D, X254E, X254G, X254N, X254P, X254S, X254T, X254V, X255A, X255C, X255D, X255E, X255F, X255H, X255I, X255L, X255N, X255P, X255Q, X255R, X255S, X255T, X255V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256R, X256S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X257A, X257C, X257E, X257F, X257G, X257H, X257I, X257K, X257L, X257M, X257P, X257S, X257T, X257V, X257W, X257Y, X258A, X258C, X258D, X258E, X258F, X258G, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, X260Y, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262P, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263A, X263C, X263D, X263F, X263G, X263H, X263I, X263K, X263L, X263M, X263N, X263P, X263Q, X263R, X263W, X263Y, X264A, X264C, X264E, X264F, X264G, X264H, X264I, X264L, X264P, X264Q, X264S, X264T, X264V, X264Y, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265I, X265K, X265L, X265M, X265N, X265P, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265V, X265W, X265Y, X266G, X266W, X266Y, X267A, X267C, X267D, X267E, X267F, X267G, X267H, X267I, X267K, X267L, X267M, X267N, X267S, X267T, X267V, X267Y, X268A, X268D, X268E, X268G, X268H, X268K, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268R, X268S, X268V, X268W, X268Y, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270E, X270F, X270G, X270H, X270I, X270L, X270M, X270N, X270P, X270Q, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273K, X273L, X273R, X273S, X273T, X273V, X273W, X273Y, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274K, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P,
[0020] X275Q、X275R、X275V 和 X275W。
[0021] 本發明還提供了包含枯草桿菌蛋白酶變體的餐具洗滌組合物，和包含枯草桿菌蛋 白酶變體的衣物去垢劑。在一些優選的實施方案中，餐具洗滌和衣物去垢劑進一步包含至 少一種其他的酶。在一些優選的實施方案中，其他的酶選自：蛋白酶（例如，中性金屬蛋白 酶、野生型絲氨酸蛋白酶或第二變體絲氨酸蛋白酶）、脂肪酶、角質酶、澱粉酶、糖酶、纖維素 酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶和過氧化物酶。此外， 本發明提供了餐具洗滌方法，其包括步驟：提供i)包含枯草桿菌蛋白酶變體的餐具洗滌組 合物，和ii)需要清潔的餐具；和在有效提供餐具清潔的條件下，將餐具與餐具洗滌組合物 接觸。相似的，本發明提供了織物清潔方法，其包括步驟：提供i)包含枯草桿菌蛋白酶變體 的衣物去垢劑，和ii)需要清潔的衣物；和在有效提供衣物清潔的條件下，將衣物與衣物去 垢劑接觸。在其他的實施方案中，本發明提供了編碼變體的分離的核酸，還提供了包含所述 分離的核酸與啟動子的有效組合的表達載體，和/或包含所述表達載體的宿主細胞。
[0022] 本發明還提供了芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中 枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的成熟形式，並且在三個或更多個位置上包含取 代，所述位置選自：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24, 25,26, 27,28,29,30,31，32,33, 34, 35,36,37,38,39,40, 41，42,43,44, 45,46,47, 48， 49,50,51，52,53, 54, 55,56,57,58,59,60, 61，62,63,64, 65,66,67, 68,69,71，72,73,74， 75,76,77,78,79,80,81，82,83,84, 85,86,87,88, 89,90,91，92,93,94, 95, 96,97,98,99， 100,101，102,103,104,105,106,107,108,109,110,111，112,113,114,115,116,117,118， 119,120,121，122,123,124,125,126,127,128,129,130,131，132,133,134,135,136,137， 138,139,140,141，142,143,144,145,146,147,148,149,150,151，152,153,154,155,156， 157,158,159,160,161，162,163,164,165,166,167,169,170，171，172,173,174,175,176， 177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195， 196,197,198,199,200, 201，202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211，212, 213, 214， 215,216,217,218,219,220,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231，232,233,234， 235,236,237,238,239, 240, 241，242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251，252, 253， 254,255,256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、 273、274和275,其中所述位置對照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶 BPN'的胺基酸序列編號。在一些實施方案中，枯草桿菌蛋白酶變體包含4、5、6、7、8、9、10、 11、12或更多個上述位置。
[0023] 在一些實施方案中，枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的成熟形式，並且 在三個或更多個位置上包含取代，所述位置選自：1、3、4、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18， 19,20, 21，22,23,24, 25,26,27, 28,29,30,31，33,35,36, 38,40,43,44, 45,46,47, 48,49， 50,51，52,53,54, 55,56,57,59, 61，62,68,69,72,73,76, 78,84,86,87,88,89,90, 91，92， 93,94,95,96,97,98,99,100,101，102,103,104,105,106,107,108,109,110,111，112,114， 115,116,117,118,119,120,121，122,124,126,128,129,130,131，132,133,134,135,136， 137,139,140,141，142,143,144,145,146,147,148,149,150,151，152,156,158,159,160， 165,166,167,170,171，172,173,174,175,176,177,180,182,183,184,185,186,187,188， 191，194,195,198,199,203,204,206,209,210,211，212,213,215,216,217,218,222,223， 224, 227,228,230,231，232,233,234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241，242, 243, 244, 245， 246,247,248,249,250,251，252,253,255,256,258,259,260,261，262,265、267、268、269、 270、271、272、273、274和275，其中所述位置對照SEQIDN0 :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯 草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。在一些實施方案中，枯草桿菌蛋白酶變體包含4、5、 6、7、8、9、10、11、12或更多個上述位置。
[0024] 本發明還提供了分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體是具 有蛋白水解活性的成熟形式，並且在三個或更多個位置上包含取代，所述位置選自：1、2、 3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3031， 33,35,36,38,39,40,41，42,43,44, 45,46,47,48,49,50,51，52,53,54, 55,56,57,59, 60， 61，62,63, 66,68,69,71，72,73,74, 75,76,77,78,79,81，82, 83,84,85,86,87,88,89, 90， 91，92,93,94, 95, 96,97,98,99,100,101，102,103,104,105,106,107,108,109,110,111， 112,114,115,116,117,118,119,120,121，122,123,124,125,126,127,128,129,130,131， 132,133,134,135,136,137,138,139,140,141，142,143,144,145,146,147,148,149,150， 151，152,153,156,158,159,160,165,166,167,169,170,171，172,173,174,175,176,177， 178,179,180,181，182,183,184,185,186,187,188,191，192,194,195,196,197,198,199， 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211，212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 220,222， 223,224,225,226,227,228,229,230,231，232,233,234,235,236,237,238,239,240,241， 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251，252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259,260、 261、262、263、264、265、267、268、269、270、271、272、273、274和 275，其中所述位置對照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。在一些實施 方案中，枯草桿菌蛋白酶變體包含4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個上述位置。
[0025] 本發明進一步包括分離的枯草桿菌蛋白酶變體，所述變體包含在三個或更多個位 置上的取代，所述取代選自：X〇〇lA、X001C、X001E、X001F、X001G、X001H、X001I、X001K、 X001L, X001N, X001P, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004G, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005I, X005M, X005P, X005Q, X005S, X005T, X005W, X005Y, X006A, X006D, X006E, X006M, X006W, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007P, X007Q, X007S, X007T, X008A, X008F, X008G, X008I, X008L, X008M, X008Q, X008T, X008V, X008W, X008Y, X009A, X009C, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, XOIOC, XOIOF, XOIOG, XOIOH, XOIOI, XOIOK, XOIOL, XOIOM, XOION, XOIOQ, XOIOR, XOIOS, XOIOT, XOIOV, XOIOW, XOIOY, XOllA, XOllC, XOllD, XOllG, XOllI, XOllM, XOllR, XOllS, XOllT, XOllV, XOllY, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012P, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X012Y, X013A, X013G, X013I, X013M, X013Q, X013T, X013V, X014A, X014C, X014D, X014E, X014F, X014G, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016D, X016E, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016R, X016S, X016T, X016V, X017A, X017D, X017E, X017F, X017G, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017T, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018I, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019P, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021R, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022K, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022R, X022S, X022T, X022V, X022W, X022Y, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025H, X025K, X025L, X025M, X025N, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026I, X026L, X026M, X026N, X026P, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027I, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027V, X027W, X027Y, X028A, X028E, X028G, X028H, X028I, X028L, X028M, X028N, X028P, X028S, X028V, X028Y, X029A, X029C, X029G, X029I, X029K, X029S, X029T, X029V, X030A, X030C, X030D, X030E, X030F, X030G, X030L, X030M, X030Q, X030S, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031T, X031V, X032A, X032C, X032D, X032E, X032G, X032V, X032W, X033A, X033C, X033D, X033E, X033G, X033H, X033I, X033L, X033M, X033N, X033Q, X033R, X033S, X033T, X033V, X033Y, X034E, X034G, X034H, X034L, X034Q, X034S, X035A, X035F, X035H, X035I, X035K, X035L, X035M, X035P, X035Q, X035R, X035S, X035A, X035C, X035E, X035F, X035G, X035H, X035I, X035L, X035M, X035N, X035P, X035Q, X035R, X035T, X035V, X035W, X035Y, X038C, X038F, X038G, X038H, X038I, X038K, X038L, X038M, X038N, X038Q, X038R, X038T,X038V,X038W,X038Y,X039A,X039E,X039G,X039HX039L, X039M, X039N, X039Q, X039S, X039T, X039V, X039Y, X040A, X040C, X040D, X040E, X040G, X040H, X040I, X040K, X040L, X040M, X040N, X040P, X040R, X040S, X040T, X040V, X040W, X040Y, X041C, X041D, X041E, X041N, X041P, X041Q, X041S, X042A, X042C, X042F, X042G, X042H, X042I, X042L, X042M, X042N, X042Q, X042S, X042T, X042V, X042Y, X043A, X043C, X043D, X043E, X043F, X043G, X043I, X043L, X043M, X043N, X043P, X043R, X043S, X043T, X043V, X043W, X043Y, X044A, X044C, X044D, X044F, X044G, X044I, X044K, X044L, X044M, X044N, X044P, X044Q, X044R, X044S, X044T, X044V, X044W, X044Y, X045A, X045D, X045F, X045G, X045H, X045I, X045K, X045L, X045M, X045N, X045P, X045Q, X045R, X045S, X045T, X045V, X045W, X045Y, X046C, X046D, X046E, X046F, X046G, X046H, X046I, X046K, X046L, X046M, X046N, X046P, X046Q, X046R, X046S, X046T, X046V, X046W, X047A, X047C, X047E, X047F, X047G, X047H, X047K, X047L, X047M, X047N, X047P, X047Q, X047R, X047S, X047T, X047W, X048A, X048C, X048E, X048F, X048G, X048H, X048I, X048K, X048L, X048M, X048N, X048P, X048Q, X048R, X048S, X048T, X048V, X048Y, X049A, X049E, X049F, X049G, X049H, X049K, X049L, X049M, X049P, X049Q, X049R, X049S, X049T, X050C, X050F, X050G, X050H, X050I, X050L, X050N, X050T, X050V, X050Y, X051F, X051G, X051H, X051K, X051L, X051N, X051P, X051R, X051S, X051T, X051V, X051W, X052A, X052C, X052E, X052F, X052G, X052H, X052I, X052L, X052M, X052N, X052P, X052Q, X052R, X052T, X052V, X052W, X052Y, X053A, X053C, X053D, X053E, X053G, 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X231W, X231Y, X232A, X232G, X232H, X232K, X232L, X232M, X232P, X232S, X232V, X233A, X233C, X233E, X233F, X233G, X233I, X233L, X233M, X233N, X233P, X233Q, X233R, X233S, X233T, X233V, X233Y, X234D, X234F, X234G, X234H, X234L, X234M, X234N, X234P, X234Q, X234S, X234T, X234V, X234Y, X235C, X235D, X235E, X235F, X235G, X235H, X235I, X235K, X235L, X235M, X235N, X235Q, X235R, X235S, X235V, X235W, X235Y, X236A, X236C, X236E, X236F, X236G, X236H, X236K, X236L, X236N, X236P, X236Q, X236R, X236S, X236T, X236V, X236W, X236Y, X237A, X237C, X237F, X237G, X237H, X237I, X237K, X237L, X237M, X237P, X237Q, X237R, X237S, X237T, X237V, X237W, X237Y, X238C, X238D, X238E, X238F, X238G, X238H, X238I, X238K, X238L, X238M, X238N, X238Q, X238R, X238S, X238T, X238V, X238Y, X239C, X239D, X239F, X239G, X239H, X239I, X239K, X239L, X239M, X239N, X239P, X239Q, X239R, X239S, X239T, X239V, X239W, X239Y, X240A, X240C, X240E, X240F, X240I, X240K, X240L, X240M, X240N, X240Q, X240R, X240S, X240T, X240W, X240Y, X241A, X241C, X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I, X241K, X241L, X241M, X241N, X241P, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242F, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242R, X242S, X242T, X242V, X242W, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243K, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243R, X243S, X243T, X243V, X243W, X244A, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244P, X244Q, X244R, X244S, X244T, X244V, X244W, X244Y, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245R, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246E, X246F, X246G, X246H, X246I, X246L, X246M, X246N, X246P, X246Q, X246R, X246S, X246T, X246V, X246W, X246Y, X247A, X247C, X247D, X247E, X247F, X247G, X247H, X247I, X247K, X247L, X247M, X247N, X247P, X247Q, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248K, X248L, X248M, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248W, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249R, X249S, X249T, X249V, X249W, X249Y, X250A, X250C, X250E, X250F, X250G, X250H, X250I, X250L, X250M, X250N, X250Q, X250S, X250V, X250Y, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251P, X251Q, X251R, X251S, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252P, X252R, X252S, X252V, X252W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X253F, X253G, X253H, X253I, X253K, X253M, X253R, X253S, X253T, X253V, X253W, X254A, X254C, X254D, X254E, X254G, X254N, X254P, X254S, X254T, X254V, X255A, X255C, X255D, X255E, X255F, X255H, X255I, X255L, X255N, X255P, X255Q, X255R, X255S, X255T, X255V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256R, X256S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X257A, X257C, X257E, X257F, X257G, X257H, X257I, X257K, X257L, X257M, X257P, X257S, X257T, X257V, X257W, X257Y, X258A, X258C, X258D, X258E, X258F, X258G, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, X260Y, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262P, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263A, X263C, X263D, X263F, X263G, X263H, X263I, X263K, X263L, X263M, X263N, X263P, X263Q, X263R, X263W, X263Y, X264A, X264C, X264E, X264F, X264G, X264H, X264I, X264L, X264P, X264Q, X264S, X264T, X264V, X264Y, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265I, X265K, X265L, X265M, X265N, X265P, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265V, X265W, X265Y, X266G, X266W, X266Y, X267A, X267C, X267D, X267E, X267F, X267G, X267H, X267I, X267K, X267L, X267M, X267N, X267S, X267T, X267V, X267Y, X268A, X268D, X268E, X268G, X268H, X268K, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268R, X268S, X268V, X268W, X268Y, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270E, X270F, X270G, X270H, X270I, X270L, X270M, X270N, X270P, X270Q, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273K, X273L, X273R, X273S, X273T, X273V, X273W, X273Y, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274K, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H、X275K、X275L、X275M、X275P、X275Q、X275R、X275V 和 X275W，其中所述位置對照 SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。在一些實施 方案中，枯草桿菌蛋白酶變體包含4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個上述位置。
[0026] 在一些優選的實施方案中，本發明提供了分離的枯草桿菌蛋白酶變體，所述變體 在選自BMI測定、蛋黃微樣品測定和/或AAPF活性測定的至少一種測定中具有大於1的 性能指數（performance index)，以及在LAS穩定性或TCA測定中具有大於0. 8的性能指 數，其中所述變體在一個或多個位置上包含至少一個取代，所述位置選自：1、2、3、4、5、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26,27,28,29,30,31，33,35， 36, 38,39,40,41，42,43,44, 45,46,47,48,49,50,51，52,53,54, 55,56,57,59, 60,61，62， 63,66,68, 69,71，72,73,74, 75,76, 77,78,79,81，82,83,84, 85,86,87,88,89,90,91，92， 93,94,95,96,97,98,99,100,101，102,103,104,105,106,107,108,109,110,111，112,114， 115,116,117,118,119,120,121，122,123,124,125,126,127,128,129,130,131，132,133， 134,135,136,137,138,139,140,141，142,143,144,145,146,147,148,149,150,151，152， 153,156,158,159,160,165,166,167,169,170,171，172,173,174,175,176,177,178,179， 180,181，182,183,184,185,186,187,188,191，192,194,195,196,197,198,199,200,203， 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211，212, 213, 214, 215,216,217,218,220,222,223,224， 225,226,227,228,229,230,231，232,233,234,235,236,237,238,239,240,241，242,243， 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251，252, 253, 254, 255,256、257、258、259、260、261、262、 263、264、265、267、268、269、270、271、272、273、274和 275，其中所述位置對照SEQIDN0:1 所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。在一些實施方案中，枯 草桿菌蛋白酶變體包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個上述位置。
[0027] 在一些優選的實施方案中，本發明提供了分離的枯草桿菌蛋白酶變體，所述變體 在選自BMI測定、蛋黃微樣品測定和/或AAPF活性測定的至少一種測定中具有大於1的性 能指數，以及在LAS穩定性或TCA測定中具有大於0. 8的性能指數，其中所述變體在一個或 多個位置上包含至少一個取代，所述位置選自：1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26,27,28,29,30,31，33,35,36,38,39,40,41，42,43,44， 45,46,47,48,49, 50,51，52,53,54, 55,56, 57,59,60,61，62,63,66, 68,69,71，72,73,74， 75, 76,77, 78,79, 81，82,83, 84,85, 86,87, 88,89, 90,91，92,93, 94,95, 96,97, 98,99,100， 101，102,103,104,105,106,107,108,109,110,111，112,114,115,116,117,118,119,120， 121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139, 140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,156,158,159,160,165, 166,167,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185, 186,187,188,191,192,194,195,196,197,198,199,200,203,204,205,206,207,208,209, 210,211,212,213,214,215,216,217,218,220,222,223,224,225,226,227,228,229,230， 231，232,233,234,235,236,237,238,239,240,241，242,243,244,245,246,247,248,249， 250,251，252,253,254,255,256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、267、268、269、 270、271、272、273、274和275,其中所述位置對照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯 草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。在一些實施方案中，枯草桿菌蛋白酶變體包含2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個上述位置。
[0028] 在一些其他實施方案中，本發明提供了分離的枯草桿菌蛋白酶變體，所述變體在 選自BMI測定、蛋黃微樣品測定和/或AAPF活性測定的至少一種測定中具有大於0. 8的性 能指數，以及在LAS穩定性或TCA測定中具有大於0. 8的性能指數，其中所述變體在一個 或多個位置上包含至少一個取代，所述位置選自：1、3、4、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29,30,31，33,35,36,38,40,43,44,45,46,47,48,49， 50,51，52,53,54, 55,56, 57,59,61，62,68,69,72, 73,76,78,84, 86,87,88, 89,90,91，92， 93,94,95,96,97,98,99,100,101，102,103,104,105,106,107,108,109,110,111，112,114， 115,116,117,118,119,120,121，122,124,126,128,129,130,131，132,133,134,135,136， 137,139,140,141，142,143,144,145,146,147,148,149,150,151，152,156,158,159,160， 165,166,167,170,171，172,173,174,175,176,177,180,182,183,184,185,186,187,188， 191，194,195,198,199, 203, 204, 206, 209, 210,211，212,213,215,216,217,218,222,223， 224, 227,228,230,231，232,233,234, 235,236,237, 238, 239, 240, 241，242, 243, 244, 245， 246, 247, 248, 249, 250, 251，252, 253, 255, 256, 258,259,260,261，262,265,267,268,269， 270, 271，272, 273, 274,和275,其中所述位置對照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的 枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。在一些實施方案中，枯草桿菌蛋白酶變體包含2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個上述位置。
[0029] 在一些其他實施方案中，本發明提供了分離的枯草桿菌蛋白酶變體，所述變體在 選自BMI測定、蛋黃微樣品測定和/或AAPF活性測定的至少一種測定中具有大於1的性能 指數，以及在LAS穩定性或TCA測定中具有大於0. 8的性能指數，其中所述變體包含至少3 個取代，所述取代選自：X〇〇lA、X001C，X001E，X001F，X001G，X001H，X001I，X001K，X001L， X001N, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005P, X005Q, X005S, X005T, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007S, X007T, X008A, X008F, X008I, X008L, X008M, X008T, X008V, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010W, X011A, X011I, X011M, X011S, X011V, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X013A, X013G, X013I, X013T, X013V, X014A, X014D, X014E, X014F, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016S, X016T, X016V, X017A, X017F, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021R, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022K, X022L, X022M, 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X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263C, X263F, X263L, X263Y, X264A, X264G, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265K, X265M, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265W, X265Y, X267G, X267I, X267L, X267M, X267N, X267V, X268A, X268G, X268H, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268S, X268V, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270G, X270I, X270L, X270M, X270N, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273L, X273S, X273T, X273V, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M，X275P，X275Q，X275R，X275V 和 X275W，其中所述位置對照 SEQ ID NO :1 所示的解澱 粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。在一些實施方案中，枯草桿菌蛋白 酶變體包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個上述位置。
[0030] 在一些實施方案中，本發明提供了分離的枯草桿菌蛋白酶變體，所述變體在選自 BMI測定、蛋黃微樣品測定和/或AAPF活性測定的至少一種測定中具有大於1的性能指數， 以及在LAS穩定性或TCA測定中具有大於0. 8的性能指數，其中所述變體包含至少3個取 代，所述取代選自：Χ〇〇1Α，X001E，X001G，X001H，X001Q，X001V，X003E，X003H，X003I，X003M， X003S, X003T, X003V, X004T, X004V, X008I, X008V, X009E, X009H, X009N, X009Q, X009S, X009T, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010R, X010S, X010T, X011I, X011V, X012G, X012I, X012N, X012Q, X012S, X012T, X012V, X013A, X013G, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016N, X016P, X016S, X016T, X016V, X017H, X017I, X017M, X017N, X018A, X018C, X018D, X018E, X018G, X018H, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018S, X018T, X018V, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022T, X022V, X022W, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025K, X025L, X025M, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026M, X026N, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027W, X028A, X028I, X028L, X028M, X028V, X029A, X029C, X029G, X029S, X029V, X030A, X030C, X030L, X030M, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031V, X033C, X033M, X033S, X033T, X035I, X035L, X035M, X035P, X036A, X036E, X036S, X036T, X036V, X038C, X038F, X038H, X038I, X038K, X038L, X038M, X038N, X038Q, X038R, X038T, X038V, X038Y, X040A, X040D, X040E, X040I, X040L, X040P, X040V, X043A, X043C, X043D, X043E, X043F, X043G, X043I, X043L, X043M, X043N, X043R, X043S, X043T, X043W, X043Y, X044A, X044C, X044D, X044F, X044G, X044I, X044K, X044L, X044M, X044N, X044Q, X044R, X044S, X044T, X044V, X044Y, X045A, X045D, X045F, X045G, X045H, X045I, X045K, X045L, X045M, X045N, X045P, X045Q, X045R, X045S, X045T, X045V, X045W, X045Y, X046C, X046D, X046E, X046G, X046H, X046I, X046K, X046L, X046M, X046N, X046P, X046Q, X046R, X046S, X046T, X046V, X047G, X047R, X048A, X048C, X048E, X048F, X048H, X048I, X048K, X048L, X048M, X048N, X048P, X048Q, X048R, X048S, X048T, X048V, X048Y, X049A, X049G, X049H, X049S, X049T, X050F, X050H, X050I, X050L, X050T, X050V, X050Y, X051F, X051H, X051K, X051L, X051R, X051S, X051T, X051V, X051W, X052A, X052C, X052E, X052F, X052G, X052H, X052I, X052L, X052M, X052N, X052P, X052Q, X052R, X052T, X052V, X052W, X052Y, X053A, X053C, X053D, X053E, X053G, X053H, X053K, X053L, X053M, X053Q, X053R, X053S, X053T, X053W, X053Y, X054A, X054C, X054D, X054E, X054F, X054H, X054M, X054N, X054Q, X054S, X055C, X055E, X055G, X055H, X055K, X055L, X055P, X055Q, X055S, X055T, X055W, X056A, X056C, X056D, X056E, X056H, X056L, X056M, X056N, X056P, X056Q, X056S, X056T, X057C, X057E, X057F, X057G, X057H, X057I, X057L, X057M, X057N, X057P, X057Q, X057R, X057S, X057T, X057V, X057W, X057Y, X059A, X059D, X059G, X059I, X059L, X059M, X059N, X059Q, X059R, X059S, X059T, X059V, X059W, X061A, X061C, X061D, X061F, X061G, X061H, X061I, X061L, X061M, X061N, X061P, X061R, X061S, X061T, X061V, X061Y, X062C, X062E, X062F, X062H, X062I, X062K, X062L, X062M, X062N, X062Q, X062R, X062S, X062T, X062V, X068I, X068L, X068V, X069A, X069G, X069S, X069T, X072I, X072L, X072T, X072V, X073A, X073C, X073S, X076D, X076N, X078A, X078C, X078E, X078H, X078L, X078M, X078N, X078Q, X078S, X078T, X084C, X084G, X084I, X084M, X084V, X086C, X086P, X087A, X087C, X087D, X087E, X087G, X087K, X087L, X087N, X087S, X087V, X088A, X088C, X088G, X088S, X089A, X089D, X089E, X089G, X089H, X089I, X089N, X089Q, X089R, X089S, X089T, X089W, X090C, X090I, X090L, X090M, X090Q, X090T, X090V, X091D, X091F, X091I, X091N, X091S, X091V, X091W, X091Y, X092A, X092G, X092P, X092R, X092V, X093A, X093C, X093G, X093L, X093M, X093T, X093V, X094K, X094R, X095A, X095C, X095I, X095S, X095V, X096F, X096I, X096L, X096M, X097A, X097D, X097E, X097F, X097G, X097H, X097K, X097L, X097M, X097N, X097P, X097Q, X097R, X097S, X097T, X097V, X097W, X097Y, X098A, X098C, X098D, X098E, X098F, X098G, X098K, X098L, X098N, X098P, X098Q, X098R, X098S, X098T, X098V, X098Y, X099A, X099C, X099F, X099G, X099K, X099M, X099P, X099Q, X099R, X099S, X099T, X099V, X099Y, X100D, XIOOE, XIOOG, XlOOI, X100K, X100N, X100R, X100S, X100T, X100V, X100Y, X101A, X101C, X101D, X101E, X101F, X101G, X101H, X101I, X101K, X101N, X101P, X101Q, X101R, X101S, X101T, X101V, X101Y, X102A, X102G, X102T, X103A, X103C, X103D, X103F, X103G, X103I, X103L, X103N, X103P, X103Q, X103R, X103S, X103T, X103V, X103W, X104C, X104F, X104H, X104I, X104L, X104R, X104S, X104T, X104V, X104W, X104Y, X105A, X105C, X105D, X105E, X105F, X105G, X105K, X105L, X105N, X105Q, X105R, X105S, X105T, X105V, X106A, X106D, X106E, X106G, X106I, X106L, X106R, X106S, X106T, X106V, X106W, X107A, X107C, X107F, X107I, X107L, X107M, X107Q, X107S, X107T, X107V, X108A, X108C, X108I, X108S, X108T, X108V, X109A, X109E, X109F, X109G, X109H, X109I, X109K, X109L, X109M, X109N, X109Q, X109R, X109S, X109T, X109W, X109Y, X110A, X110G, X111F, X111I, X111L, X111M, X112D, X112E, X112I, X112Q, X112V, X114A, X114C, X115C, X11SE, X115G, X115L, X11SM, X115P, X115Q, X115S, X115T, X115W, X115Y, X116A, X116C, X116D, X116F, X116G, X116I, X116K, X116L, X116M, X116N, X116Q, X116S, X116T, X116V, X116W, X117A, X117C, X117N, X117Q, X117R, X117T, X117Y, X118A, X118C, X118D, X118E, X118F, X118G, X118K, X118M, X118N, X118R, X118S, X118V, X118W, X119A, X119F, X119M, X119T, X120A, X120C, X120E, X120F, X120G, X120H, X120I, X120L, X120M, X120N, X120R, X120S, X120T, X120W, X121A, X121C, X121F, X121I, X121L, X121M, X121S, X121T, X121V, X122A, X122G, X122S, X122V, X124G, X124L, X124T, X126A, X126F, X126I, 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X188E, X188F, X188H, X188I, X188K, X188L, X188P, X188Q, X188S, X188T, X191A, X191D, X191Q, X191S, X194A, X194C, X194D, X194E, X194F, X194H, X194I, X194L, X194M, X194P, X194Q, X194R, X194S, X194T, X194W, X194Y, X195C, X195D, X195E, X195G, X195Q, X198I, X198L, X199C, X199M, X199S, X199V, X203C, X203E, X203T, X203V, X204A, X204C, X204E, X204G, X204N, X204S, X206D, X206E, X206H, X206L, X206N, X206Q, X206S, X209F, X209M, X209W, X209Y, X210A, X210C, X210I, X210L, X210M, X210N, X210P, X211A, X211C, X211E, X211G, X211H, X211I, X211M, X211P, X211Q, X211T, X211V, X212C, X212F, X212G, X212H, X212M, X212N, X212R, X212S, X212Y, X213A, X213D, X213E, X213N, X213Q, X213S, X213T, X215A, X215C, X215D, X215E, X215H, X215I, X215K, X215M, X215N, X215S, X215T, X215V, X215Y, X216A, X216C, X216D, X216E, X216F, X216H, X216I, X216L, X216M, X216N, X216Q, X216S, X216V, X216W, X216Y, X217A, X217C, X217D, X217E, X217F, X217K, X217L, X217M, X217Q, X218C, X218D, X218E, X218N, X218Q, X222C, X222M, X222S, X223A, X223S, X224A, X224N, X224S, X224T, X227A, X227C, X227V, X228A, X228G, X228S, X228V, X230A, X230G, X230N, X230S, X230T, X230V, X231A, X231C, X231F, X231G, X231S, X232A, X232L, X232M, X233A, X233C, X233E, X233G, X233I, X233L, X233N, X233Q, X233S, X233T, X233V, X234L, X234M, X234N, X234Q, X234S, X234T, X234V, X235C, X235F, X235G, X235H, X235I, X235K, X235L, X235M, X235N, X235Q, X235R, X235S, X235V, X235W, X235Y, X236A, X236C, X236E, X236F, X236H, X236N, X236Q, X236S, X236T, X236Y, X237A, X237C, X237F, X237G, X237H, X237I, X237K, X237L, X237M, X237Q, X237R, X237S, X237T, X237V, X237W, X237Y, X238C, X238D, X238E, X238F, X238G, X238H, X238I, X238K, X238L, X238M, X238N, X238Q, X238R, X238S, X238T, X238V, X238Y, X239C, X239D, X239F, X239G, X239H, X239K, X239L, X239M, X239N, X239P, X239Q, X239R, X239S, X239T, X239V, X239W, X239Y, X240A, X240C, X240E, X240F, X240I, X240K, X240M, X240N, X240Q, X240R, X240S, X240T, X240W, X240Y, X241A, X241C, X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I, X241K, X241L, X241M, X241N, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242S, X242T, X242V, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243S, X243T, X243V, X243W, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244Q, X244S, X244T, X244V, X244W, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246I, X246L, X246M, X246T, X246V, X247A, X247C, X247F, X247G, X247H, X247K, X247L, X247M, X247N, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248L, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249S, X249T, X249W, X249Y, X250C, X250I, X250L, X250M, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X253A, X253E, X253H, X253M, X253S, X253T, X253W, X255A, X255C, X255D, X255E, X255I, X255L, X255N, X255Q, X255T, X255V, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256S, X256V, X256W, X256Y, X258D, X258G, X259A, X259C, X259E, X259P, X259Q, X259S, X260A, X260D, X260E, X260H, X260I, X260N, X260P, X260S, X260T, X260V, X261A, X261C, X261E, X261F, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262H, X262I, X262L, X262M, X262Q, X262T, X262V, X262Y, X265A, X265D, X265S, X267I, X267L, X268A, X268L, X268V, X269D, X269H, X269N, X269Q, X269S, X270A, X270C, X270G, X270I, X270L, X270N, X270S, X270T, X270V, X271C, X271E, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272L, X272M, X272N, X272P, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273G, X273S, X274A, X274C, X274G, X274L, X274M, X274N, X274S, X274T, X275D, X275E，X275F，X275H、X275K、X275L、X275M、X275P、X275Q 和 X275R，其中所述位置對照 SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。在一些實施 方案中，枯草桿菌蛋白酶變體包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個上述位置。
[0031] 在一些實施方案中，本發明提供了分離的枯草桿菌蛋白酶變體，所述變體在選自 BMI測定、蛋黃微樣品測定和/或AAPF活性測定的至少一種測定中具有大於1的性能指數， 以及在LAS穩定性或TCA測定中具有大於0. 8的性能指數，其中所述變體包含至少3個取 代，所述取代選自：Χ〇〇1Α，X001E，X001G，X001H，X001Q，X001V，X003E，X003H，X003I，X003M， X003S, X003T, X003V, X004T, X004V, X008I, X008V, X009E, X009H, X009N, X009Q, X009S, X009T, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010R, X010S, X010T, X011I, X011V, X012G, X012I, X012N, X012Q, X012S, X012T, X012V, X013A, X013G, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016N, X016P, X016S, X016T, X016V, X017H, X017I, X017M, X017N, X018A, X018C, X018D, XOISE, X018G, X018H, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018S, X018T, X018V, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022T, X022V, X022W, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025K, X025L, X025M, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026M, X026N, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027W, X028A, X028I, X028L, X028M, X028V, X029A, X029C, X029G, X029S, X029V, X030A, X030C, X030L, X030M, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031I, X031M, X031S, X031V, X033C, X033M, X033S, X033T, X035I, X035L, X035M, X035P, X036A, X036E, X036S, X036T, X036V, X038C, X038F, X038H, X038I, X038K, X038L, X038M, X038N, X038Q, X038R, X038T, X038V, X038Y, X040A, X040D, X040E, X040I, X040L, X040P, X040V, X043A, X043C, X043D, X043E, X043F, X043G, X043I, X043L, X043M, X043N, X043R, X043S, 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X148V, X149C, X149I, X149L, X149V, X150A, X150L, X150T, X150V, X151A, X151S, X152A, X152S, X156D, X156E, X156L, X156N, X156S, X156T, X158A, X158C, X158E, X158F, X158H, X158K, X158L, X158M, X158Q, X158R, X158S, X158T, X158V, X159A, X159C, X159E, X159G, X159H, X159M, X159P, X159S, X160A, X160C, X160D, X160F, X160I, X160L, X160M, X160N, X160Q, X160S, X160T, X160V, X160Y, X165I, X165L, X165V, X166A, X166C, X166D, X166E, X166H, X166M, X166S, X166T, X167F, X167Y, X170A, X170D, X170E, X170G, X170H, X170K, X170Q, X170R, X170S, X170V, X170Y, X171C, X171Y, X172A, X172C, X172D, X172G, X172I, X172K, X172L, X172M, X172P, X172Q, X172R, X172S, X172V, X172Y, X173A, X173C, X173D, X173H, X173M, X173N, X173Q, X173T, X174A, X174S, X174T, X174V, X175L, X175M, X175V, X176A, X176S, X177C, X177V, X180T, X180V, X182A, X182D, X182E, X182Q, X183A, X183D, X183N, X183Q, X183S, X184D, X184N, X185A, X185C, X185E, X185H, X185K, X185M, X185N, X185Q, X185T, X185V, X186I, X186K, X186L, X186R, X187A, X187C, X188A, X188D, X188E, X188F, X188H, X188I, XI88K, X188L, X188P, X188Q, X188S, X188T, X191A, X191D, X191Q, X191S, X194A, X194C, X194D, X194E, X194F, X194H, X194I, X194L, X194M, X194P, X194Q, X194R, X194S, X194T, X194W, X194Y, X195C, X195D, X195E, X195G, X195Q, X198I, X198L, X199C, X199M, X199S, X199V, X203C, X203E, X203T, X203V, X204A, X204C, X204E, X204G, X204N, X204S, X206D, X206E, X206H, X206L, X206N, X206Q, X206S, X209F, X209M, X209W, X209Y, X210A, X210C, X210I, X210L, X210M, X210N, X210P, X211A, X211C, X211E, X211G, X211H, X211I, X211M, X211P, X211Q, X211T, X211V, X212C, X212F, X212G, X212H, X212M, X212N, X212R, X212S, X212Y, X213A, X213D, X213E, X213N, X213Q, X213S, X213T, X215A, X215C, X215D, X215E, X215H, X215I, X215K, X215M, X215N, X215S, X215T, X215V, X215Y, X216A, X216C, X216D, X216E, X216F, X216H, X216I, X216L, X216M, X216N, X216Q, X216S, X216V, X216W, X216Y, X217A, X217C, X217D, X217E, X217F, X217K, X217L, X217M, X217Q, X218C, X218D, X218E, X218N, X218Q, X222C, X222M, X222S, X223A, X223S, X224A, X224N, X224S, X224T, X227A, X227C, X227V, X228A, X228G, X228S, X228V, X230A, X230G, X230N, X230S, X230T, X230V, X231A, X231C, X231F, X231G, X231S, X232A, X232L, X232M, X233A, X233C, X233E, X233G, X233I, X233L, X233N, X233Q, X233S, X233T, X233V, X234L, X234M, X234N, X234Q, X234S, X234T, X234V, X235C, X235F, X235G, X235H, X235I, X235K, X235L, X235M, X235N, X235Q, X235R, X235S, X235V, X235W, X235Y, X236A, X236C, X236E, X236F, X236H, X236N, X236Q, X236S, X236T, X236Y, X237A, X237C, X237F, X237G, X237H, X237I, X237K, X237L, X237M, X237Q, X237R, X237S, X237T, X237V, X237W, X237Y, X238C, X238D, X238E, X238F, X238G, X238H, X238I, X238K, X238L, X238M, X238N, X238Q, X238R, X238S, X238T, X238V, X238Y, X239C, X239D, X239F, X239G, X239H, X239K, X239L, X239M, X239N, X239P, X239Q, X239R, X239S, X239T, X239V, X239W, X239Y, X240A, X240C, X240E, X240F, X240I, X240K, X240M, X240N, X240Q, X240R, X240S, X240T, X240W, X240Y, X241A, X241C, X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I, X241K, X241L, X241M, X241N, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242S, X242T, X242V, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243S, X243T, X243V, X243W, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244Q, X244S, X244T, X244V, X244W, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246I, X246L, X246M, X246T, X246V, X247A, X247C, X247F, X247G, X247H, X247K, X247L, X247M, X247N, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248L, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249S, X249T, X249W, X249Y, X250C, X250I, X250L, X250M, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X253A, X253E, X253H, X253M, X253S, X253T, X253W, X255A, X255C, X255D, X255E, X255I, X255L, X255N, X255Q, X255T, X255V, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256S, X256V, X256W, X256Y, X258D, X258G, X259A, X259C, X259E, X259P, X259Q, X259S, X260A, X260D, X260E, X260H, X260I, X260N, X260P, X260S, X260T, X260V, X261A, X261C, X261E, X261F, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262H, X262I, X262L, X262M, X262Q, X262T, X262V, X262Y, X265A, X265D, X265S, X267I, X267L, X268A, X268L, X268V, X269D, X269H, X269N, X269Q, X269S, X270A, X270C, X270G, X270I, X270L, X270N, X270S, X270T, X270V, X271C, X271E, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272L, X272M, X272N, X272P, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273G, X273S, X274A, X274C, X274G, X274L, X274M, X274N, X274S, X274T, X275D, X275E, X275F,
[0032] X275H、X275K、X275L、X275M、X275P、X275Q 和 X275R，其中所述位置對照 SEQ ID NO :1所不的解澱粉芽抱桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的氣基酸序列編號。在一些實施方案 中，枯草桿菌蛋白酶變體包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個上述位置。
[0033] 在一些實施方案中，枯草桿菌蛋白酶變體在一個或多個位置上包含進一步的取 代，所述位置選自 ：18、52、72、117、119、127、144、185、209和213，其中所述位置對照SEQID NO :1所不的解澱粉芽抱桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的氣基酸序列編號。
[0034] 在一些特別優選的實施方案中，前文和本文中描述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體 是GG36變體。在一些優選的實施方案中，GG36變體是SEQ ID NO :2的變體。在一些可選 的實施方案中，前文和本文中描述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體是BPN'變體。
[0035] 在一些其他的實施方案中，分離的枯草桿菌蛋白酶變體包含取代的組合，所述取 代選自：
[0036] S87N/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R,
[0037] S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D, S87N/Q109Q/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S1888/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/ Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/8188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/ S130A/S188S/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118R/S128L/ P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/ N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R, S87R/Q109Q/G118R/ S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/ T213T/N248N, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87D/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/ S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248R, S87N/ Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/ S130A/S188D/T213E/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/ N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/ T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109R/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188D/T213T/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N, S87N/ Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/ S130A/S188R/T213T/N248D, S87R/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/ N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N, S87N/Q109Q/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/ T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188R/T213T/N248N, S87R/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/ Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/ S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/ N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, S87R/Q109D/G118R/ S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/ T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109Q/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188S/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D,和 S87N/Q109Q/G118V/S128LP129Q/S130A/S188R/T213E/N248R，其中所述位置對照 SEQ ID NO :1所不的解澱粉芽抱桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的氣基酸序列編號。
[0038] 在一些其他的實施方案中，分離的枯草桿菌蛋白酶變體包含取代的組合，所述取 代選自：S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D，S87N/Q109Q/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/ T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87R/Q109D/ G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/ S188D/T213E/N248R, S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D,和 S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D，其中所述位置對照 SEQ ID NO :1所不的解澱粉芽抱桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的氣基酸序列編號。
[0039] 在一些其他的實施方案中，分離的枯草桿菌蛋白酶變體包含取代的組合，所述取 代選自：S87D/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D，S87N/Q109D/G118R/ S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87D/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/ T213E/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87N/Q109Q/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188R/T213T/N248D, S87R/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/ Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D,
[0040] 和 S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R，其中所述位置對 照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。
[0041] 在一些其他的實施方案中，本發明提供了分離的枯草桿菌蛋白酶變體，所述變體 包含選自以下的取代的組合：A001C/S024V/I107L、A001I/R045T/I107R/A172T，A001K/ A172L, A001K/A172W, A001K/I072C/L126F, A001K/I072C/L126F/S164Q, A001K/I072C/ V104I/L126F, A001K/I072C/V104I/L126F/S164Q, A001K/I072V, A001K/I072V/L126F, A001K/I072V/L126F/S164F, A001K/I072V/V104I, A001K/I072V/V104I/L126F/S164I, A001K/I072V/V104I/S164F, A001K/I072V/V104I/S164Q, A001K/I107T/A172Q, A001K/ I107V/G127Q, A001K/I107V/G127Q/A172Q, A001K/I107V/G127R/A172Q, A001K/L126F, A001K/L126F/S164F, A001K/L126F/S164I, A001K/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072C, A001K/R045F/I072C/L126F, A001K/R045F/I072C/V104I/S164F, A001K/R045F/I072V/ L126F/S164I, A001K/R045F/I072V/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072V/S164F, A001K/ R045F/I072V/V104G/S164T, A001K/R045F/I107L/A172N, A001K/R045F/I107T, A001K/ R045F/I107V/G127Q, A001K/R045F/L126F/S164F, A001K/R045F/L126F/S164I, A001K/ R045F/S164F, A001K/R045F/V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072C/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072V/L126F, A001K/R045K/I072V/L126F/S164F, A001K/R045K/I072V/ L126F/S164Q, A001K/R045K/I072V/S164F, A001K/R045K/I072V/S164Q, A001K/R045K/ I072V/V104I/L126F/S164F, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164I, A001K/R045K/ I072V/V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I107A/A172T, A001K/R045K/I107R/G127A/ A172N, A001K/R045K/I107T/G127R, A001K/R045K/I107T/G127R/A172Q, A001K/R045K/ L126F, A001K/R045K/L126F/S164I, A001K/R045K/L126F/S164P, A001K/R045K/L126F/ S164Q, A001K/R045K/S164F, A001K/R045K/V104I/S164Q, A001K/R045K/V104L/S164A, A001K/R045N/I107T/G127Q, A001K/R045S/V104C/L126Y/S164F, A001K/S024H/I107T/ G127Q, A001K/S024H/I107T/G127R, A001K/S024H/I107V, A001K/S024H/R045N/I107T, A001K/S024H/R045N/I107T/G127Q/A172Q, A001K/S024L/R045A, A001K/S024N/I107V/ G127T, A001K/S024N/R045K/A172Y, A001K/S024R/I107T, A001K/S024R/R045N/A172C, A001K/S024R/R045N/I107T, A001K/S024R/R045N/I107T/G127R, A001K/S024T/I107T/ G127Q/A172Q, A001K/S024T/R045N/G127Q/A172Q, A001K/S024W/I107T/G127R, AOOIK/ S024W/I107V/G127T/A172Q, A001K/S164Q, A001K/V104E, A001K/V104I/L126F, AOOIK/ V104I/L126F/S164I, A001K/V104I/L126F/S164Q, A001L/I072C, A001L/R045Q/G127H/ A172R, A001L/S024D/R045Y/I107Y, A001M/R045S/I107E/A172D, A001P/A172V, AOOlQ/ R045K/I107T, A001R/A172G, A001R/A172Q, A001R/I107T, A001R/I107T/A172Q, AOOIR/ I107T/G127Q/A172Q, A001R/I107V/A172Q, A001R/R045F, A001R/R045K/A172Q, AOOIR/ R045K/G127R, A001R/R045K/I107T/G127Q, A001R/R045K/I107V/G127R, A001R/R045N/ A172K, A001R/R045N/A172Q, A001R/R045N/I107T, A001R/R045N/I107T/G127Q, AOOIR/ R045N/I107V/A172V, A001R/R045N/I107V/G127Q/A172Q, A001R/R045N/I107V/G127R, A001R/S024H/I107T, A001R/S024H/R045K/I107T, A001R/S024H/R045K/I107T/A172Q, A001R/S024H/R045N/I107T/A172Q, A001R/S024N, A001R/S024R, A001R/S024R/A172H, A001R/S024R/A172Q, A001R/S024R/I107V/A172L, A001R/S024R/I107V/G127R, AOOIR/ S024R/R045F/I107T/G127Q, A001R/S024R/R045F/I107T/G127R, A001R/S024R/R045K/ I107T/G127Q, A001R/S024T/I107T/A172Q, A001R/S024T/R045K/A172Q, A001R/S024T/ R045K/I107L/G127P/A172P, A001R/S024T/R045N/I107T/A172Q, A001R/S024W/I107V/ 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S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185R/Y209W/S256T, S087N/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185V/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S164I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S164Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/L126F/S164F, S087N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/V104I/L126F/S164I,S087N/G118WS128L/P129Q/S130A/V104I/S164I, S087N/G118V/ S128L/P129Q/S130A/V104I/S164Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W, S087N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W/A215I/S256W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ Y209W/S256W, S099H/S103I/G118N, S099K/G118R, S099K/S103N/G118T, S099K/S103P/ G118L/S132N, S099K/S103P/G127Q, S099K/S103P/S132H, S099K/S103R/G118A/S132P, S099N/S132R, S099Q/G118F/G127R, S099Q/G118T/G127Q, S099Q/S103N/G118R/S132N, S099Q/S103N/G118T, S099Q/S103N/G118T/S132H, S099Q/S103N/S132H, S099Q/S103P/ G118R, S099Q/S103P/G118R/S132N, S099Q/S103P/S132H, S099Q/S132R, S099T/G118F, S099T/G118R/S132H, S099T/G118T/S132H, S099T/G118T/S132N, S099T/S103P, S099T/ S103P/G118L/S132H, S101E/N117I, S101E/N117Y/N248K, S101F/N117I/N248I, SlOlF/ N117Y/N248I, S101F/N117Y/N248K, S101F/N248K, S101R/N117I/N248K, S101R/N117Y, S101R/N248K, S101T/N117Y/N248K, S101T/N248I, S101V/N248K, S101Y/N117I/N248K, S101Y/N117Y, S101Y/N248K, S103G/G118I/G127E/S132E, S103L/S132E, S103R/S132P, S144T/N185R, S144T/N185R/Y209W/S256I, S144T/N185R/Y209W/S256T, S144T/N185V, S144V/N185R/S256I, S144V/N185R/Y209W, S144V/N185R/Y209W/S256T, S144V/S256I, S144V/Y209W, S144W/N185R/Y209W/S256T,
[0042] S144W/N185V/Y209W/S256I、S144W/S256I、S144Y/Y209W/S256I、V104E/L126I/ S164L，其中所述位置對照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的 胺基酸序列編號。
[0043] 在一些其他的實施方案中，本發明提供了分離的枯草桿菌蛋白酶變體，所述變體 包含選自以下的取代的組合：TS87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109K，S87N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/ P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/ N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109L/N185R/A215R, S87R/ G118R/S128L/P129Q/S130A/S101K/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/ S101L/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/S101Y/Q109R/S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/I72V/S164I/ S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S24W/S101Y/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N43S/P52V/S101R/Q109R, S87N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S101L/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I/S188D/ N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S24W/S101Y/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S164I, S87R/G118R/S128L/ P129Q/S130A/N76D/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/ N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/V118R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/N76D/S101M, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/N76D/G97P/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/ S101L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ N18K/G97P/S101L/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ I72V/S101L/Q109L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101V/S188D/N248R, S87N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/N185R/A21SR, S87N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/I72V/S101V/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/T213E/N248R, S87N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/ S101H/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101H/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S101L/Q109R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109L/ N185R/A215R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101M/S188D/N248R, N76D/S87R/G118R/ S128L/P129Q/S130A/S188D, N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/N248K, S87N/ G118V/G127S/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101H/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101K/ G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101V/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101Y/G118V/ S128L/P129Q/S130A,
[0044] S87N/S101L/G118V/S128L/P129Q/S130A, I72V/S87N/G118V/S128L/P129Q/ S130A//S164I，其中所述位置對照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶 BPN'的胺基酸序列編號。
[0045] 本發明還提供了分離的核酸，所述核酸編碼前文和本文中提出的枯草桿菌蛋白酶 變體。本發明進一步提供了包含所述核酸的表達載體，所述核酸編碼前文和本文中提出的 枯草桿菌蛋白酶變體。此外，本發明提供了包含所述表達載體的宿主細胞，所述載體編碼的 核酸編碼前文和本文中提出的枯草桿菌蛋白酶變體。
[0046] 本發明還提供了包含本文提供的枯草桿菌蛋白酶變體的清潔組合物。在一些實施 方案中，清潔組合物包含液體的、凝膠的、片劑的、粉末的和/或顆粒狀的去垢劑。在一些其 他實施方案中，所述清潔組合物選自衣物洗滌去垢劑和餐具去垢劑。在一些優選的實施方 案中，清潔組合物包含衣物洗滌去垢劑。在一些特別優選的實施方案中，所述起勁組合物是 重垢型去垢劑。在其他一些實施方案中，清潔組合物包含選自手洗餐具去垢劑和自動化餐 具洗滌去垢劑的餐具去垢劑。在一些優選的實施方案中，本文提供的清潔組合物進一步包 含至少一種漂白試劑。在其他一些實施方案中，本文提供的清潔組合物是無磷的，而在一些 可選的實施方案中，本文提供的清潔組合物是含磷的去垢劑。在一些其他的實施方案中， 本文提供的清潔組合物是冷水型去垢劑。在一些其他的實施方案中，本文提供的清潔組合 物進一步包含至少一種其他的酶。在一些實施方案中,所述清潔組合物包含至少一種其他 的酶，所述酶選自半纖維素酶、纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、木聚糖酶、脂肪 酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶（perhydrolasess)、角質酶、果膠酶、果膠裂解酶、甘露聚糖酶、 角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木質酶、支鏈澱粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、 malanases、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶和澱粉酶，或其混合 物。
[0047] 本發明還提供了用於清潔的方法，其包括提供待清潔的物品和包含至少一種本文 提供的清潔組合物的組合物，以及在有效提供所述物品的清潔的條件下，將所述物品與所 述組合物接觸。在一些實施方案中，該方法進一步包括在將所述物品與所述清潔組合物接 觸後，清洗所述物品的步驟。在一些優選的實施方案中，所述待清潔的物品包括餐具。在一 些可選的實施方案中，所述待清潔的的物品包括織物。 附圖簡介
[0048] 圖1提供了多種參照蛋白酶的比對，所述參照蛋白酶包括：BPN'（SEQ ID NO :1)、 GC GCI-P036(SEQ ID N0:2)、GCI-P037(SEQ ID N0:3)和 GCI-P038(SEQ ID N0:4)。除非 另外說明，則取代位置相對於BPN'給出。
[0049] 圖 2 提供了 pHPLT-GG36 的圖。
[0050] 圖 3 提供了 p2JH-GG36ci 的圖。
[0051] 圖4描述了使用用於變體蛋白酶的eglin c抑制測定所確定的蛋白酶濃度。
[0052] 圖5描述了變體蛋白酶的洗滌性能（BMI微樣品）。
[0053] 發明詳沭
[0054] 本發明提供了用於蛋白質改造的方法，和從所述方法產生的絲氨酸蛋白酶變體。 具體而言，本發明提供相比參照絲氨酸蛋白酶具有一個或多個取代的絲氨酸蛋白酶。此外， 本發明提供包含這類絲氨酸蛋白酶變體的組合物。在一些實施方案中，本發明提供了包含 至少一種的這類絲氨酸蛋白酶變體的清潔組合物。
[0055] 出於實踐的目的，為了產生對特定應用最優的蛋白質，通常並非必須發現蛋白質 空間中的最佳序列。對於大部分應用，待解決的問題是鑑別至少一種滿足或超過多個特性 要求的最小值的蛋白質序列。這要求關於對特定特性有益的突變的知識，以及對任何理想 的特性不利的突變的知識。本發明提供了滿足所述目標的手段，通過鑑別蛋白質中這樣的 位置，所述位置可以被改變從而改良主要特性，並且保持其他特性的值落入理想的範圍內。
[0056] 本發明提供了針對所有的目標特性，評估蛋白質中所有位置的手段，通過在每個 位點建立"位點評估文庫"。在優選的實施方案中，這類文庫在每個位置含有9-19個突變， 並用於評估每個位置在改造蛋白質和構建文庫中的用途。相對於參照酶測量每種特性，並 計算每種變體對比野生型的表觀自由能差異。然後，將這類delta delta G( "S卩，Λ AG"） 表觀值用於確定相加性（additivity)。
[0057] 分析變體的一種理想方式可以是通過在目標過程中變體對比參照蛋白的自由能 差異。過程的Gibbs自由能表示系統可以做的最大的功。相對於參照酶（Λ AG)，自由能的 改變如下：
[0058] Δ AG = -RT ln(k變體/k參照）
[0059] 其中，是變體酶的速率常數，k#M是參照酶的速率常數，R是Gas法定常數，而 T是絕對溫度。大部分測定並非被構建以允許確定真實的自由能，所以利用了這樣的數：
[0060] Δ Δ Gapp = -RT In (P 變體/P 參照）
[0061] 其中，是變體的性能值，而P#M是處於相同條件下的參照酶的性能值。可以預 期，關於數據分布和相加性，Λ AGapp值以相似的方式與Λ AG相似的方式行動。然而，由 於Λ AG是變體相比參照酶可以做的最大量的功，故一般Λ AGapp的量低估了 Λ AG，導致 結果似乎是協同的，因為2個相加位置的特性可能大於通過將它們的Λ AGapp值加在一起 所預測的值。
[0062] 此外，本發明提供了枯草桿菌蛋白酶變體和包含這類變體的組合物。
[0063] 定義
[0064] 除非另外指出，本發明的實踐涉及分子生物學、蛋白質改造、微生物學和重組DNA 中常用的常規技術，落入本領域技術人員的範圍內。此類技術是本領域技術人員已知的，描 述在多種本領域技術人員熟知的教科書和參考文獻中。本文（不論上下文）提及的所有專 利、專利申請、文章和出版物，都通過引用併入本文中。
[0065] 除非本文中另外定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語都具有本發明所屬 領域領域普通技術人員通常理解的相同含義。許多技術詞典是本領域技術人員已知的。雖 然任何與本文所述相似或等價的方法和材料都可用於本發明的實踐中，但優選的方法和材 料是本文所述的。因而，通過整體的參照說明書更詳細的描述了下文直接定義的術語。如 本文中使用的，單數"一"、"該"和"這個"也包括了複數的指代，除非語境中另外明確指出。 數值範圍包括了定義範圍的數。除非另外指出，核酸按從左到右5'至3'方向書寫；胺基酸 序列按從左到右氨基至羧基方向書寫。可以理解，本發明並非意在限於所述特定的方法、規 程和試劑，因其可以根據它們被本領域技術人員所使用的環境而改變。
[0066] 除非另外指出，本發明的實踐使用蛋白質純化、分子生物學、微生物學、重組DNA 技術和蛋白質測序的常規技術，均落入本領域技術人員的知識範圍內。
[0067] 此外，本文提供的小標題不是對本發明的各方面或實施方案的限制，所述限制可 以通過整體參照說明書得出。因而，通過整體的參照說明書更詳細的定義了下文直接定義 的術語。無論如何，為了促進對發明的理解，下文定義的多個術語。
[0068] 如本文中使用的，術語"蛋白酶"和"蛋白水解活性"指表現出水解肽或具有 肽鍵的底物的能力的蛋白質或肽。存在許多普遍已知的用於測量蛋白水解活性的程序 (Kalisz, "Microbial Proteinases,，' In :Fiechter (編著），Advances in Riochemical Engineering/BiotechnolOgy, [1988])。例如，可以通過比較性測定來確定蛋白水解活性， 所述測定分析了各種蛋白酶水解商業底物的能力。可用於分析蛋白酶或蛋白水解活性的示 例性底物包括但不限於二甲基酪蛋白（Sigma C-9801)、牛膠原蛋白（Sigma C-9879)、牛彈 性蛋白（Sigma E-1625)和牛角蛋白（ICN Biomedical902111)。比色測定利用的這類底物 是本領域普遍已知的（見例如，WO 99/34011和U.S.專利號6, 376, 450,均通過引用併入本 文中）。口嫩測定（見例如，〇611\&11'等，4仙1.8丨〇(*6111.，99 :316-320[1979])也可用於確定 在梯度洗脫過程中收集的級分的活性酶濃度。該測定測量了酶水解可溶性的合成底物-- 琥珀醯-丙氨醯-丙氨醯-脯氨醯-苯丙氨醯-對硝基苯胺（suc-AAPF-pNA)--時釋放對 硝基苯胺的速率。在分光光度計上，測量410nm處從水解反應產生黃色的速率，所述速率與 活性酶濃度成正比。此外，280nm處的吸收測量值可以用於確定總蛋白濃度。活性酶/總蛋 白比例給出酶純度。
[0069] 如本文中使用的，術語"枯草桿菌蛋白酶"指MEROPS--肽酶資料庫（Rawlings 等，MEROPS :the peptidase database, Nucl Acids Res,34Database issue, D270-272， 2006)中描述的S8蛋白酶家族的任何成員。如本文中使用的，肽酶家族S8含有絲氨酸內肽 酶枯草桿菌蛋白酶及其同源物（Biochem J，290 :205-218,1993)。家族S8也稱為subtilase 家族，是絲氨酸肽酶中的第二大家族，可以分為2個亞族，枯草桿菌蛋白酶（S08. 001)是 亞族S8A的典型例子，kexin(S08. 070)是亞族S8B的典型例子。以前認為三肽基肽酶 II (TPP-II ;S08. 090)是第三亞族的典型例子，但已確定為錯誤分類。家族S8成員的序列 中具有順序為Asp、His和Ser的催化三聯體，與家族S1、S9和SlO的三聯體順序不同。在 亞族S8A中，活性位點殘基經常存在於基序Asp-Thr/Ser-Gly (與集團（clan)AA中的天冬 氨酸內膚酶家族中的序列基序相似）、His-Gly-Thr_His和Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro 中。在亞族S8B中，催化殘基經常存在於基序Asp-Asp-Gly、His-Gly-Thr-Arg和 Gly-Thr-Ser-Ala/Val-Ala/Ser-Pro中。S8家族的大部分成員是內肽酶，在中性-弱鹼性 PH下是活性的。該家族中的許多肽酶是熱穩定的。酪蛋白通常用作蛋白質底物，而一般合 成底物是suc-AAPF。該家族中的大部分成員是非特異性的肽酶，優先在疏水性殘基之後切 害I]。然而，亞族S8B的成員，例如kexin(S08. 070)和弗林蛋白酶（S08. 071)，在氨基二元酸 之後切割。S8家族的大部分成員被普通的絲氨酸肽酶抑制劑抑制，例如DFP和PMSF。由於 家族的大部分成員出於穩定性的目的結合鈣，因而用EDTA和EGTA可觀察到抑制作用，後兩 者通常被認為是金屬肽酶的特異性抑制劑。蛋白質抑制劑包括火雞卵粘蛋白第三結構域 (101. 003)、鏈黴菌屬（Str印tomyces)枯草桿菌蛋白酶抑制劑（116. 003)，和家族113的成 員，例如eglin C(I13. 001)和大麥抑制劑CI-1A(I13. 005)，其中許多也抑制胰凝乳蛋白酶 (S01. 001)。枯草桿菌蛋白酶前肽自身抑制的，而來自酵母屬（Saccharomyces)的同源蛋白 酶B抑制劑則抑制cerevisin(S08. 052)。現已確定了家族S8的若干成員的三級結構。一 般S8蛋白質結構由3層具有夾在2層螺旋之間的7條鏈β片層組成。枯草桿菌蛋白酶 (S08. 001)是集團SB(SB)的典型結構。儘管結構不同，但枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 (S01. 001)的活性位點可以重疊，提示相似性是趨同進化而非趨異進化的結果。
[0070] 如本文中使用的，術語"蛋白酶變體"和"變體蛋白酶"用於指代與參照蛋白酶相 似，特別是功能相似，但其胺基酸序列中具有突變的蛋白酶，使它們的序列在從1個至20個 位置上與野生型蛋白酶不同。在圖1的比對中顯示了若干示例性參照蛋白酶的成熟區域的 胺基酸序列。在一些優選的實施方案中，本發明提供了 "GG36變體"，其中突變存在於SEQ ID NO :2所示的成熟GG36序列中。
[0071] 如本文中使用的，"芽孢桿菌屬"包括本領域技術人員已知落入"芽孢桿菌"屬中 的所有物種，包括但不限於枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌（B. Iicheniformis)、遲緩芽孢杆 菌（B. lentus)、短芽孢桿菌（B. brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus)、 嗜鹼芽孢桿菌（B.alkalophilus)、解澱粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌（B. clausii)、 耐鹽芽孢桿菌（B. halodurans)、巨大芽孢桿菌（B. megaterium)、凝結芽孢桿菌 (B. coagulans)、環狀芽孢桿菌（B. circulans)、燦爛芽孢桿菌（B. Iautus)和蘇雲金芽孢 桿菌（B. thuringiensis)。認識到芽孢桿菌屬持續經歷著分類學的重新組織。因而，預 計所述屬包括已重分類的物種，包括但不限於此類生物體，例如嗜熱脂肪芽孢桿菌，現稱 為"嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus)"。在存在氧的條件下產 生耐受性內孢子被認為是芽孢桿菌屬的決定性特徵，雖然該特徵也應用於目前稱為脂環 酸桿菌屬（Alicyclobacillus)、雙芽孢桿菌屬（Amphibacillus)、解硫胺素芽孢桿菌屬 (Aneurinibacillus)、厭氧芽抱桿菌屬（Anoxybacillus)、短芽抱桿菌（Brevibacillus)、 Filobacillus、薄壁芽抱桿菌屬（Gracilibacillus)、喜鹽芽抱桿菌屬（Halobacillus)、 類芽孢桿菌屬（Paenibacillus)、需鹽芽孢桿菌屬（Salibacillus)、耐熱芽孢桿菌屬 (Thermobacillus)、Ureibacillus 和枝芽抱桿菌屬（Virgibacillus)。
[0072] 術語"多核苷酸"和"核酸"，在本文中可互換的使用，指任意長度的核苷酸的聚合 形式，核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。這類術語包括但不限於單鏈、雙鏈或三鏈DNA、基因 組DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA雜合體，或包含嘌呤和嘧啶鹼基，或其他天然的、化學的、生物化 學的修飾的、非天然的或衍生的核苷酸鹼基的多聚體。下列是多核苷酸的非限制性實例： 基因、基因片段、染色體片段、EST、外顯子、內含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核 苷酸、分支的多核苷酸、質粒、載體、任意序列的分離的DNA、任意序列的分離的RNA、核酸探 針，和引物。在一些實施方案中，多核苷酸包含修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷 酸類似物、尿嘧啶、其他的糖類和連結基團，例如氟核糖和硫醯，以及核苷酸支鏈。在可選的 實施方案中，通過非核苷酸組分中斷核苷酸的序列。
[0073] 如本文中使用的，術語"DNA構建體"和"轉化DNA"可互換的用於指用於將序列導 入宿主細胞或生物體中的DNA。可以通過PCR或任何本領域技術人員已知的其他合適的技 術，在體外產生DNA。在特別優選的實施方案中，DNA構建體包括目標序列（例如，作為引入 序列）。在一些實施方案中，序列與其他元件有效連接，例如控制元件（例如，啟動子等）。 DNA構建體可以進一步包含選擇性標誌物。它可以進一步包含兩側有同源盒的引入序列。 在進一步的實施方案中，轉化DNA包含添加在其末端的其他非同源序列（例如，填充序列或 側翼）。在一些實施方案中，引入序列的末端是封閉的，使得轉化DNA形成封閉的環。轉化 序列可以是野生型、突變或修飾的。在一些實施方案中，DNA構建體包含與宿主細胞染色體 同源的序列。在其他實施方案中，DNA構建體包含非同源的序列。一旦在體外裝配了 DNA構 建體，則它可用於：1)將異源序列插入到宿主細胞的理想的靶序列中，和/或2)突變宿主 細胞染色體的區域（即，用異源序列替換內源序列），3)刪除靶基因，和/或4)將複製質粒 導入宿主中。
[0074] 如本文中使用的，術語"表達盒"和"表達載體"指重組或合成產生的核酸構建體， 具有一系列專門的核酸元件，所述核酸元件允許特定核酸在靶細胞中的轉錄。可以將重組 表達盒整合到質粒、染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。一般的，除其他序列 夕卜，表達載體的重組表達盒部分包括待轉錄的核酸序列和啟動子。在優選的實施方案中，表 達載體具有在宿主細胞中整合和表達異源DNA片段的能力。許多原核和真核表達載體是可 商購的。適當的表達載體的選擇落入本領域技術人員的知識範圍內。術語"表達盒"在本 文中可與"DNA構建體"及其語法學的等價體互換的使用。適當表達載體的選擇落入本領域 技術人員的知識範圍內。
[0075] 如本文中使用的，術語"載體"指涉及用於將核酸導入一種或多種細胞類型中的多 核苷酸構建體。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、盒等。在一些實施方案中， 多核苷酸構建體包含編碼蛋白酶（例如，前體或成熟的蛋白酶）的DNA序列，所述DNA序列 與能夠在合適的宿主中進行DNA表達的合適的前序列（例如，分泌性的等）有效連接。
[0076] 如本文中使用的，術語"質粒"指用作克隆載體的環狀雙鏈（ds)DNA構建體，所述 構建體在一些真核或原核細胞中形成染色體外的自我複製性遺傳元件，或整合到宿主染色 體中。
[0077] 如本文中使用的，在將核酸序列導入到細胞中的語境中，術語"導入"指適合將核 酸序列轉移到細胞中的任何方法。此類用於導入的方法包括但不限於原生質體融合、轉染、 轉化、接合和轉導（見例如，Ferrari 等，"Genetics, "in Hardwood 等，（編著），Bacillus, Plenum Publishing Corp.，第 57-72 頁，[1989])。
[0078] 如本文中使用的，術語"轉化"和"穩定的轉化"指具有這樣的非天然（異源的） 多核苷酸序列的細胞，所述序列整合到所述細胞的基因組中，或作為附加體質粒維持至少2 個世代。
[0079] 如本文中使用的，當核酸置於與另一種核酸序列的功能性關係中時，所述核酸是 "有效連接"的。例如，如果作為參與多肽分泌的前蛋白質表達，則編碼分泌性前導子（即， 信號肽）的DNA是與多肽的DNA有效連接的；如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，則它們 是與編碼序列有效連接的；或者如果核糖體結合位點的放置有利於翻譯，則它是與編碼序 列有效連接的。一般而言，"有效連接"意指所連接的DNA序列是連續的，和在分泌性前導子 的情況下，是以可讀相（reading phase)連續的。然而，增強子不是必須連續的。通過在方 便的限制性位點連接而完成連接。如果不存在此類位點，則根據常規實踐使用合成的寡核 苷酸銜接子或接頭。
[0080] 如本文中使用的，術語"基因"指編碼多肽的多核苷酸（例如，DNA片段），並包括在 編碼區之前和之後的區域，以及在單個的編碼片段（外顯子）之間的間插序列（內含子）。
[0081] 如本文中使用的，"同源基因"指來自不同但通常相關的物種的成對基因，它們彼 此對應，並且彼此相同或高度相似。該術語涵蓋了被物種形成（即，新物種的產生）分開的 基因（例如，直向同源基因），以及被基因複製分開的基因（例如，旁系同源基因）。
[0082] 如本文中使用的，如果蛋白質具有相同排列的相同的主要二級結構且具有相同的 分類學聯繫，則所述蛋白質定義為具有共同"摺疊（fold)"。具有相同摺疊的不同蛋白質通 常具有大小和構象不同的二級結構的外周元件和轉角區。在一些情況下，這些不同的外周 區可以包含一半的所述結構。一起置於相同的摺疊類別中的蛋白質不必需具有共同的進化 起源（例如，源自蛋白質的物理和化學的、有利於某些壓縮排列（packing arrangement)和 鏈拓撲學的結構相似性）。
[0083] 如本文中使用的，"同源性"指序列的相似性或同一性，優選指同一性。這種同源 性是使用本領域已知的標準技術確定的（見例如，Smith和Waterman, Adv. Appl. Math.， 2 :482[1981] ;Needleman 和 Wunsch, J.Mol.Biol· ,48 :443[1970] ;Pearson 和 Lipman， Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :2444 [1988];程序例如 Wisconsin 遺傳學軟體包（Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA (Genetics Computer Group、Madison、WI);以及 Devereux 等，Nucl. Acid Res.，12 :387-395 [1984])。
[0084] 有效算法的一個實例是PILEUP。PILEUP使用漸進的、成對的比對，從一組相關的 序列中產生多重序列比對。它還可以繪製樹狀圖，顯示用於產生比對的成簇關係。PILEUP 使用Feng和Doolittle的漸進比對方法的簡化版（Feng和Doolittle, J. Mol. Evol.， 35 :351_360[1987])。所述方法與 Higgins 和 Sharp 所述的方法相似（Higgins 和 Sharp, CABI0S5 :151-153 [1989])。有效的PILEUP參數包括默認的空位權重3. 00,默認的空位長 度權重0. 10,和加權的末端空位。
[0085] 有效算法的另一個實例是BLAST算法，如Altschul等（Altschul等，J. Mol. Biol.， 215 :403-410，[1990];和 Karlin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :5873-5787 [1993])所 述。特別有效的 BLAST 程序是 WU-BLAST-2 程序（見，Altschul 等，Meth. Enzymol.，266 : 460-480[1996])。WU-BLAST-2使用若干搜索參數，大部分設定為默認值。可調節的參數用 下列值設定：重疊跨度=1，重疊分數=〇. 125,字節閾值（T) = 11。HSP S和HSP S2參數 是動態值，由程序本身根據特定序列的組成和將搜索目標序列的特定資料庫的組成而確定 的。然而，可以調節所述值以增加靈敏度。通過匹配的相同殘基數除以比對區域中"較長" 序列的殘基總數，來確定A%胺基酸序列同一性的值。"較長"序列是在比對區域中具有最 多實際殘基的序列（忽視WU-Blast-2為了最大化比對分數而導入的空位）。
[0086] 因而，"百分比（％)核酸序列同一性"定義為候選序列中，與起始序列（即，目標 序列）的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比。優選的方法利用WU-BLAST-2的BLASTN 模塊，設定為默認參數，具有重疊跨度和重疊分數分別設為1和〇. 125。
[0087] 如本文中使用的，"重組"包括指代細胞或載體，其通過引入異源核酸序列而進行 修飾,或者該細胞來源於上述修飾的細胞。因此,例如，由於有意的人為幹預,重組細胞表達 不以相同形式存在於天然（非重組）形式的細胞中的基因，或者表達本來異常表達、低表達 或完全不表達的天然基因。"重組"和產生"重組"核酸一般組裝兩個或更多個核酸片段，其 中這種組裝產生嵌合基因。
[0088] 在一些優選的實施方案中，產生在至少一個密碼子處進行位點飽和誘變的突變 DNA序列。在另一優選的實施方案中，對兩個或多個密碼子進行位點飽和誘變。在進一步 的實施方案中，突變DNA序列與野生型序列具有高於約50 %、高於約55 %、高於約60 %、高 於約65 %、高於約70 %、高於約75 %、高於約80 %、高於約85 %、高於約90 %、高於約95 % 或高於約98%的同源性。在備選實施方案中，突變DNA使用任何已知的誘變方法在體內產 生，例如輻射、亞硝基胍等。接著分離期望的DNA序列並用於本文提供的方法。
[0089] 如本文中使用的，術語"擴增"和"基因擴增"指不成比例的複製特定DNA序列的 過程，使得所擴增的基因成為高於其初始存在於基因組中的拷貝數而存在。在一些實施方 案中，通過在存在藥物（例如，可抑制的酶的抑制劑）的條件下生長，來選擇細胞，導致編碼 基因產物的內源基因的擴增，或者導致編碼該基因產物的外源（即，輸入的）序列的擴增， 或者兩者的擴增，其中所述基因產物是在存在藥物的條件下的生長所必需的。
[0090] "擴增"是涉及模板特異性的核酸複製的特殊情況。它與非特異性模板複製（即， 是模板依賴性的複製，但並不依賴於特定的模板）相反。模板特異性在此有別於複製的保 真性（即，正確的多核苷酸序列的合成）和（核糖或脫氧核糖）核苷酸特異性。模板特異 性經常以"靶"特異性來描述。靶序列是這樣含義的"靶"，即它們被視為是從其他核酸中挑 選出來的。擴增技術主要是出於該挑選而設計的。
[0091] 如本文中使用的，術語"引物"指當置於引物延伸產物合成的條件下時，能夠作為 合成起點發揮作用的寡核苷酸，不論是作為純化的限制性酶消化產物而天然存在的，還是 合成產生的，其中所述延伸產物是與誘導的核酸鏈互補的（即，在存在核苷酸和誘導劑如 DNA聚合酶的條件，以及合適的溫度和pH)。出於複製的最大效率，引物優選是單鏈，但可以 可選的是雙鏈的。如果是雙鏈的，則首先處理引物，在用於製備延伸產物前分離它的鏈。優 選的，引物是寡聚脫氧核糖核苷酸。引物必需足夠長，以在存在誘導劑的條件下引發延伸產 物的合成。引物的實際長度將取決於多種因素，包括溫度、引物來源和所使用的方法。
[0092] 如本文中使用的，術語"探針"指能夠與另一種目標寡核苷酸雜交的寡核苷酸（即 核苷酸的序列），不論是作為純化的限制性酶消化產物而天然存在的，還是合成的、重組的 或通過PCR擴增而產生的。探針可以是單鏈的或雙鏈的。探針可用於檢測、鑑別和分離特 定的基因序列。可以預期，可以用任何"報告分子"標記用於本發明中的任何探針，使得它 在任何檢測系統中是可檢測的，包括但不限於酶（例如，ELISA，以及基於酶的組織化學測 定）、螢光、放射性自顯影和化學發光系統。本發明並非意在限於任何特定的檢測系統或標 記。
[0093] 如本文中使用的，當用於指代聚合酶鏈式反應時，術語"靶"指用於聚合酶鏈式反 應的引物所結合的核酸區域。因而，"靶"被認為是從其他核酸序列中挑選出來的。"片段" 定義為靶序列中的核酸區域。
[0094] 如本文中使用的，術語"聚合酶鏈式反應（PCR)"指美國專利號4, 683, 195、 4, 683, 202和4, 965, 188 (引入本文作為參考）的方法，其包括在不進行克隆或純化的條件 下，用於增加基因組DNA混合物中靶序列片段濃度的方法。該用於擴增靶序列的過程是本 領域普遍已知的。
[0095] 如本文中使用的，術語"擴增試劑"指這樣的試劑（脫氧核糖核苷酸三磷酸、緩衝 液，等），所述試劑是除引物、核酸模板和擴增酶以外，擴增所需要的。一般的，將擴增試劑與 其他反應組分一起放置，並包含在反應容器（試管、微孔等）中。
[0096] 如本文中使用的，術語"限制性內切酶"和"限制性酶"指細菌的酶，每種所述的酶 在特定的核苷酸序列處或其附近切割雙鏈DNA。
[0097] "限制性位點"指被給定的限制性內切酶識別和切割的核苷酸序列，經常是DNA片 段插入物的位點。在本發明的某些實施方案中，將限制性位點改造到選擇性標誌物中，以及 DNA構建體的5'和3'末端中。
[0098] "同源重組"意指在相同或幾乎相同的核苷酸序列的位點，兩種DNA分子或成對染 色體之間的DNA片段的交換。在優選的實施方案中，染色體整合是同源重組。
[0099] 如本文中使用的，"胺基酸"指肽或蛋白質序列或其部分。術語"蛋白質"、"肽"和 "多肽"可互換的使用。
[0100] 如本文中使用的，"目標蛋白"和"目標多肽"指理想的和/或正在進行評估的蛋白 質/多肽。在一些實施方案中，目標蛋白在胞內表達，而在其他實施方案中，目標蛋白是分 泌的多肽。在特別優選的實施方案中，這些酶包括本發明的絲氨酸蛋白酶。在一些實施方 案中，目標蛋白是與信號肽（即，待分泌蛋白質的氨基端延伸）融合的分泌多肽。幾乎所有 的分泌蛋白質都利用氨基端末端的蛋白質延伸，其在前體蛋白跨膜的靶向和轉運中發揮關 鍵作用。這種延伸在膜轉運過程中或轉運後立即被信號肽酶通過蛋白水解切除。
[0101] 如果多核苷酸的天然狀態或當通過本領域技術人員已知的方法操作時，它可以轉 錄和/或翻譯成產生RNA、多肽或其片段，則所述多核苷酸被稱為"編碼"所述RNA或所述多 肽。此類核酸的反義鏈也被稱為編碼所述序列。如本領域已知的，DNA可以通過RNA聚合 酶轉錄來產生RNA，而RNA可以通過逆轉錄酶逆轉錄來產生DNA。因而，DNA可以編碼RNA， 反之亦然。
[0102] "宿主菌株"或"宿主細胞"指用於表達載體的合適的宿主,所述表達載體包含根據 本發明的DNA。
[0103] 如果酶在細胞中表達的水平高於它在相應的野生型細胞中表達的水平，則所述酶 在宿主細胞中是"過表達的"。
[0104] 術語"蛋白質"和"多肽"在本文中可互換使用。本公開文本中全篇均使用與 IUPAC-IUB生物化學命名委員會（JCBN) -致的3字母胺基酸代碼。可以理解，由於遺傳密 碼的簡併性，可以由一種以上的核苷酸序列編碼一種多肽。
[0105] "前序列"是在信號序列和成熟蛋白酶之間的胺基酸序列，是蛋白酶的分泌所必需 的。前序列的切割導致成熟的活性蛋白酶。
[0106] 術語"信號序列"或"信號肽"指可參與成熟或前體形式的蛋白質分泌的任何核苷 酸和/或胺基酸序列。信號序列的該定義是功能性的，意在包括所有上述的胺基酸序列， 所述信號序列是由蛋白質基因的N端部分編碼的，參與蛋白質分泌的實行。它們通常但不 總是與蛋白質的N端部分或前體蛋白質的N端部分結合。信號序列可以是內源性的或外 源性的。信號序列可以是與所述蛋白質（例如，蛋白酶）正常相關的，或者可以來自編碼 另一種分泌蛋白質的基因 。一個示例性的外源信號序列包含來自枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的信號序列的前七個胺基酸殘基，所述殘基與遲緩芽孢桿菌（ATCC21536)的枯 草桿菌蛋白酶的信號序列剩餘部分融合。
[0107] 術語"雜交信號序列"指這樣的信號序列，其一部分是從表達宿主獲得的，所述部 分與待表達的基因的信號序列融合。在一些實施方案中，利用合成序列。
[0108] 術語"成熟"形式的蛋白質或肽指蛋白質或肽的最終功能形式。
[0109] 術語蛋白質或肽的"前體"形式指具有與蛋白質的氨基或羧基端有效連接的前序 列的蛋白質的成熟形式。前體也可以具有與前序列的氨基端有效連接的"信號"序列。前 體還可以具有涉及翻譯後活性（例如，從其切除多核苷酸，留下成熟形式的蛋白質或肽）的 其他多核苷酸。
[0110] "天然存在的酶"指具有與自然界中相同的未修飾胺基酸序列的酶。天然存在的酶 包括天然酶，由特定的微生物表達或存在於其中的那些酶。
[0111] 術語"來自"和"得自"不僅指由或可由目的生物菌株產生的蛋白酶，還指由從這 些菌株中分離的DNA序列編碼並在含有此類DNA序列的宿主生物中產生的蛋白酶。此外， 該術語指由合成和/或cDNA來源的DNA序列編碼並具有目的蛋白酶的所述鑑定特徵的蛋 白酶。例如，"來自芽孢桿菌的蛋白酶"指具有芽孢桿菌天然產生的蛋白水解活性的酶，以及 這樣的絲氨酸蛋白酶，其與芽孢桿菌來源所產生的酶相似，但使用遺傳工程技術由轉化有 編碼該絲氨酸蛋白酶的核酸的非芽孢桿菌生物產生。
[0112] 該定義範圍內的"衍生物"通常保留野生型、天然或親本（reference)形式中觀察 到的特徵性蛋白水解活性，其保留程度使得該衍生物可用於與所述野生型、天然或親本形 式相似的目的。絲氨酸蛋白酶的功能性衍生物包括天然存在的、合成或重組產生的肽或肽 片段，其具有本發明絲氨酸蛋白酶的一般特徵。
[0113] 術語"功能性衍生物"指核酸的衍生物，其具有編碼絲氨酸蛋白酶的核酸的功能性 特徵。編碼本發明絲氨酸蛋白酶的核酸的功能性衍生物包括天然存在的、合成或重組產生 的核酸或片段，並編碼本發明的特徵性絲氨酸蛋白酶。編碼本發明絲氨酸蛋白酶的野生型 核酸包括天然存在的等位基因以及基於本領域已知的遺傳密碼簡併性的同源物。
[0114] 術語"相同"在兩個核酸或多肽序列的情況下指以最高對應性為目的比對後在兩 序列中相同的殘基，這使用以下序列比較或分析算法之一來測量。
[0115] 術語"最佳比對"指該比對給出最高的百分比同一性分數。
[0116] 就兩個胺基酸、多核苷酸和/或基因序列（適當地）而言，"百分比序列同一性"、 "百分比胺基酸序列同一性"、"百分比基因序列同一性"和/或"百分比核酸/多核苷酸序 列同一性"指所述序列在最佳比對後兩序列中相同殘基的百分比。因此，80%胺基酸序列同 一性表示在兩個最佳比對的多肽序列中80 %的胺基酸是相同的。
[0117] 因而，短語"基本相同"在兩個核酸或多肽的情況下指使用程序或算法（例如， BLAST、ALIGN、CLUSTAL)使用標準參數與參考序列比較時包含至少約70%序列同一性、優 選至少約75%、優選至少約80%、優選至少約85%、優選至少約90%、優選至少約95%、優 選至少約97%、優選至少約98%並優選至少約99%序列同一性的多核苷酸或多肽。兩多肽 基本相同的一個指標是第一個多肽與第二個多肽具有免疫學交叉反應性。一般地，由於保 守性胺基酸替換而不同的多肽具有免疫學交叉反應性。因此，當兩多肽僅由於保守性替換 而不同時，一個多肽與另一多肽基本相同。兩核酸序列基本相同的另一指標是這兩個分子 在嚴格條件下（例如，在中至高嚴格條件下）彼此雜交。
[0118] 術語"等同的"在本文中指由在中至高嚴格條件下，能夠與具有SEQ ID NO :1或 SEQ ID NO :5所示序列的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的絲氨酸蛋白酶。例如，等同的 表示等同的成熟絲氨酸蛋白酶與具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示胺基酸序列的成熟 BPN'或GG36絲氨酸蛋白酶包含至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少 約90 %、至少約91 %、至少約92 %、至少約93 %、至少約94%、至少約95 %、至少約96 %、至 少約97%、至少約98%和/或至少約99%序列同一性。
[0119] 術語"分離的"或"純化的"指從其原始環境（例如，如果是天然存在的，則為其天 然環境）從移出的材料。例如，如果材料在特定組合物中以高於天然或野生型生物中的濃 度存在，或者與在天然或野生型生物中表達後通常不存在的組分組合，則它是"純化的"。例 如，存在於活動物中的天然多核苷酸或多肽不是分離的，但相同的多核苷酸或多肽在與該 天然系統中的一些或所有共存材料分開後則是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部 分，和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，但仍然是分離的，因為此類載體 或組合物不是其天然環境的一部分。例如，在優選的實施方案中，如果核酸或蛋白質在電泳 凝膠或印跡中基本給出一條帶，則稱其是純化的。
[0120] 在涉及DNA序列使用時，術語"分離的"指這樣的DNA序列，其從其天然遺傳環境中 移出，因此不含有其他外來的或不想要的編碼序列，並且為適於在經遺傳改造的蛋白質產 生系統中使用的形式。這樣的分離的分子是從其天然環境中分離的分子，包括cDNA和基因 組克隆。本發明的分離的DNA分子不含有與其通常相關聯的其他基因，但可能包含天然存 在的5'和3'非翻譯區，例如啟動子和終止子。相關區域的鑑定對於本領域普通技術人員 而言是很明顯的（見例如，Dynan和Tijan，Nature316 :774-78[1985])。術語"分離的DNA 序列"也稱為"克隆的DNA序列"。
[0121] 在涉及蛋白質使用時，術語"分離的"指在其天然環境以外的條件下存在的蛋白 質。在一種優選形式中，分離的蛋白質基本不含其他蛋白質，特別是其他同源蛋白質。通過 SDS-PAGE測定時，分離的蛋白質的純度高於約10%，優選高於約20%，甚至更優選高於約 30%。本發明的另一些方面包括通過SDS-PAGE測定為高純化形式（即純度高於約40%、高 於約60 %、高於約70 %、高於約80 %、高於約90 %、高於約95 %、高於約97 %，甚至高於約 99% )的蛋白質。
[0122] 如本文中使用的，術語"組合誘變"指產生起始序列的變體文庫的方法。在這 些文庫中，變體含有選自預定突變組的一個或多個突變。此外，該方法提供了引入不在 預定突變組中的隨機突變的方法。在一些實施方案中，該方法包括2000年10月26日 提交的美國專利申請序列號09/699. 250中公開的方法，該申請併入本文作為參考。在 備選實施方案中，組合誘變方法包括市售的試劑盒（例如，QUIKCHANGE? Multisite (Stratagene))〇
[0123] 如本文中使用的，術語"突變體文庫"指基因組大部分相同但包含一個或多個基因 的不同同源物的細胞群。這樣的文庫可用於例如鑑定具有改進性狀的基因或操縱子。
[0124] 如本文中使用的，術語"起始基因"指編碼待使用本發明進行改進和/或改變的目 的蛋白的目的基因。
[0125] 如本文中使用的，術語"多重序列比對"（"MSA"）指使用算法（例如，Clustal W) 比對的起始基因的多個同源物的序列。
[0126] 如本文中使用的，術語"共有序列"和"範例序列"指將特定蛋白質或目的序列的所 有變體與其進行比較的原型胺基酸序列。該術語還指顯示目的DNA序列中最常存在的核苷 酸的序列。對基因的每個位置而言，共有序列給出在MSA中該位置上豐度最高的胺基酸。
[0127] 如本文中使用的，術語"共有突變"指起始基因與共有序列之間的序列差異。共有 突變通過將起始基因的序列與從MSA所得共有序列進行比較來鑑定。在一些實施方案中， 將共有突變引入起始基因中，以使其與共有序列更為相似。共有突變還包括這樣的胺基酸 改變：該改變將起始基因中的胺基酸改變成MSA中發現的在該位置上頻率高於起始基因中 胺基酸的頻率的胺基酸。因此，術語共有突變包括將起始基因中的胺基酸替換為比MSA中 胺基酸更豐富的胺基酸的所有單個胺基酸改變。
[0128] 如本文中使用的，術語"初始命中"指通過篩選組合共有誘變文庫而鑑定的變體。 在優選的實施方案中，初始命中與起始基因相比具有改進的性能特徵。
[0129] 如本文中使用的，術語"改進命中"指通過篩選增強的組合共有誘變文庫而鑑定的 變體。
[0130] 如本文中使用的，術語"改進突變"和"性能增強突變"指在引入起始基因時導致 性能改善的突變。在一些優選的實施方案中，通過在所述方法的篩選步驟過程中鑑別的測 序命中來鑑別這類突變。在多數實施方案中，與未篩選的組合共有誘變文庫相比，命中中更 頻繁出現的突變很可能是改善的突變。
[0131] 如本文中使用的，術語"增強的組合共有誘變文庫"指基於之前輪次的CCM誘變和 篩選的篩選和/或測序結果而設計和構建的CCM文庫。在一些實施方案中，增強的CCM文庫 是基於之前輪次的CCM所得初始命中的序列。在另一些實施方案中，設計增強的CCM以有 利於在之前輪次的誘變和篩選中的初始命中中更常見的突變。在一些優選的實施方案中， 這通過省略編碼性能降低突變的引物來實現，或者通過相對於之前的CCM文庫中所使用其 他引物提高編碼性能增強突變的引物的濃度來實現。
[0132] 如本文中使用的，術語"性能降低突變"指在組合共有誘變文庫中的突變，其在篩 選所得命中中的頻率與未篩選的組合共有誘變文庫相比更低。在優選的實施方案中，篩選 方法除去和/或降低含有"性能降低突變"的變體的豐度。
[0133] 如本文中使用的，術語"功能性測定"指提供蛋白質活性的指標的測定。在特別優 選的實施方案中，該術語指分析蛋白質以其通常的能力發揮功能的測定系統。例如，對於酶 的情況，功能性測定包括測定該酶在催化反應方面的有效性。
[0134] 如本文中使用的，術語"靶特性"指待改變的起始基因的特性。本發明並不意在僅 限於任何特定的靶特性。然而，在一些優選的實施方案中，靶特性為基因產物的穩定性（例 如，對變性、蛋白水解或其他降解因素的抗性），而在另一些實施方案中，改變了在產生宿主 中的產生水平。事實上，起始基因的任何特性均可用於本發明。
[0135] 如本文中使用的，在核酸的情況下，術語"特性"或其語法等同語指核酸的任何可 以選擇或檢測的特性或屬性。這些特性包括但不限於影響與多肽結合的特性、賦予包含特 定核酸的細胞的特性、影響基因轉錄的特性（如啟動子強度、啟動子識別、啟動子調節、增 強子功能）、影響RNA加工的特性（例如，RNA剪接、RNA穩定性、RNA構象和轉錄後修飾）、 影響翻譯的特性（例如，水平、調節、mRNA與核糖體蛋白的結合、翻譯後修飾）。例如，可以 改變核酸的轉錄因子、聚合酶、調節因子等的結合位點，以產生期望的特徵或鑑定不期望的 特徵。
[0136] 如本文中使用的，在多肽的情況下，術語"特性"或其語法等同語指多肽的任何可 選擇或檢測的特徵或屬性。這些特性包括但不限於氧化穩定性、底物特異性、催化活性、熱 穩定性、鹼穩定性、pH活性譜、對蛋白水解降解的抗性、K M、kMt、kMt/kM比、蛋白質摺疊、誘導 免疫應答、結合配體的能力、結合受體的能力、分泌能力、展示於細胞表面的能力、寡聚化能 力、信號能力、刺激細胞增殖的能力、抑制細胞增殖的能力、誘導凋亡的能力、通過磷酸化或 糖基化進行修飾的能力，和/或治療疾病的能力等。
[0137] 如本文中使用的，術語"篩選"具有本領域的通常含義，一般為多步驟過程。在第 一步中，提供突變核酸或其變體多肽。在第二步中，測定該突變核酸或變體多肽的特性。在 第三步中，將所測特性與相應的前體核酸的特性、相應天然多肽的特性或產生該突變核酸 的起始材料（例如，初始序列）的特性進行比較。
[0138] 對於本領域技術人員而言很明顯的是，用於獲得具有改變特性的核酸或蛋白質的 篩選方法取決於起始材料的特性，將通過產生該突變核酸來促進其修飾。因此，本領域技術 人員會理解，本發明不受限於任何待篩選的具體特性，以下特性描述僅列出了說明性的實 例。用於篩選任何特定特性的方法已在本領域中有一般性描述。例如，可以在突變前後測 量結合、pH、特異性等，其中的變化表明產生了改變。優選地，以高通量方式進行篩選，包括 同時篩選多個樣品，包括但不限於使用晶片、噬菌體展示和多種底物和/或指示劑進行的 測定。
[0139] 在一些實施方案中，本文使用的篩選涵蓋了選擇步驟，其中從變體群中富集目的 變體。這些實施方案的實例包括選擇賦予宿主生物生長優勢的變體，以及噬菌體展示或任 何其他展示方法，其中變體可基於其結合或催化特性而從變體群中被捕獲。在優選的實施 方案中，使變體文庫暴露於脅迫（例如，熱、蛋白酶、變性等），其後在篩選中鑑定仍完整的 變體或通過選擇來富集所述變體。該術語旨在涵蓋任何合適的選擇方法。事實上，本發明 並非意在限於任何特定的篩選方法。
[0140] 如本文中使用的，術語"靶向隨機化"指產生其中一個或多個位置已被隨機化的復 數序列的方法。在一些實施方案中，隨機化是完全隨機化（即，所有的四種鹼基A、T、G和 C都可出現在隨機化位置）。在備選實施方案中，核苷酸的隨機化僅限於這四種核苷酸的一 個亞組。靶向隨機化可應用於序列的一個或多個密碼子，編碼一種或多種目的蛋白。表達 時，所得的文庫產生蛋白質群，其中一個或多個胺基酸位置可含有所有20種胺基酸或氨基 酸亞組的混合物，這是由隨機化密碼子的隨機化方案決定。在一些實施方案中，靶向隨機化 所得群體中的個體成員由於密碼子的靶向或隨機插入或缺失而存在胺基酸數目的差異。在 另一些實施方案中，所產生的蛋白質群中包括合成的胺基酸。在一些優選的實施方案中，靶 向隨機化所得群體中的多數成員與起始基因相比與共有序列顯示更高的序列同源性。在一 些實施方案中，所述序列編碼一種或多種目的蛋白。在備選實施方案中，所述蛋白質具有不 同的生物功能。在一些優選的實施方案中，引入序列包含至少一個選擇性標誌物。該序列 可以編碼一種或多種目的蛋白。它可以具有其他的生物學功能。在許多情況下，引入序列 可包括選擇性標誌物，例如產生對抗生素抗性的基因。
[0141] 術語"修飾序列"和"修飾基因"在本文中可互換使用，指包含天然核酸序列的缺 失、插入或中斷的序列。在一些優選的實施方案中，修飾序列的表達產物是截短的蛋白質 (例如，如果修飾是序列的缺失或中斷的話）。在一些特別優選的實施方案中，所述截短的 蛋白質保留生物活性。在備選實施方案中，修飾序列的表達產物是延長的蛋白質（例如，包 含核酸序列中的插入的修飾）。在一些實施方案中，插入導致截短的蛋白質（例如，當插入 導致形成終止密碼子時）。因此，插入可產生截短蛋白或延長的蛋白作為表達產物。
[0142] 如本文中使用的，術語"突變序列"和"突變基因"可互換使用，指在宿主細胞的野 生型序列的至少一個密碼子處含有改變的序列。突變序列的表達產物是相對於野生型含有 改變的胺基酸序列的蛋白質。表達產物可具有改變的功能能力（例如增強的酶活性）。
[0143] 術語"誘變引物"或"誘變寡核苷酸"（在本文中可互換使用）意在表示對應於模 板序列的一部分並能與其雜交的寡核苷酸組合物。就誘變引物而言，該引物可以不與模板 核酸精確匹配，引物中的錯配用於將期望的突變引入核酸文庫中。如本文中使用的，"非誘 變引物"或"非誘變寡核苷酸"指與模板核酸精確匹配的寡核苷酸組合物。在本發明的一個 實施方案中，僅使用誘變引物。在本發明的另一優選實施方案中，將引物設計成使得對於至 少一個包含誘變引物的區域而言，寡核苷酸混合物中還包括了非誘變引物。通過加入誘變 引物和對應於至少一個誘變引物的非誘變引物的混合物，有可能產生存在多種組合誘變模 式的核酸文庫。例如，如果期望突變核酸文庫中的一些成員在某些位置保留其前體序列，而 其他成員在這些位點處是突變的，則非誘變引物提供了在核酸文庫中對於給定殘基獲得特 定水平的非突變體成員的能力。本發明的方法利用誘變及非誘變寡核苷酸，它們一般長度 為約10至50個鹼基，更優選長度為約15至45個鹼基。然而，可能有必要使用小於約10 個鹼基或大於約50個鹼基的引物來獲得期望的誘變結果。對於相應的誘變及非誘變引物 而言，相應的寡核苷酸不一定長度相同，而是在對應於待加入的突變的區域中有重疊。可以 根據本發明以預定的比例加入引物。例如，如果期望所得的文庫含有顯著水平的某特定突 變以及相同或不同位點處較少量的不同突變，則通過調節所添加引物的量，有可能產生期 望的偏好文庫。或者，通過加入更少或更多量的非誘變引物，有可能調整突變核酸文庫中產 生相應突變的頻率。
[0144] 如本文中使用的，術語"連續突變"指存在於同一寡核苷酸引物中的突變。例如， 連續突變可彼此毗鄰或接近，然而，它們將通過同一引物引入所得的突變體模板核酸中。
[0145] 如本文中使用的，術語"不連續突變"指存在於不同寡核苷酸引物中的突變。例如， 不連續突變將通過分別製備的寡核苷酸引物引入所得的突變體模板核酸中。
[0146] 術語"野生型序列"或"野生型基因"在本文中可互換使用，指宿主細胞中天然或 天然存在的序列。在一些實施方案中，野生型序列指作為蛋白質改造計劃的起點的目的序 列。野生型序列可編碼同源或異源的蛋白質。同源蛋白是宿主細胞無需幹預即產生的蛋白 質。異源蛋白是宿主細胞沒有幹預將不產生的蛋白質。
[0147] 如本文中使用的，術語"抗體"指免疫球蛋白。抗體包括但不限於直接得自期望產 生抗體的任何物種的免疫球蛋白。此外，本發明涵蓋了修飾的抗體。該術語還指保留與完整 抗體所結合表位結合的能力的抗體片段，並包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、抗獨 特型（抗ID)抗體。抗體片段包括但不限於互補性決定區（CDR)、單鏈片段可變區（scFv)、 重鏈可變區（VH)、輕鏈可變區（VL)。多克隆抗體和單克隆抗體也包括在本發明之內。優選 地，所述抗體為單克隆抗體。
[0148] 如本文中使用的，短語"底物特異性的改變"指酶的底物特異性的變化。在一些實 施方案中，底物特異性的變化定義為由於酶的突變或反應條件的改變而導致的，針對特定 的底物的k Mt和/或Km的變化。通過比較使用不同底物時表現出的催化效率來確定酶的底 物特異性。這類確定可特別的用於評估突變酶的效率，因其一般預期產生針對目的底物，表 現出更大比例的k Mt/Km的變體酶。然而，本發明並非意在限於任何特定的底物組合物或底 物特異性。
[0149] 如本文中使用的，"表面特性"用於指代蛋白質表面表現出來的靜電電荷以及特 性，例如疏水性和親水性。
[0150] 如本文中使用的，短語"獨立的選自......"意指選自所指代的馬庫什組的所述部 分或元素可以與下列例子所示的元素相同、不同或者是其任意的混合物：
[0151] 具有3個R基團的分子，其中每個R基團獨立的選自基團A、B和C。在此，R基團 可以是 AAA、BBB、CCC、AAB、AAC、BBA、BBC、CCA、CCB 或 ABC。
[0152] 指代化學組合物時，本文使用的術語"取代"意指應用所述術語的有機組合物或基 團是：
[0153] (a)通過消除至少一個元素或基團而產生不飽和的；或
[0154] (b)化合物或基團中的至少一個氫原子被含有一個或多個（i)碳、（ii)氧、（iii) 硫、（iv)氮或（V)滷素原子的部分替換；或
[0155] (c) (a)和（b)。
[0156] 只含碳和氫原子的、可以如上文（b)中所述替換氫的部分是碳氫化合物部分，包 括但不限於烷基、烯基、炔基、亞烴基、環烷基、苯基、烷基苯基、萘基、蒽基、菲基、氟基、類 固醇基團，及這類基團相互之間以及與多價碳氫化合物基團的組合，例如亞烴基、亞烷基和 alkylidyne基團。可如上文（b)中所述替換氫的含有氧原子的部分包括但不限於含有羥 基、醯基或酮基、醚、環氧、羧基和酯的基團。可如上文（b)中所述替換氫的含有硫原子的 部分包括但不限於含硫的酸和酸酯基團、硫醚基團、巰基基團和硫酮基團。可如上文（b) 中所述替換氫的含有氮原子的部分包括但不限於氨基基團、硝基基團、偶氮基團、銨基基 團、醯胺基團、疊氮基團、異氰酸基團、氰酸基團和腈基基團。可如上文（b)中所述替換氫 的含有滷素原子的部分包括但不限於氯、溴、氟、碘基團，和任意前述部分，其中氫或懸掛的 (pendant)燒基被滷素基團取代，形成穩定的取代部分。
[0157] 可以理解，任意上述部分（b) (i)至（b) (V)都可以彼此取代，以單價取代或通過丟 失氫的多價取代的形式，形成另一種單價部分，所述部分可以替換有機化合物或基團中的 氫。
[0158] 術語"氧化穩定的"指本發明的蛋白酶，其在蛋白水解、水解、清潔或其他本發明過 程中常見條件（如暴露於或接觸漂白劑或氧化劑）下保持一段時間後保留特定的酶活性 量。在一些實施方案中，蛋白酶在接觸漂白劑或氧化劑一段時間（例如，至少約1分鐘、約 3分鐘、約5分鐘、約8分鐘、約12分鐘、約16分鐘、約20分鐘，等）後保留至少約50%、約 60%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 92%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98% 或約99%的蛋白水解活性。在一些實施方案中，如實施例所述測定穩定性。
[0159] 術語"螯合劑穩定的"指本發明的蛋白酶，其在蛋白水解、水解、清潔或其他本發明 過程中常見條件（如，暴露於或接觸螯合劑）下保持給定的一段時間後保留指定的酶活性 量。在一些實施方案中，蛋白酶在接觸螯合劑給定的一段時間（例如，至少約10分鐘、約20 分鐘、約40分鐘、約60分鐘、約100分鐘等）後保留至少約50 %、約60 %、約70 %、約75 %、 約80%、約85%、約90%、約92%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的蛋白水解 活性。在一些實施方案，如實施例所述測定螯合劑穩定性。
[0160] 術語"熱穩定的"和"熱穩定"指本發明的蛋白酶，其在蛋白水解、水解、清潔或其他 本發明過程中常見條件（如暴露於改變的溫度）下暴露於指定溫度一段時間後，保留指定 的酶活性量。改變的溫度包括升高或降低的溫度。在一些實施方案中，蛋白酶在暴露於改 變的溫度一段時間（例如，至少約60分鐘、約120分鐘、約180分鐘、約240分鐘、約300分 鍾，等）後保留至少約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約92%、 約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %的蛋白水解活性。在一些實施方案中，如實施例 所述測定熱穩定性。
[0161] 術語"增強的穩定性"在氧化、螯合劑、熱和/或pH穩定性蛋白酶的情況中，指與 其他絲氨酸蛋白酶（例如，枯草桿菌蛋白酶）和/或野生型酶相比，隨著時間的流逝而保留 的蛋白水解活性更高。
[0162] 術語"降低的穩定性"在氧化、螯合劑、熱和/或pH穩定性蛋白酶的情況中，指與 其他絲氨酸蛋白酶（例如，枯草桿菌蛋白酶）和/或野生型酶相比，隨著時間的流逝而保留 的蛋白水解活性更低。
[0163] 術語"清潔活性"指蛋白酶在蛋白水解、水解、清潔或本發明的其他過程中常見的 條件下獲得的清潔性能。在一些實施方案中，通過應用多種涉及酶敏感性汙漬（例如，草、 血、乳或卵蛋白質）的清潔測定來確定清潔性能，通過將汙漬置於標準洗滌條件後進行多 種層析、分光光度或其他定量方法進行測定。示例性測定法包括但不限於WO 99/34011和 美國專利6, 605, 458(均併入本文作為參考）中所述的測定，以及實施例中包括的那些方 法。
[0164] 術語蛋白酶的"清潔有效量"指在特定的清潔組合物中，實現期望的酶活性水平的 上述蛋白酶的量。這樣的有效量易於為本領域技術人員所確定，並取決於許多因素，例如所 使用的具體蛋白酶、清潔應用、清潔組合物的具體組成，以及需要液體組合物還是乾燥（例 如，顆粒、條形）組合物等。
[0165] 本文使用的術語"清潔附加材料"意指為理想的清潔組合物的具體類型和產品形 式（例如，液體、顆粒、粉末、條形、糊狀、噴霧、片劑、凝膠；或泡沫組合物）而選擇的任何液 體、固體或氣體材料，所述材料還優選地與該組合物中所使用的蛋白酶相容。在一些實施方 案中，顆粒組合物為"緻密"形式，而在另一些實施方案中，液體組合物為"濃縮"形式。
[0166] 術語"增強的性能"在清潔活性的情況中指對某些酶敏感性汙漬，例如卵、乳、草或 血，增加的或更高的清潔活性，通過標準洗滌循環和/或多個洗滌循環後的常用評估來確 定。
[0167] 術語"減弱的性能"在清潔活性的情況中指對某些酶敏感性汙漬，例如卵、乳、草或 血，減少的或更低的清潔活性，通過標準洗滌循環後的常用評估來確定。
[0168] 術語"相當的性能"在清潔活性的情況中指比較的或參照蛋白酶（例如，市售 的蛋白酶）的清潔活性的至少約60%，至少約70%，至少約80%，至少約90%，至少 約95 %，所述蛋白酶包括但不限於0PTIMASE?蛋白酶（Genencor)、PURAFECT?蛋白酶產 品（Genencor)、SAVINASE?蛋白酶（Novozymes)、BPN'變體（見例如，美國專利申請號 Re34, 606)、RELASE?、DURAZYME?、EVERLASE?、KANNASE? 蛋白酶（Novozymes)、MAXACAL?、 MAXAPEM?、PROPERASE?蛋白酶（Genencor ;還參見美國專利申請號Re34, 606,和美國專利號 5, 700, 676、5, 955, 340、6, 312, 936和6, 482, 628)，以及遲緩芽孢桿菌變體蛋白酶產品（例 如，TO 92/21760、W0 95/23221和/或WO 97/07770中所述）。可通過將本發明蛋白酶與上 述枯草桿菌蛋白酶在多種清潔測定中進行比較，來確定清潔性能，所述清潔測定涉及酶敏 感性汙漬（如草、血或乳），在標準洗滌循環條件後通過分光光度法或分析性方法來測定。
[0169] 如本文使用的，"清潔組合物"和"清潔配方"指可用於從待清潔的物品上去除不理 想的化合物的組合物，所述物品例如織物、餐具、隱形眼鏡、其他固體物質、頭髮（香波）、皮 膚（香皂和乳霜）、牙齒（漱口水、牙膏）等。術語涵蓋了為理想的清潔組合物的具體類型 和產品形式（例如，液體、凝膠、顆粒或噴霧組合物）而選擇的任何材料/化合物，只要所述 組合物與組合物中使用的蛋白酶和其他的酶相容。通過考慮待清潔的表面、物品或織物，以 及在使用過程中用於清潔條件的組合物的理想形式，可以方便的確定清潔組合物材料的具 體選擇。
[0170] 該術語進一步指適合清潔、漂白、消毒和/或滅菌任何對象和/或表面的任何組合 物。術語意在包括但不限於去垢劑組合物（例如，液體和/或固體的衣物去垢劑和精細織 物去垢劑；硬表面清潔配方、如用於玻璃、木頭、陶瓷和金屬櫃檯頂部和窗戶；地毯清潔劑； 烤箱清潔劑；織物清新劑（freshener);織物軟化劑；和織物和衣物去漬劑（pre-spotter)， 以及餐具去垢劑）。
[0171] 實際上，除非另外指出，本文使用的術語"清潔組合物"包括顆粒或粉末狀形式的 全用途或重垢型洗滌劑，特別是清潔去垢劑；液體、凝膠或糊狀形式的全用途洗滌劑，特別 是所謂的重垢型液體（HDL)類型；液體的精細織物去垢劑；手洗餐具洗滌劑或輕垢型餐具 洗滌劑，特別是高泡類型的；機洗餐具洗滌劑，包括用於家務和機構用途的各種片劑、顆粒、 液體和清洗輔助型；液體清潔和消毒劑，包括抗菌的手洗類型、清潔條、漱口水、牙齒清潔 齊IJ、車用香波、地毯香波、浴室清潔劑；洗髮香波和/或用於人和其他動物的毛髮洗劑；沐浴 凝膠和泡沫浴液和金屬清潔劑；以及清潔助劑，如漂白添加劑和"去汙棒"或預處理類型。
[0172] 本文使用的"衣物去垢劑"包括手洗和機洗洗衣去垢劑組合物，包括洗衣添加組合 物和適用於浸泡和/或預處理汙損織物（例如，衣物、亞麻和其他紡織材料）的組合物。
[0173] 本文使用的"非衣物去垢劑"包括非紡織（即織物）表面清潔組合物，包括但不限 於洗碗去垢劑組合物、口腔清潔組合物、牙齒清潔組合物和個人清潔組合物。
[0174] 本文使用的術語"去垢劑組合物"和"去垢劑配方"用於指代預期用於洗滌基質中 進行汙染對象清潔的混合物。在優選的實施方案中，術語用於指代用於清潔餐具、刀叉等的 去垢劑（例如，"餐具去垢劑"或"洗碗去垢劑"）。本發明並非意在限於任何特定的去垢劑 配方或組合物。實際上，術語意在除含有至少一種本發明的蛋白酶的去垢劑外，涵蓋了含有 表面活性劑、轉移酶、水解酶、氧化還原酶、增潔劑（builder)、漂白劑、漂白活化劑、上藍劑 和螢光染料、結塊抑制劑、掩蔽劑、酶激活劑、抗氧化劑和助溶劑的去垢劑。
[0175] 本文使用的"洗碗組合物"指用於清潔餐具（包括刀叉）的所有類型的組合物，包 括但不限於顆粒的和液體的形式。在一些實施方案中，洗碗組合物是可用於自動化洗碗機 的"自動化洗碗"組合物。本發明並非意在限於任何特定類型或餐具的組合物。實際上，本 發明可用於清潔任意材料的餐具（例如，餐具，包括但不限於盤子、杯子、玻璃杯、碗等）和 刀叉（例如，用具（utensil),包括但不限於勺子、刀、叉子、上菜用具（serving utensil) 等），所述材料包括但不限於陶瓷、塑料、金屬、瓷、玻璃、丙烯酸樹脂等。本文使用的術語"餐 具"指代碗碟和刀叉。
[0176] 本文使用的術語"漂白"指對材料（例如，織物、衣物、紙漿等）或表面處理足夠長 的時間，並且在適當的PH和溫度條件下產生材料的增亮（即，增白）和/或清潔。適合漂 白的化學品的實例包括但不限於C10 2、H2O2、過氧酸、NO2，等。
[0177] 本文使用的變體蛋白酶的"洗滌性能"指變體蛋白酶對洗滌的貢獻，即為沒有向組 合物中添加變體蛋白酶的去垢劑提供額外的清潔性能。洗滌性能是在相關的洗滌條件下進 行比較的。
[0178] 本文使用的術語"相關的洗滌條件"表示在餐具或洗衣去垢劑市場分類的家庭實 際使用中的條件，特別是洗漆溫度、時間、洗漆機械、泡沫濃度（sud concentration)、去垢 劑類型和水硬度。
[0179] 術語"改善的洗滌性能"用於表示相對於相應的野生型或起始親本蛋白酶，在相關 的洗滌條件下的去漬中獲得的更好的最終結果，或者基於重量，獲得相同的最終結果需要 較少的變體蛋白酶。
[0180] 本文使用的術語"消毒"指從表面去除汙染物，以及抑制或殺死物品表面的微生 物。本發明並非意在限於任何特定的表面、物品或待去除的汙染物或微生物。
[0181] 本文清潔組合物的"緻密"形式最好通過密度來反映，對組合物而言，通過無機填 充鹽的量來反映。無機填充鹽是粉末形式去垢劑組合物的常規成分。在常規去垢劑組合物 中，填充鹽以顯著的量存在，一般按總組合物的重量計，佔約17%至約35%。相比，在緻密 組合物中，存在的填充鹽的量不超過總組合物的約15 %。在一些實施方案中，按組合物的重 量計，填充鹽存在的量不超過約10%，或更優選不超過約5%。在一些實施方案中，無機填 充鹽選自鹼金屬和鹼土金屬的硫酸鹽和鹽酸鹽。在一些實施方案中，優選的填充鹽是硫酸 鈉。
[0182] 清潔糹目合物
[0183] 除非另外提出，本文提供的所有組分或組合物水平都參照所述組分或組合物的活 性水平來製備，並且排除可能存在於市售來源中的雜質，例如殘餘的溶劑或副產物。酶組分 重量是基於總活性蛋白的。除非另外指出，按重量計算所有的百分比和比例。除非另外指 出，基於總組合物計算所有的百分比和比例。在示例性的去垢劑組合物中，按總組合物的重 量計，通過純酶表示酶水平，並且除非另外說明，按總組合物的重量表示去垢劑成分。
[0184] 如本文所示，在一些實施方案中，本發明的清潔組合物進一步包含附加材料，包括 但不限於表面活性劑、增潔劑、漂白劑、漂白活化劑、漂白催化劑、其他的酶、酶穩定體系、 螯合劑、光學增亮劑、汙垢釋放聚合物、染料轉移劑、分散劑、抑泡劑、染料、香料、著色劑、 填充鹽、助水溶物Oiydrotrope)、光活化劑、螢光劑、織物軟化劑、可水解的表面活性劑、防 腐劑、抗氧化劑、抗縮水劑、抗皺劑、殺菌劑、殺真菌劑、色粒（color speckle)、銀護理劑 (silvercare)、抗晦暗劑（anti-tarnish)和/或抗腐蝕劑、鹼度源、助溶劑、載體、加工助 齊[J、色素和 PH 控制劑（見例如，美國專利號 6, 610, 642、6, 605, 458、5, 705, 464、5, 710, 115、 5, 698, 504、5, 695, 679、5, 686, 014和5, 646, 101，均通過引用併入本文中）。下文詳細示例 了具體的清潔組合物材料的實施方案。在清潔組合物中的清潔附加材料與本發明的變體蛋 白酶不相容的實施方案中，使用合適的方法保持清潔附加材料和蛋白酶分離（即，彼此不 接觸）直到兩種組分的結合恰當之時。此類分離方法包括本領域已知的任何合適的方法 (例如，軟膠囊（gelcap)、封裝、片劑、物理分離等）。
[0185] 本發明的清潔組合物有利的用於例如洗衣應用、硬表面清潔、洗碗應用，以及化妝 應用如假牙、牙齒、頭髮和皮膚。此外，由於在低溫溶液中效率增加的獨特優勢，本發明的酶 理想地適用於洗衣應用。此外,本發明的酶可用於顆粒的和液體的組合物中。
[0186] 本發明的變體蛋白酶還可用於清潔性添加產物中。在一些實施方案中，可使用低 溫溶液清潔應用。在一些實施方案中，本發明提供了包括至少一種本發明的酶的清潔性添 加產物，所述產物理想地適合包括在需要額外的漂白效果的洗滌過程中。此類例子包括但 不限於低溫溶液清潔應用。在一些實施方案中，添加產物的最簡單的形式是一種或多種蛋 白酶。在一些實施方案中，添加產物是包裝成劑量形式，用於向清潔過程添加。在一些實施 方案中，添加產物是包裝成劑量形式，用於向清潔過程添加，在所述過程中使用了過氧化物 源，並且增加漂白效果是理想的。本發明可使用任何合適的單劑量形式，包括但不限於丸 齊IJ、片劑、軟膠囊或其他的單劑量單位，如預測量的粉末或液體。在一些實施方案中，包括了 填充劑或載體材料，以增加此類組合物的體積。此類填充劑或載體材料包括但不限於硫酸、 碳酸和矽酸的各種鹽類，以及雲母、粘土等。用於液體組合物的合適的填充劑或載體材料包 括但不限於水或低分子量的伯醇和仲醇，包括多元醇和二醇。此類醇的實例包括但不限於 甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇。在一些實施方案中，組合物含有從約5%至約90%的此類材料。 酸性填充劑可用於降低pH。可選的，在一些實施方案中，清潔性添加物包括輔助成分，如下 文詳述。
[0187] 本發明的清潔組合物和清潔添加物需要有效量的至少一種本文提供的蛋白酶變 體，單獨的或與其他蛋白酶和/或額外的酶組合。所需的酶水平是通過添加一種或多種本 發明的蛋白酶變體實現的。本發明一般包含至少約〇. 0001重量百分比，從約〇. 0001至約 10,從約0. 001至約1，或者甚至從約0. 01至約0. 1重量百分比的至少一種本發明的變體蛋 白酶。
[0188] 本文的清潔組合物一般配製成在用於含水清潔操作的過程中，使得洗滌水將具有 從約5. 0至約11. 5,或者甚至從約7. 5至約10. 5的pH。液體產物配方一般配製成具有從 約3. 0至約9. 0,或者甚至從約3至約5的pH。顆粒狀的洗衣產物一般配製成具有從約9 至約11的pH。用於控制pH在推薦使用水平的技術包括使用緩衝液、鹼、酸等，且是本領域 技術人員普遍已知的。
[0189] 合適的低pH清潔組合物一般具有從約3至約5的淨pH，且一般不含在此類pH環 境下水解的表面活性劑。此類表面活性劑包括烷基磺酸鈉表面活性劑，其包含至少一種環 氧乙烷部分，或者甚至從約1至約16摩爾的環氧乙烷。此類清潔組合物一般包含有效量 的pH修飾劑，如氫氧化鈉、單乙醇胺或鹽酸，以提供此類清潔組合物具有從約3至約5的淨 pH。此類組合物一般包含至少一種酸穩定的酶。在一些實施方案中，組合物是液體的，而在 其他的實施方案中，是固體的。一般以淨PH測量此類液體組合物的pH。以所述組合物的 10%固體溶液來測量此類固體組合物的PH，其中溶劑是蒸餾水。在這類實施方案中，除非另 外指出，所有的PH測量都在20°C下進行。
[0190] 在一些實施方案中，當在顆粒狀的組合物或液體中使用變體蛋白酶時，所述變體 蛋白酶理想地是封裝的顆粒形式，以在儲存過程中保護變體蛋白酶離開顆粒組合物的其他 組分。此外，封裝也是控制變體蛋白酶在清潔過程中的可利用度的手段。在一些實施方案 中，封裝增強了變體蛋白酶和/或其他酶的性能。鑑於這一點，用本領域已知的任何合適 的封裝材料將本發明的變體蛋白酶封裝。在一些實施方案中，封裝材料一般封裝了至少一 部分本發明的變體蛋白酶催化劑。一般的，封裝材料是可溶於水的和/或可分散於水中 的。在一些實施方案中，封裝材料具有0°C或更高的玻璃態轉變溫度（Tg)。玻璃態轉變溫 度更詳細的描述在WO 97/11151中。封裝材料一般選自糖類、天然的或合成的樹膠、幾丁 質、殼聚糖、纖維素和纖維素衍生物、矽酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、聚乙烯醇、聚乙二醇、石錯，及 其組合物。當封裝材料是糖類時，它一般選自單糖、寡糖、多糖，及其組合物。在一些典型 的實施方案中，封裝材料是澱粉（見例如，EP 0 922 499 ;US 4, 977, 252 ;US 5, 354, 559和 US 5, 935, 826)。在一些實施方案中，封裝材料是由塑料製造的微球，如熱塑性塑料、丙烯 腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物；可使用的市售微球包括但不限於由 EXPANCEL? (Stockviksverken,瑞士）供應的，和 PM 6545、PM 6550、PM 7220、PM 7228, EXTENDOSPHERES?, LUXSIL?, Q>CHL·和 spjjEMCEL· (PQ Corp. 、Valley Forge、PA)。
[0191] 如本文所述，本發明的變體蛋白酶可特別用於清潔工業，包括但不限於洗衣和洗 碗去垢劑。這類應用將酶置於各種環境壓力下。由於在各種條件下的穩定性，本發明的變 體蛋白酶提供了超過許多目前使用的酶的優點。
[0192] 實際上，參與洗滌的蛋白酶暴露於多種洗滌條件下，包括變化的去垢劑配方、洗滌 水體積、洗滌水溫度和洗滌時間長度。此外，用於不同的地理區域的去垢劑配方在洗滌水中 存在的相關組分具有不同的濃度。例如，歐洲去垢劑一般在洗滌水中具有約4500-5000ppm 的去垢劑組分，而日本去垢劑一般在洗滌水中具有約667ppm的去垢劑組分。在北美，特別 是在美國，去垢劑一般一般在洗滌水中具有約975ppm的去垢劑組分。
[0193] 低去垢劑濃度系統包括去垢劑，其中洗滌水中存在低於約SOOppm的去垢劑組分。 日本去垢劑通常被認為是低去垢劑濃度系統，因為它們通常在洗滌水中存在約667ppm的 去垢劑組分。
[0194] 中去垢劑濃度系統包括去垢劑，其中洗滌水中存在在約800ppm至約2000ppm之間 的去垢劑組分。北美去垢劑通常被認為是低去垢劑濃度系統，因為它們通常在洗滌水中存 在約975ppm的去垢劑組分。巴西通常在洗漆水中存在約1500ppm的去垢劑組分。
[0195] 高去垢劑濃度系統包括去垢劑，其中洗滌水中存在高於約2000ppm的去垢劑 組分。歐洲去垢劑通常被認為是高去垢劑濃度系統，因為它們通常在洗滌水中含有約 4500-5000ppm的去垢劑組分。
[0196] 拉丁美洲去垢劑一般是高泡磷酸增潔劑去垢劑，拉丁美洲使用的去垢劑範圍可落 入中和高去垢劑濃度中，因為它們在洗滌水中含有1500ppm至6000ppm的去垢劑組分。如 上所述，巴西一般在洗滌水中存在約1500ppm的去垢劑組分。然而，其他高泡磷酸增潔劑去 垢劑地區（不僅限於其他拉丁美洲國家）可能具有在洗滌水中含有高達約6000ppm去垢劑 組分的高去垢劑濃度系統。
[0197] 鑑於以上內容，很顯然，典型洗滌溶液中的去垢劑組合物濃度在世界範圍內從低 於約800ppm去垢劑組合物（"低去垢劑濃度地區"，例如日本的約667ppm)，到約800ppm至 約2000ppm( "中去垢劑濃度地區"，例如美國的約975ppm和巴西的約1500ppm)到高於約 2000ppm("高去垢劑濃度地區"，例如歐洲的約4500ppm至約5000ppm，以及高泡磷酸增潔劑 地區的約6000ppm)不等。
[0198] 根據經驗確定典型洗滌溶液的濃度。例如，在美國，典型洗衣機容納約64. 4L體積 的洗滌溶液。因此，為了獲得洗滌溶液中約975ppm的去垢劑濃度，必須向約64. 4L洗滌溶 液中加入約62. 79g去垢劑組合物。該量是消費者使用隨去垢劑所提供的量杯衡量的加入 洗滌水中的典型量。
[0199] 作為進一步的實例，不同地區使用不同的洗滌溫度。日本的洗滌水的溫度一般低 於歐洲所使用的。例如，北美和日本的洗滌水溫度一般在約10°c和約30°C之間（例如，約 20°C )，而歐洲洗滌水的溫度一般在約30°C和約60°C之間（例如，約40°C )。然而，為了節省 能源，許多消費者轉為使用冷水洗滌。此外，在其他一些地區，一般使用冷水進行洗衣和洗 碗應用。在一些實施方案中，本發明的"冷水洗滌"在從約KTC至約40°C，或者從約20°C至 約30°C，或者從約15°C至約25°C的溫度下，以及落入約15°C至約35°C和落入KTC至40°C 的範圍內的所有其他組合，進行洗滌。
[0200] 作為進一步的實例，不同的地區一般具有不同的水硬度。水硬度一般通過每加侖 混合的Ca 2+/Mg2+的格令（grain)數來描述。硬度是水中鈣（Ca2+)和鎂（Mg 2+)量的度量。美 國的多數水是硬的，但硬度不同。中等硬度水（60_120ppm)至硬水（121-181ppm)具有60 至181ppm(ppm轉換為格令/美制加侖為：ppm數除以17. 1等于格令/加侖）的硬度礦物 質（見表13-1)。
[0201]

【權利要求】
1. 芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋 白酶變體是具有蛋白水解活性的成熟形態，並且在3個或多個位置上包含取代，所述位置 選自：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30,31，32,33,34, 35, 36,37,38,39,40,41，42, 43,44,45,46,47,48,49, 50,51，52， 53,54, 55, 56,57,58,59,60,61，62, 63,64,65,66,67,68,69, 71，72,73,74, 75,76,77, 78， 79,80,81，82,83, 84, 85,86,87,88,89,90, 91，92,93,94, 95,96,97, 98,99,100,101，102， 103,104,105,106,107,108,109,110,111，112,113,114,115,116,117,118,119,120,121， 122,123,124,125,126,127,128,129,130,131，132,133,134,135,136,137,138,139,140， 141，142,143,144,145,146,147,148,149,150,151，152,153,154,155,156,157,158,159， 160,161，162,163,164,165,166,167,169,170,171，172,173,174,175,176,177,178,179， 180,181，182,183,184,185,186,187,188,189,190,191，192,193,194,195,196,197,198， 199,200,201，202,203,204, 205,206, 207, 208, 209, 210, 211，212, 213, 214, 215,216,217， 218,219,220,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231，232,233,234,235,236,237， 238, 239, 240, 241，242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251，252, 253, 254, 255,256， 257,258,259,260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274 和 275,其中所述位置對照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的氨 基酸序列編號。
2. 權利要求1的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所 述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的成熟形態，並且在3個或多個位置上包含取 代，所述位置選自：1、3、4、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29,30,31，33,35,36,38, 40,43,44, 45,46,47,48, 49,50,51，52,53,54, 55, 56,57,59， 61，62, 68,69, 72, 73, 76, 78,84,86,87,88,89,90,91，92,93, 94,95, 96,97,98,99,100,101， 102,103,104,105,106,107,108,109,110,111，112,114,115,116,117,118,119,120,121， 122,124,126,128,129,130,131，132,133,134,135,136,137,139,140,141，142,143,144， 145,146,147,148,149,150,151，152,156,158,159,160,165,166,167,170,171，172,173， 174,175,176,177,180,182,183,184,185,186,187,188,191，194,195,198,199,203,204， 206, 209, 210, 211，212, 213, 215, 216, 217, 218, 222, 223, 224, 227, 228, 230, 231，232,233， 234,235,236,237,238,239,240,241，242,243,244,245,246,247,248,249、250、251、252、 253、255、256、258、259、260、261、262、265、267、268、269、270、271、272、273、274 和 275，其 中所述位置對照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序 列編號。
3. 權利要求1的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋 白水解活性的成熟形態，並且在3個或多個位置上包含取代，所述位置選自：1、2、3、4, 5, 7， 8, 9,10,11，12,13,14,15,16,17,18,19, 20,21，22,23, 24, 25,26, 27,28, 29,30, 31，33, 35， 36,38, 39,40,41，42,43,44, 45, 46,47,48,49,50,51，52, 53,54, 55,56,57,59,60, 61，62， 63,66, 68,69,71，72,73,74, 75,76,77, 78,79,81，82,83, 84, 85,86,87,88,89,90, 91，92， 93,94,95,96,97,98,99,100,101，102,103,104,105,106,107,108,109,110,111，112,114， 115,116,117,118,119,120,121，122,123,124,125,126,127,128,129,130,131，132,133， 134,135,136,137,138,139,140,141，142,143,144,145,146,147,148,149,150,151，152， 153,156,158,159,160,165,166,167,169,170,171，172,173,174,175,176,177,178,179， 180,181，182,183,184,185,186,187,188,191，192,194,195,196,197,198,199,200,203， 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211，212, 213, 214, 215,216,217,218,220,222,223,224， 225,226,227,228,229,230,231，232,233,234,235,236,237,238,239,240,241，242,243， 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251，252, 253, 254, 255,256,257,258,259,260,261，262， 263、264、265、267、268、269、270、271、272、273、274和 275，其中所述位置對照SEQIDN0:1 所不的解澱粉芽抱桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的氣基酸序列編號。
4.權利要求1的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述在3個或多個位置上的取代選 自：X001A、X001C、X001E、X001F、X001G、X001H、X001I、X001K、X001L、X001N，X001P，X001Q， X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004G, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005I, X005M, X005P, X005Q, X005S, X005T, X005W, X005Y, X006A, X006D, X006E, X006M, X006W, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007P, X007Q, X007S, X007T, X008A, X008F, X008G, X008I, X008L, X008M, X008Q, X008T, X008V, X008W, X008Y, X009A, X009C, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010F, X010G, X010H, X010I, X010K, X010L, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010V, X010W, X010Y, X011A, X011C, X011D, X011G, X011I, X011M, X011R, X011S, X011T, X011V, X011Y, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012P, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X012Y, X013A, X013G, X013I, X013M, X0130, X013T, X013V, X014A, X014C, X014D, X014E, X014F, X014G, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016D, X016E, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016R, X016S, X016T, X016V, X017A, X017D, X017E, X017F, X017G, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017T, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018I, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019P, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021R, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022K, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022R, X022S, X022T, X022V, X022W, X022Y, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025H, X025K, X025L, X025M, X025N, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026I, X026L, X026M, X026N, X026P, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027I, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027V, X027W, X027Y, X028A, X028E, X028G, X028H, X028I, X028L, X028M, X028N, X028P, X028S, X028V, X028Y, X029A, X029C, X029G, X029I, X029K, X029S, X029T, X029V, X030A, X030C, X030D, X030E, X030F, X030G, X030L, X030M, X030Q, X030S, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031T, X031V, 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X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249R, X249S, X249T, X249V, X249W, X249Y, X250A, X250C, X250E, X250F, X250G, X250H, X250I, X250L, X250M, X250N, X250Q, X250S, X250V, X250Y, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251P, X251Q, X251R, X251S, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252P, X252R, X252S, X252V, X252W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X253F, X253G, X253H, X253I, X253K, X253M, X253R, X253S, X253T, X253V, X253W, X254A, X254C, X254D, X254E, X254G, X254N, X254P, X254S, X254T, X254V, X255A, X255C, X255D, X255E, X255F, X255H, X255I, X255L, X255N, X255P, X255Q, X255R, X255S, X255T, X255V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256R, X256S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X257A, X257C, X257E, X257F, X257G, X257H, X257I, X257K, X257L, X257M, X257P, X257S, X257T, X257V, X257W, X257Y, X258A, X258C, X258D, X258E, X258F, X258G, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, X260Y, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262P, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263A, X263C, X263D, X263F, X263G, X263H, X263I, X263K, X263L, X263M, X263N, X263P, X263Q, X263R, X263W, X263Y, X264A, X264C, X264E, X264F, X264G, X264H, X264I, X264L, X264P, X264Q, X264S, X264T, X264V, X264Y, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265I, X265K, X265L, X265M, X265N, X265P, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265V, X265W, X265Y, X266G, X266W, X266Y, X267A, X267C, X267D, X267E, X267F, X267G, X267H, X267I, X267K, X267L, X267M, X267N, X267S, X267T, X267V, X267Y, X268A, X268D, X268E, X268G, X268H, X268K, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268R, X268S, X268V, X268W, X268Y, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270E, X270F, X270G, X270H, X270I, X270L, X270M, X270N, X270P, X270Q, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273K, X273L, X273R, X273S, X273T, X273V, X273W, X273Y, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274K, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H、X275K、X275L、 X275M、X275P、X275Q、X275R、X275V 和 X275W，其中所述位置對照 SEQ ID NO :1 所示的解澱 粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。
5. 分離的枯草桿菌蛋白酶變體，所述變體在選自BMI測定、蛋黃微樣品測定和/或 AAPF活性測定的至少一種測定中具有大於1的性能指數，以及在LAS穩定性或TCA測定中 具有大於〇. 8的性能指數，其中所述變體在1個或多個位置上包含至少一個取代，所述位 置選自：1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13,14,15,16,17,18,19,20,21，22,23,24,25,26,27， 28,29,30, 31，33,35,36,38,39,40, 41，42,43,44, 45,46,47, 48,49,50,51，52,53,54, 55， 56,57,59, 60,61，62,63,66,68,69, 71，72,73,74, 75,76,77, 78,79,81，82,83,84, 85, 86， 87,88,89,90,91，92,93,94, 95,96,97,98, 99,100,101，102,103,104,105,106,107,108， 109,110,111，112,114,115,116,117,118,119,120,121，122,123,124,125,126,127,128， 129,130,131，132,133,134,135,136,137,138,139,140,141，142,143,144,145,146,147， 148,149,150,151，152,153,156,158,159,160,165,166,167,169,170,171，172,173,174， 175,176,177,178,179,180,181，182,183,184,185,186,187,188,191，192,194,195,196， 197,198,199,200,203,204, 205,206, 207, 208, 209, 210, 211，212, 213, 214, 215, 216, 217， 218,220,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231，232,233,234,235,236,237,238， 239,240, 241，242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250,251，252,253,254, 255,256,257， 258,259,260,261，262,263,264,265,267,268、269、270、271、272、273、274 和 275,其中所 述位置對照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編 號。
6. 分離的枯草桿菌蛋白酶變體，所述變體在選自BMI測定、蛋黃微樣品測定和/或 AAPF活性測定的至少一種測定中具有大於0. 8的性能指數，以及在LAS穩定性或TCA測定 中具有大於〇. 8的性能指數，其中所述變體在1個或多個位置上包含至少一個取代，所述位 置選自：1、3、4、8、9、10、11、12、13、15、16,17,18,19, 20, 21，22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30， 31，33,35,36,38,40,43,44, 45,46, 47,48,49,50,51，52,53, 54, 55,56,57,59,61，62, 68， 69,72,73,76,78,84,86,87,88,89,90,91，92,93,94,95,96,97,98,99,100,101，102,103， 104,105,106,107,108,109,110,111，112,114,115,116,117,118,119,120,121，122,124， 126,128,129,130,131，132,133,134,135,136,137,139,140,141，142,143,144,145,146， 147,148,149,150,151，152,156,158,159,160,165,166,167,170,171，172,173,174,175， 176,177,180,182,183,184,185,186,187,188,191，194,195,198,199, 203, 204, 206, 209， 210,211，212,213,215,216,217,218,222,223,224,227,228,230,231，232,233,234,235， 236, 237, 238, 239, 240, 241，242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251，252, 253, 255， 256,258,259,260,261，262、265、267、268、269、270、271、272、273、274 和 275,其中所述位 置對照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。
7. 權利要求5的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述分離的變體在選自BMI測定、蛋 黃微樣品測定和/或AAPF活性測定的至少一種測定中具有大於1的性能指數，以及在LAS/ EDTA穩定性或TCA測定中具有大於0. 8的性能指數，其中所述變體包含至少3個取代，所述 取代選自：X001A、X001C，X001E，X001F，X001G，X001H，X001I，X001K，X001L，X001N，X001Q， XOOIR, XOOIS, XOOIT, XOOIV, XOOIY, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005P, X005Q, X005S, X005T, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007S, X007T, X008A, X008F, X008I, X008L, X008M, X008T, X008V, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, XOIOA, XOIOC, XOIOG, XOIOH, XOIOK, XOIOM, XOION, XOIOQ, XOIOR, XOIOS, XOIOT, XOIOW, X011A, X011I, X011M, X011S, X011V, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X013A, X013G, X013I, X013T, X013V, X014A, X014D, X014E, X014F, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016S, X016T, X016V, X017A, X017F, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021R, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022K, X022L, X022M, X022N, 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X242W, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243K, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243R, X243S, X243T, X243V, X243W, X244A, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244P, X244Q, X244R, X244S, X244T, X244V, X244W, X244Y, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245R, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246E, X246F, X246G, X246H, X246I, X246L, X246M, X246N, X246Q, X246S, X246T, X246V, X246W, X246Y, X247A, X247C, X247D, X247E, X247F, X247G, X247H, X247I, X247K, X247L, X247M, X247N, X247P, X247Q, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248K, X248L, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248W, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249R, X249S, X249T, X249V, X249W, X249Y, X250A, X250C, X250F, X250I, X250L, X250M, X250Q, X250S, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X253F, X253G, X253H, X253I, X253K, X253M, X253R, X253S, X253T, X253V, X253W, X254A, X254C, X254G, X254S, X254T, X255A, X255C, X255D, X255E, X255F, X255H, X255I, X255L, X255N, X255P, X255Q, X255R, X255S, X255T, X255V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256R, X256S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X257C, X257F, X257I, X257K, X257L, X257M, X257V, X258A, X258C, X258D, X258E, X258F, X258G, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, X260Y, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263C, X263F, X263L, X263Y, X264A, X264G, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265K, X265M, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265W, X265Y, X267G, X267I, X267L, X267M, X267N, X267V, X268A, X268G, X268H, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268S, X268V, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270G, X270I, X270L, X270M, X270N, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273L, X273S, X273T, X273V, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q，X275R，X275V和X275W，其中所述位置對照SEQIDN0:1所示的解澱粉芽孢桿菌的 枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。
8.權利要求6的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述變體在選自BMI測定、蛋黃微樣 品測定和/或AAPF活性測定的至少一種測定中具有大於1的性能指數，以及在LAS穩定性 和TCA測定中具有大於0. 8的性能指數，其中所述變體包含至少3個取代，所述取代選自： X001A、X001E、X001G、X001H，X001Q，X001V，X003E，X003H，X003I，X003M，X003S，X003T， X003V, X004T, X004V, X008I, X008V, X009E, X009H, X009N, X009Q, X009S, X009T, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010R, X010S, X010T, X011I, X011V, X012G, X012I, X012N, X012Q, X012S, X012T, X012V, X013A, X013G, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016N, X016P, X016S, X016T, X016V, X017H, X017I, X017M, X017N, X018A, X018C, X018D, X018E, X018G, X018H, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018S, X018T, X018V, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022T, X022V, X022W, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025K, X025L, X025M, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026M, X026N, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027W, X028A, X028I, X028L, X028M, X028V, X029A, X029C, X029G, X029S, X029V, X030A, X030C, X030L, X030M, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031V, X033C, X033M, X033S, X033T, X035I, X035L, X035M, X035P, X036A, X036E, X036S, X036T, X036V, X038C, X038F, X038H, X038I, X038K, X038L, X038M, X038N, X038Q, X038R, X038T, X038V, X038Y, X040A, X040D, X040E, X040I, X040L, X040P, X040V, X043A, X043C, X043D, X043E, X043F, X043G, X043I, X043L, X043M, X043N, X043R, X043S, X043T, X043W, 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X252S, X252V, X252W, X253A, X253E, X253H, X253M, X253S, X253T, X253W, X255A, X255C, X255D, X255E, X255I, X255L, X255N, X255Q, X255T, X255V, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256S, X256V, X256W, X256Y, X258D, X258G, X259A, X259C, X259E, X259P, X259Q, X259S, X260A, X260D, X260E, X260H, X260I, X260N, X260P, X260S, X260T, X260V, X261A, X261C, X261E, X261F, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262H, X262I, X262L, X262M, X262Q, X262T, X262V, X262Y, X265A, X265D, X265S, X267I, X267L, X268A, X268L, X268V, X269D, X269H, X269N, X269Q, X269S, X270A, X270C, X270G, X270I, X270L, X270N, X270S, X270T, X270V, X271C, X271E, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272L, X272M, X272N, X272P, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273G, X273S, X274A, X274C, X274G, X274L, X274M, X274N, X274S, X274T, X275D, X275E, X275F, X275H，X275K，X275L，X275M、X275P、X275Q和X275R，其中所述位置對照SEQIDN0 :1所示 的解澱粉芽抱桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的氣基酸序列編號。
9. 權利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體在選自18、52、 72、117、119、127、144、185、209和213的一個或多個位置上包含進一步的取代，並且其中所 述位置對照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編 號。
10. 權利要求1-9的任一項的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶 變體是GG3變體。
11. 權利要求1的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述分離的枯草桿菌蛋白酶變 體包含選自以下的取代的組合：S87N/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/ N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/ T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188S/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87R/ Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/ S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/ P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/ N248N, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87D/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/ T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248R, S87N/Q109R/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/ S188D/T213E/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/ Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/ S130A/S188R/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/ N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109R/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/ T213T/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N, S87N/Q109R/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188R/T213T/N248D, S87R/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/ Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/ S130A/S188D/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/ N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/ T213T/N248N, S87R/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188R/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D, S87N/ Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/ S130A/S188D/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, S87R/Q109D/G118R/S128L/ P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/ N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/ T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D,和 S87N/ Q109Q/G118V/S128LP129Q/S130A/S188R/T213E/N248R，其中所述位置對照 SEQ ID NO :1 所 不的解澱粉芽抱桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的氣基酸序列編號。
12.權利要求1的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述變體包含選自以下的取代的 組合：387"01090/6118￥/512817卩1290/513(^/51885八21317^248〇,387"01090/6118￥/ S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/ T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87R/Q109D/ G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/ S188D/T213E/N248R， S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D，和 S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D，其中所述位置對照 SEQ ID NO :1所不的解澱粉芽抱桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的氣基酸序列編號。
13. 權利要求1的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述變體包含選自以下的取代的 組合：S87D/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D，S87N/Q109D/G118R/ S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87D/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/ T213E/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87N/Q109Q/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188R/T213T/N248D, S87R/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/ Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D，和 S87R/Q109D/G118R/S128L/ P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R，其中所述位置對照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌 的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。
14. 權利要求1的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述變體包含選自以下的取代的 組合：A001C/S024V/1107L、A0011/R045T/1107R/A172T、A001K/A172L、A001K/A172W，A001K/ I072C/L126F, A001K/I072C/L126F/S164Q, A001K/I072C/V104I/L126F, A001K/I072C/ V104I/L126F/S164Q, A001K/I072V, A001K/I072V/L126F, A001K/I072V/L126F/S164F, A001K/I072V/V104I, A001K/I072V/V104I/L126F/S164I, A001K/I072V/V104I/S164F, A001K/I072V/V104I/S164Q, A001K/I107T/A172Q, A001K/I107V/G127Q, A001K/I107V/ G127Q/A172Q, A001K/I107V/G127R/A172Q, A001K/L126F, A001K/L126F/S164F, A001K/ L126F/S164I, A001K/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072C, A001K/R045F/I072C/L126F, A001K/R045F/I072C/V104I/S164F, A001K/R045F/I072V/L126F/S164I, A001K/R045F/ I072V/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072V/S164F, A001K/R045F/I072V/V104G/S164T, A001K/R045F/I107L/A172N, A001K/R045F/I107T, A001K/R045F/I107V/G127Q, A001K/ R045F/L126F/S164F, A001K/R045F/L126F/S164I, A001K/R045F/S164F, A001K/R045F/ V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072C/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072V/L126F, A001K/R045K/I072V/L126F/S164F, A001K/R045K/I072V/L126F/S164Q, A001K/R045K/ I072V/S164F, A001K/R045K/I072V/S164Q, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164F, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164I, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I107A/A172T, A001K/R045K/I107R/G127A/A172N, A001K/R045K/I107T/ G127R, A001K/R045K/I107T/G127R/A172Q, A001K/R045K/L126F, A001K/R045K/L126F/ S164I, A001K/R045K/L126F/S164P, A001K/R045K/L126F/S164Q, A001K/R045K/S164F, A001K/R045K/V104I/S164Q, A001K/R045K/V104L/S164A, A001K/R045N/I107T/G127Q, A001K/R045S/V104C/L126Y/S164F, A001K/S024H/I107T/G127Q, A001K/S024H/I107T/ G127R, A001K/S024H/I107V, A001K/S024H/R045N/I107T, A001K/S024H/R045N/I107T/ G127Q/A172Q, A001K/S024L/R045A, A001K/S024N/I107V/G127T, A001K/S024N/R045K/ A172Y, A001K/S024R/I107T, A001K/S024R/R045N/A172C, A001K/S024R/R045N/I107T, A001K/S024R/R045N/I107T/G127R, A001K/S024T/I107T/G127Q/A172Q, A001K/S024T/ R045N/G127Q/A172Q, A001K/S024W/I107T/G127R, A001K/S024W/I107V/G127T/A172Q, A001K/S164Q, A001K/V104E, A001K/V104I/L126F, A001K/V104I/L126F/S164I, A001K/ V104I/L126F/S164Q, A001L/I072C, A001L/R045Q/G127H/A172R, A001L/S024D/R045Y/ I107Y, A001M/R045S/I107E/A172D, A001P/A172V, A001Q/R045K/I107T, A001R/A172G, A001R/A172Q, A001R/I107T, A001R/I107T/A172Q, AOOIR/I107T/G127Q/A172Q, AOOIR/ I107V/A172Q, A001R/R045F, A001R/R045K/A172Q, A001R/R045K/G127R, A001R/R045K/ I107T/G127Q, A001R/R045K/I107V/G127R, A001R/R045N/A172K, A001R/R045N/A172Q, A001R/R045N/I107T, A001R/R045N/I107T/G127Q, A001R/R045N/I107V/A172V, AOOIR/ R045N/I107V/G127Q/A172Q, A001R/R045N/I107V/G127R, A001R/S024H/I107T, AOOIR/ S024H/R045K/I107T, A001R/S024H/R045K/I107T/A172Q, A001R/S024H/R045N/I107T/ A172Q, A001R/S024N, A001R/S024R, A001R/S024R/A172H, A001R/S024R/A172Q, AOOIR/ S024R/I107V/A172L, A001R/S024R/I107V/G127R, A001R/S024R/R045F/I107T/G127Q, A001R/S024R/R045F/I107T/G127R, A001R/S024R/R045K/I107T/G127Q, A001R/S024T/ I107T/A172Q, A001R/S024T/R045K/A172Q, A001R/S024T/R045K/I107L/G127P/A172P, A001R/S024T/R045N/I107T/A172Q, A001R/S024W/I107V/A172S, A001R/S024W/R045F/ I107V/G127Q, A001R/S024W/R045F/I107V/G127R, A001R/S024W/R045K, A001R/S024W/ R045K/I107T/A172Q, A001R/S024W/R045N/I107T, A001S/A172V, A001S/S024L/I107Y/ A172S, A001T/S024H/I107L/A172Y, AOOIV/I107L/A172I, G097P/N185Q/A215I, G097P/ Y209W/A215V/S256W, G118L/G127R/S132L, G118T/G127Q, 1107A/G127K/A172G, I107C/ A172S, I107P/A172S, I107Q/A172D, L126A/S164N, L126F/S164V, M119F/N185R, M119F/ N185R/Y209W/S256T, Ml19F/N185V/Y209W, Ml19F/S144T/N185V/S256I, M119F/S144W/ N185R/S256L, M119F/Y209W, Ml19F/Y209W/S256I, N018K/A215I, N018K/A215R, N018K/ A215V, N018K/G097P/A215I/S256W, N018K/G097P/N185K/S256W, N018K/G097P/N185K/ Y209W/A215I/S256W, N018K/G097P/N185Q/Y209W/A215V/S256W, N018K/G097P/N185R/ A215R/S256W, N018K/G097P/N185R/A215V/S256W, N018K/G097P/N185R/S256W, N018K/ G097P/N185R/Y209W, N018K/G097P/N185R/Y209W/S256W, N018K/G097P/Y209W/A215V/ S256W, N018K/N185K, N018K/N185K/A215V/S256W, N018K/N185K/S256W, N018K/N185K/ Y209W/A215R, N018K/N185Q/A215R/S256W, N018K/N185Q/A215V/S256W, N018K/N185Q/ S256W, N018K/N185Q/Y209W/S256W, N018K/N185R/A215I/S256W, N018K/N185R/A215R/ S256W, N018K/N185R/A215V, N018K/N185R/Y209W/A215V/S256W, N018K/S256W, N018Q/ G097P/N185K/A215V, N018Q/G097P/N185K/Y209W, N018Q/N185K, N018Q/N185K/S256W, N018Q/N185K/Y209W/A215I/S256W, N018Q/N185K/Y209W/A215V, N018Q/N185K/Y209W/ A215V/S256W, N018Q/N185Q/A215V, N018Q/N185Q/S256W, N018Q/N185Q/Y209W/S256W, N018Q/N185R/A215R, N018Q/N185R/S256W, N018R/G097P/N185Q/A215I, N018R/G097P/ Y209W/A215V, N018R/G097P/Y209W/S256W, N018R/N185K/A215V/S256W, N018R/N185K/ S256W, N018R/N185Q/A215V/S256W, N018R/N185Q/Y209W/S256W, N018R/N185R/A215R, N018R/N185R/S256W, N018R/N185R/Y209W/S256W, N018R/Y209W/A215V/S256W, N018R/ Y209W/S256W, N043E/S101E, N043E/S101E/N248K, N043E/S101F, N043E/S101N/N117Y, N043E/S101V, N043E/S101Y/N117I/N248K, N043E/S101Y/N117Y/N248K, N043F/N117I, N043F/S101E/N117I/N248K, N043F/S101R, N043I/N117Y, N043I/S101E/N248I, N043I/ S101F/N117Y/N248K, N043I/S101N/N117Y/N248K, N043I/S101R/N248K, N043I/S101Y/ N117I/N248I, N043I/S101Y/N117Y/N248K, N043S/N117Y/N248K, N043S/N248I, N043S/ S101E, N043S/S101E/N117I/N248I, N043S/S101E/N117Y/N248K, N043S/S101E/N248K, N043S/S101F, N043S/S101F/N248K, N043S/S101N/N1171, N043S/S101R/N117I/N248K, N043S/S101V/N117I/N248I, N043S/S101Y, N043S/S101Y/N1171, N043S/S101Y/N117Y, N043S/S101Y/N248K, N043V/N117Y/N248I, N043V/N248I, N043V/N248K, N043V/S101E/ N117I/N248K, N043V/S101E/N248I, N043V/S101F, N043V/S101F/N1171, N043V/S101F/ N117Y, N043V/S101F/N248K, N043V/S101R/N117I/N248K, N043V/S101T/N248K, N043V/ S101V/N117I, N043V/S101V/N248K, N043V/S101Y, N043V/S101Y/N117I, N043V/S101Y/ N117I/N248K, N185K/A215V, N185K/Y209W/S256W, N185Q/A215R/S256W, N185Q/S256W, N185R/S256W, N185R/Y209W/A215I, N185R/Y209W/S256W, N185V/Y209W, P052I/M119F, P052I/M119F/S144T/N185R/Y209W, P052I/M119F/S144V/Y209W, P052I/M119F/S144Y/ N185R, P052I/M119F/S144Y/N185R/Y209W/S256I, P052I/M119F/Y209W/S256I, P052I/ N185R/Y209W/S256I, P052I/N185V/Y209W, P052I/N185V/Y209W/S256I, 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S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101F/N248K, S087N/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S101N/N248K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101R/N248K, S087N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S103N/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/ N185R, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185R/S256I, S087N/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S144T/N185R/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185R/ Y209W/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185V/S256I, S087N/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S144T/N185V/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/ S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/Y209W/S256I, S087N/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S144V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185R/S256I, S087N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185R/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S144V/N185V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185V/S256I, S087N/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S144V/N185V/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/ Y209W/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/Y209W/S256T, S087N/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S144W/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185R, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185R/Y209W/S256T, S087N/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S144Y/N185V/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S164I, S087N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S164Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I, S087N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/L126F/S164F, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ V104I/L126F/S1641, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/S164I, S087N/G118V/ S128L/P129Q/S130A/V104I/S164Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W, S087N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W/A215I/S256W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ Y209W/S256W, S099H/S103I/G118N, S099K/G118R, S099K/S103N/G118T, S099K/S103P/ G118L/S132N, S099K/S103P/G127Q, S099K/S103P/S132H, S099K/S103R/G118A/S132P, S099N/S132R, S099Q/G118F/G127R, S099Q/G118T/G127Q, S099Q/S103N/G118R/S132N, S099Q/S103N/G118T, S099Q/S103N/G118T/S132H, S099Q/S103N/S132H, S099Q/S103P/ G118R, S099Q/S103P/G118R/S132N, S099Q/S103P/S132H, S099Q/S132R, S099T/G118F, S099T/G118R/S132H, S099T/G118T/S132H, S099T/G118T/S132N, S099T/S103P, S099T/ S103P/G118L/S132H, S101E/N117I, S101E/N117Y/N248K, S101F/N117I/N248I, S101F/ N117Y/N248I, S101F/N117Y/N248K, S101F/N248K, S101R/N117I/N248K, S101R/N117Y, S101R/N248K, S101T/N117Y/N248K, S101T/N248I, S101V/N248K, S101Y/N117I/N248K, S101Y/N117Y, S101Y/N248K, S103G/G118I/G127E/S132E, S103L/S132E, S103R/S132P, S144T/N185R, S144T/N185R/Y209W/S256I, S144T/N185R/Y209W/S256T, S144T/N185V, S144V/N185R/S256I, S144V/N185R/Y209W, S144V/N185R/Y209W/S256T, S144V/S256I, S144V/Y209W, S144W/N185R/Y209W/S256T, S144W/N185V/Y209W/S256I, S144W/S256I, S144Y/Y209W/S256I、V104E/L126I/S164L，其中所述位置對照 SEQ ID NO :1 所示的解澱粉 芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸序列編號。
15.權利要求1的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述變體包含選自以下的取代的 組合：丁587"6118￥/512817卩1290/513(^/5241/51011701091(、387"6118￥/512817?1290/ S130A/N18K/G97P/S101L/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/ Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/N248R, S87N/G118V/ S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109L/N185R/A215R, S87R/G118R/S128L/P129Q/ S130A/S101K/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109L, S87N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/ P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/ S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/I72V/S164I/S188D/N248R, S87N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N43S/P52V/S101R/Q109R, S87N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/I72V/S101Y/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109L/S188D/ N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I/S188D/N248R, S87N/G118V/ S128L/P129Q/S130A/N76D/S101L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/N76D/ S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/N248R, S87R/G118R/ S128L/P129Q/S130A/V118R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101M, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/N76D/G97P/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/ P129Q/S130A/I72V/S101L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/ P129Q/S130A/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/ N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/S164I, S87N/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S101Y/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109L/ S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101V/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/N18K/G97P/S101Y/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101V/ S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/I72V/S101Y/Q109L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101H/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/ P129Q/S130A/I72V/S101H/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109R/S188D/ N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109L/N185R/A215R, S87R/ G118R/S128L/P129Q/S130A/S101M/S188D/N248R, N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/ S188D, N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/N248K, S87N/G118V/G127S/S128L/ P129Q/S130A, S87N/S101H/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101K/G118V/S128L/P129Q/ S130A, S87N/S101V/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101Y/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101L/G118V/S128L/P129Q/S130A,I72V/S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A//S164I, 其中所述位置對照SEQ ID NO :1所示的解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN'的胺基酸 序列編號。
16. 編碼權利要求1-15的任一項提出的枯草桿菌蛋白酶變體的分離的核酸。
17. 包含權利要求16的核酸的表達載體。
18. 包含權利要求17的表達載體的宿主細胞。
19. 包含權利要求1-15的任一項提出的枯草桿菌蛋白酶變體的清潔組合物。
20. 權利要求19的清潔組合物，其中所述組合物包含液體的、凝膠的、片劑的、粉末的 和/或顆粒狀的去垢劑。
21. 權利要求19和/或20的清潔組合物，其中所述清潔組合物選自洗衣去垢劑和餐具 去垢劑。
22. 權利要求21的清潔組合物，其包含洗衣去垢劑。
23. 權利要求22的清潔組合物，其中所述洗衣去垢劑是重垢型去垢劑。
24. 權利要求21的清潔組合物，其包含選自手洗餐具去垢劑和自動化餐具洗滌去垢劑 的餐具去垢劑。
25. 權利要求19-24的任一項的清潔組合物，進一步包含至少一種漂白劑。
26. 權利要求19-25的任一項的清潔組合物，其中所述清潔組合物是無磷的或含磷的 去垢劑。
27. 權利要求19-26的任一項的清潔組合物，其中所述清潔組合物是冷水型去垢劑。
28. 權利要求19-27的任一項的清潔組合物，進一步包含至少一種其他的酶。
29. 權利要求28的清潔組合物，其中所述至少一種其他的酶選自半纖維素酶、纖維素 酶、過氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶、角質酶、 果膠酶、果膠裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木質酶、 支鏈澱粉酶、縣酸酶、戊聚糖酶、malanases、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨 素酶、漆酶和澱粉酶，或其混合物。
30. 清潔方法，包括提供待清潔的物品和包含權利要求19-29的任一項提出的清潔組 合物的組合物，以及在有效提供所述物品的清潔的條件下，將所述物品與所述組合物接觸。
31. 權利要求30的方法，還包括在將所述物品與所述清潔組合物接觸後，清洗所述物 品的步驟。
32. 權利要求30和/或31的方法，其中所述待清潔的物品包括餐具。
33. 權利要求30和/或31的方法，其中所述待清潔的的物品包括織物。
【文檔編號】C11D3/386GK104293751SQ201410460886
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2009年11月10日 優先權日:2008年11月11日
【發明者】W·埃赫勒, L·G·卡斯康-佩雷拉, D·A·埃斯特爾, F·齊德戈伯, J·T·小凱爾利斯, A·J·保羅斯, B·F·施密特 申請人:丹尼斯科美國公司